Penentuan Kadar Protein

Penentuan kadar protein bisa dilakukan dengan metode konvensial/klasik

dan menggunakan intrumen. Penentuan kadar protein secara konvensial memiliki
prinsip penentuan kadar berdasarkan jumlah total nitrogen yang dilakukan dengan
mendestruksikan sampel menjadi larutan dan mengubah nitrogen dalam protein
menjadi ammoniak dan dirubah menjadi ammonium hidroksida sehingga dapat
dititrasi menggunakan asam. Sedangkan metode dengan instrumen ada dengan cara
mengubah nitrogen dalam protein menjadi senyawa berwarna agar bisa dianalisa
spetrofometri dan metode non destruksi menggunakan High Performance Liquid
Chromatographic. Selain itu terdapat metode mikrobiologis dapat digunakan dengan
menggunakan bakteri yang spesifik terhadap beberapa jenis asam amino.

Berdasarkan prinsip penentuan kadar protein maka dapat diklasifikasikan beberapa

metode dibawah ini :
1. Penetapan Kadar Protein secara Kjehldahl
Lebih kurang 1 gram sampel protein dimasukkan kedalam labu Kjehldahl,
tambahkan 10 g natrium sulfat anhidrat dan 20 mL asam sulfat pekat, kemudian
dipanaskan sampai cairan jernih tak berwarna, setelah didinginkan ditambahkan
air suling 200 ml dan natrium hidroksida 45% sampai bersifat basa terhadap kertas
lakmus dan didestilasi. Destilat yang mengandung ammonia ditampung dalam HCl
0,1N 100,0 ml. Destilasi dihentikan bila destilat tidak bersifat basa lagi, kelebihan
HCl dititrasi kembali dengan natrium hidroksida 0,1 N. Penetapan serupa
dilakukan terhadap blanko.

Persamaan berikut dapat digunakan untuk menentukan kadar nitrogen

dalam mg sampel menggunakan larutan HCl xM untuk titrasi.

Dimana vs dan vb adalah volume titrasi sampel dan blanko, 14g adalah berat
molekul untuk nitrogen N. Penetapan blanko biasanya dilakukan pada saat yang
sama dengan sampel untuk memperhitungkan nitrogen residual yang dapat
mempengaruhi hasil analisis. Setelah kadar nitrogen ditentukan, dikonversi
menjadi kadar protein dengan faktor konversi yang sesuai :
% Protein = F x %N.
2. Penetapan Kadar Protein dengan metode Lowry
Penentuan kadar protein dilakukan dengan metode Lowry yaitu dengan cara :
Larutan enzim sebanyak 0,3 mL ditambah 2 mL reagen Lowry C dikocok pelan
dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Campuran ditambah reagen
Lowry D dengan cepat kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
dengan sesekali dikocok. Larutan diukur absorbansinya pada gelombang optimum
BSA kemudian kadar protein ditentukan dengan regresi linier terhadap kurva
standar BSA.

3. Penetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford

a. Bahan yang digunakan adalah biakan bakteri Bacillus subtilis dan Bacillus sp.
umur 18 jam dalam larutan kaldu nutrient yang ditambahkan 1% pati tapioca
yang kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit
pada suhu 4C. diperoleh supernatant yang kemudian disebut dengan ekstrak
enzim kasar (EEK)
b. Reagen Bradford dibuat dengan cara menimbang 0.01 g coomasie brilian blue
(CBB) G-250 yang kemudian dilarutkan dalam 5 ml etanol 95% (v/v), lalu
ditambahkan 10 ml asam fosfor 85% (v/v). Campuran dihomogenkan (dikocok
kuat) lalu disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan
suhu rendah. Stok pereaksi Bradford harus diencerkan 5 kali sebelum
digunakan..
c. Larutan standar protein dibuat dengan menimbang 0,01 g BSA (bovine serum
albumin) yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml H2O steril sehingga
diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan stok dengan
konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok
 ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100
ppm. Dari larutan stok tersebut dilakukan pengukuran terhadap standar
protein terlarut dengan konsentrasi 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan
100 ppm. Kemudian dilakukan pengukuran terhadap standar protein
dengan menambahkan 0.1 ml seri larutan standar dengan 5 ml reagen
Bradford. Kemudian larutan divortex dan di inkubasi pada suhu ruang
selama 1060 menit. Larutan ini memberikan warna biru dan dibaca pada
panjang gelombang 595 nm. Dengan menggunakan regresi linear, akan
didapatkan persamaan matematik untuk larutan standar protein yang
diperoleh dari nilai absorbansi standar, yang akan digunakan pada
pengukuran kadar protein terlarut.
Pengukuran protein terlarut. Pengukuran sampel dilakukan dengan cara
menambahkan 0,1 ml ekstrak enzim kasar dengan 5 ml reagen Bradford divortex dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 1060 menit. Absorbansi Larutan sampel protein
dibaca pada panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva
standar protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan
ekstrak enzim kasar.