BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Analisa Prosedur

Escherichia coli dikultur selama 24 jam dengan suhu 37C dimedia Luria Bertani (LB) yang
berfungsi untuk memperbanyak E.coli. Kultur diambil 1 ml, dimasukkan pada microtube sehinga
dapat mempermudah saat sentrifugasi, lalu disentrifugasi 10000 rpm pada suhu 4C selama 5 menit.
Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan partikel berdasarkan berat molekulnya. Pelet ditambahkan 1
ml PBS untuk menjaga fisiologis dan viabilitas sel. Kemudian disentrifugasi kembali 10000 rpm
dengan suhu 4C selama 5 menit untuk memisahkan partikel berdasarkan berat molekul dan
memastikan E.coli bersih dari media agar lebih maksimal. Selanjutnya ditambahkan 1 ml PBS
berfungsi agar semakin terjaga fisiolofis dan viabilitas sel dan diambil 2 L + 98 L evans blue yang
berfungsi untuk mewarnai sel mati dan sel hidup. Sel mati akan berwarna biru dan sel hidup berwarna
bening atau transparan. Sel limfosit dihitung menggunakan hemositometer. Hemositometer berfungsi
untuk menghitung jumlah sel. Lalu ditentukan dosis yang akan diinjeksikan ke mencit sehingga
takaran dosis sesuai dapat dilakukan dengan cara diencerkan terlebih dahulu, lalu ditentukan dosisnya
berdasarkan hasil yang telah dihitung dan E.coli diinjeksikan ke mencit secara intraperitoneal. E.coli
sebagai antigen untuk perlakuan dan merangsang sistem imun mencit. Setelah seminggu mencit
dirawat, mencit diinjeksikan dengan booster berupa E.coli dengan dosis 106, 105, 104 dan 103 yang
berfungsi untuk menguatkan respon sistem imun dan mengoptimalkan respon sistem imun
sebelumnya telah terpapar antigen.
Mencit didislokasi untuk mematikan mencit, dibedah dan diambil organ spleen dan thymus. Organ
spleen dan thymus merupakan organ yang memiliki sel limfosit paling banyak. Organ dicuci dengan
PBS, dipindahkan ke PBS steril dan dihancurkan dengan ujung spuit berlawanan arah jarum jam. PBS
berfungsi untuk mempertahankan fisiologi dan viabilitas sel. Fungsi dihancurkan agar didapatkan sel
dengan ukuran kecil dan didapatkan suspensi sel dan harus berlawanan arah jarum jam agar sel tidak
rusak. Suspensi dipindahkan ke propilen dan ditambahkan PBS hingga 6 ml pada spleen dan 10 ml
pada thymus agar semakin terjaga fisiologi dan viabilitas selnya. Kemudian disentrifugasi 2500 rpm
suhu 10C selama 5 menit untuk memisahkan partikel berdasarkan berat molekulnya. Pelet
diresuspensi dengan PBS 1 ml. Fungsi pelet dan PBS diresuspensi agar PBS dan pelet dapat
tercampus. Suspensi sel diambil 50 L dan diletakkan pada mikrotube berisi 500 L PBS untuk dapat
dilakukan proses sentrifugasi. Lalu disentrifugasi kembali 2500 rpm, dengan suhu 10C selama 5
menit untuk memisahkan partikel berdasarkan berat molekulnya. Pelet ditambahkan 50 L larutan
antibodi ekstraseluller. Antibodi ekstraseluller berfungsi untuk markel sel yang dilabeli dengan
pewarna fluorochrom. Kemudian diinkubasi selama 20 menit dengan suhu 4C dalam kondisi gelap
yang befungsi untuk mempercepat reaksi dan menjaga fungsi larutan agar dapat berekasi, diresuspensi
dengan 300 L PBS agar dapat tercampur. Suspensi sel dimasukkan dalam kuvet dan dilakukan
analisis flowcytometry. Analisis flowcytometry digunakan untuk menghitung jumlah sel dan
memisahkan sel secara spesifik