Determination of quinolones in wastewater by Porous -cyclodextrin polymer based

solid-phase extraction coupled with HPLC

Latar Belakang Penelitian

Antibiotik banyak digunakan dalam profilaksis dan pengobatan penyakit manusia dan
hewan, qiunolones merupakan salah satu jenis antibiotik sintesis yang memiliki aktivitas
spektrum luas terhadap bakteri gram positif dan gram negatif. Qiunolones secara luas
banyak digunakan dalam pengobatan manusia dan hewan penghasil makanan.
Mekanisme utama qiunolones dipengaruhi oleh dua enzim, DNA gyrase yang berfungsi
unuk mengedurkan DNA pada proses replikasi dan topoisomerase IV yang berfungsi
sebagai perantara dalam proses pemisahan turunan kromosom. Hal tesebut
mengakibatkan penggandaan bakteri terhambat, peningkatan resistensi antibiotik tehadap
bakteri patogen telah menjadi masalah serius, hal tersebut dikarenakan adanya
peggunaannya secara berlebih dan polusi lingkungan. Air limbah dari pabrik farmasi,
rumah sakit dan akuakultur menyebabkan polusi serius. Sementara itu, sebagian besar
kuinolon diekskresikan dalam urin atau kotoran yang terus menyebar melalui tanah dan
air, akibatnya kuinolon akan merusak kesehatan manusia melalui perantara pertanian dan
air (Skema 1). Sehingga alasan tersebutlah yang mendorong peneliti untuk
mengembangkan sebuah teknik baru dalam penentuan kuinolon dalam air limbah. Solid
Phase Extraction (SPE) akhir-akhir ini banyak digunakan karena memiliki banyak
keuntungan diantaranya pelarut yang digunakan sederhana, cepat, daan mudah
digabungkan dengan teknologi yang lainnya. Adsorben memiliki peran yang penting
dalam ekstraksi ini, diataranya yaitu: silica gel, fiber, chelating resin, activated carbon,
dan magnetic graphene oxide dan carbon nanotube. Cyclodextrins merupakan
oligisakarida sikloum yang berbentuk menyerupai torus dan dihubungkan oleh beberapa
unit -1, 4-anhydroglucopyranose yang secara simultan memiliki rongga dalam
hidrofobik dan sisi luar hidrofilik, struktur ini memungkinkan CD membentuk kompleks
dengan alifatik non-polar dan senyawa aromatik yang memiliki ikatanhidrogen,
hidrofobik, dan interaksi Van der- Waals. Beberapa material berbasis - cyclodextrins
telah dipelajari dengan menggunakan SPE dikarenakan memiliki rongga yang tepat dan
harga yang terjangkau.
- cyclodextrins memiliki kelarutan tertentu dalam air, sehingga hal tersebut membatasi
dalam bidang adsorpsi. Jadi adanya peningkatan kelarutan merupakan bagian penting
untuk cyclodextrins dengan menggunakan metode SPE. Beberapa aspek utaa yang dapat
digunakan dalam pengembangan - cyclodextrins, salah satunya yaitu dengan melarutkan
cyclodextrins ke dalam bahan lain sehingga dapat membentuk kompleks seperti pada
titanium dioksida, Fe3O4, graphene oxide, emas, quantum dots, silikon dioksida. Material
ini memiliki kelarutan dengan cyclodextrins yang rendah dan juga memiliki harga yang
tinggi, serta adanya kesulitan dalam sintesis. Metode pembentukan polimer cyclodextrins
antara lain dengan menggunakan agen cross linking, yang meliputi epiklorohidrin [25],
asam asetil, asam sitrat, kitosan, polietilen glikol, karboksimetilselulosa, N, N'-
methylenebisacrylamide, dan heksametilena diisosianat. Namun polimer ini cendrung
larut karena crosslinker yang juga larut, sehingga polimer ini cenderung digunakan
sebagai obat bius, bukan digunakan sebagai polimer untuk SPE. Penelitian terbaru
melaporkan bahwa polimer - cyclodextrins dengan cross-linker berupa gugus aromatik
padat tetrafluoroterephthalonitrile dapat membentuk pori yang permanen. Polimer ini
tidak hanya memiliki luas area yang besar, struktur mesopori, namun juga memiliki siat
unik dan persebaran pada pemukaan yang bagus, sehingga polimer ini leih unggu jika
diandingkan dengan karbon aktif. Polimer ini dapat dengan cepat menyerap berbagai
senyawa mikropolutan yang ada dalam air, konstanta laju adsorpsi untuk bisphenol A
adalah 15 sampai 200 kali lebih besar dari karbon aktif. Selain itu polimer ini memiliki
beberapa kelebihan lainnya yaitu harga yang murah, dapat dimanfaatkan kembali, dan
tidak mencemari lingkungan. Dalam penelitian ini akan digunakan metode analisis yang
efisien dengan menggunakan polimer siklodekstrin berpori (CDP) yang digunakan
sebagai sorben SPE untuk ekstraksi quinolone dalam sampel air limbah. Hasil dari
penelitian ini menunjukkan bahwa metode ini layak digunakan untukdeteksi quiolone
dalam air limbah.
Metode penyiapan polimer

Preparasi CDP
CDP disintesis berdasarkan metode yang digunakan pada penelitian sebelumnya. Urutan
prosedur ini antara lain: 100 mL serum dalam botol dialiiri dengan menggunakan gas
nitrogen selama 5 menit, kemudian ditambahkan dengan -CD (1,025 g),
Tetrafluoroterephthalonitrile (0.5 g), and K2CO3 (1.6 g). Ditambahkan campuran anhidrat
dari THF/DMF (9:1 v/v, 40 mL), kemudian vial dialiri dengan menggnakan gas nitrogen
dengan tambahan waktu selamaa 5 menit dan ditempatkan dalam magnetic stiring
thermostatic oil bath (85oC, 500 rpm selama 2 hari). Selanjutnya suspensi disaring dan
K2CO3 dinetralkan dengan menggunakan 1M HCl. Setelah dilakukan sentrifugasi
padatan berwarna kuning cerah dan kemudian diaktivasi dengan melakukan perendama
n dalam H2O (2 x 10 mL) selama 15 menit, THF (2 x 10 mL) selama 30 menit dan CH2Cl2
(1 x 15 mL) selama 15 menit. Produk dari prosedur ini kemudian dikeringkan.

Preparasi sampel
Larutan induk standar fleroxacin, norfloksasin, siprofloksasin, dan gatifloksasin pada
konsentrasi 1000 g mL1 telah dipreparasi dalam metanol, kemudian diencerkan sesuai
dengan konsentrasi yang diinginkan. Sesuai dengan mililiter dari larutan induk fleroxacin,
norfloksasin, siprofloksasin, dan gatifloksasin , selanjutnya dilakukan spike pada sampel.
Konsentrasi dari sampel yang akan digunakan kemudian dipreparasi dengan
menggunakan 2.5, 0.5, dan 0,1 g mL1 dari masing-masing obat quinolone. Limbah
diperoleh dari Rumah Sakit China Pharmaceutical University dan kemudian disaring
menggunakan membran ultrafiltrat.

SPE berbasis CDP

Prosedur SPE dengan menggunakan CDP memungkinkan adanya pre-konsentrasi daari
analit dalam sample air limbah menggunakan metode sentrifugasi. Pertama, 8 mg dari
CDP ditambahkan ke dalam tabung sentrifugasi dengan 20 mL sampel yang dipilih.
Campuran kemudian divortex selama 1 menit dalam oscillator untuk meratakan dispersi.
Selanjutnya camuran dikocok selama 1 jam untuk mendapatkan kesetimbangan desorpsi.
Sentrifugasi dilakukan pada 13.000 rpm selama 10 menit. Setelah menghilangkan
supernatan, residu kemudian dikeringkan dengan menggunakan gas N2. Selanjutnya 0.5
mL reagen desorpsi CAN-1%HAc (6:4) ditambahkan ke dalam tabung sentrifugasi.
Setelah 20 menit dilakukan ultrasonifikasi, dilakukan penentuan dan dicuci, kemudian
dilakukan sentrifugasi untuk pemisahan. Suspensi dikeringkan dengan menggunakan gas
N2. Setelah dire-disssolve dengan MeOH, larutan disaring dengan menggunakan
Whatman 0.2 m inorganic membrane filter. Filtrat diukur dengan menggunakan HPLC.
Penelitian ini dilakukan secara duplikat/ triplikat.

Analisis sampel menggunakan HPLC- UV

Campuran larutan yang mengandung norfloxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin pada

konsentrasi 200 g mL1 diencerkan menjadi larutan kerja standar yang berbeda-beda
dengan rentang (0.1200 g mL1). Luas puncak dari masing-masing senyawa diukur
menggunakan HPLC. Empat kurva standar dibuat dengan cara melakukan plot antara luas
puncak dan nilai konsentrasi dari masing-masing senyawa. Kemudian konsentrasi larutan
sampel dihitung dengan cara melihat luas puncak dari larutan sampel. Fasa gerak yang
merupakan metanol-0.025 M larutan phosphoric acid (20:80, V/V, pH= 3.2) dan laju alir
sebesar 1 mL min -1. Suhu kolom sebesar 40oC. Volume yang diinjekkan sebesar 20 L
dan kemudian dianalisis lebih lanjut menggunakan HPLC yang dilengkapi dengan
detektor DAD pada panjang gelombang 285 nm.

Optimalisasi kondisi ekstraksi

Faktor variabel yang mempengaruhi proses adsorpsi dan desorpsi juga dipelajari dalam
penelitian ini, dan digunakan beberapa parameter seperti jumlah adsorben yang
digunakan (rentang antara 4- 20 mg), komposisi eluen (aseton, metanol, etanol,
asetonitril-1% asam asetat), jumlah desorpsi (rentang antara 0.5 hingga 2.5 mL) telah
dioptimasi. Ketika satu parameter dirubah, parameter lainnya tetap dijaga pada nilai
optimalnya.
Hasil Penelitian

1. Karakterisasi

Gambar 1 A merupakan hasil NMR yang menunjukkan bahwa ada sinya pada 73,26 ppm
dan 103,9 pp yang menunjukkan C3 dan C1 dalam CD. Sinyal pada 163.9 ppm
berkorelasi degan atom C yang terhubung dengan F pada tetrafluoroterephthalonitrile.
Resonansi pada 97.42 ppm berkorelasi pada gugus alkoksi dan 142.67 ppm merupakan
karbon aromatik. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa telah berhasil disintesis.

Gambar 1B menunjukkan spektra IR dari CDP yang mengindikasikan bahwa CDP telah
berhasil disintesis. Karakteristik peaknya yaitu -CN pada panjang gelombang 2250 cm-
1
. Terdapat peak yang lemah pada 1268 cm-1 yang menunjukkan adanya stretching dari
C-F yang dapat digambarkan bahwa F tidak sepenuhnya tersubtitusi. Adanya serapan
adsorpsi pada 1463 cm-1 menunjukkan adaanya aromatik C-C. O-H teramati pada daerah
dekat 3330 cm-1 alifatik C-H pada daerah 2933 cm-1 dan intensitas C-O pada 1033 cm-1.

Pemilihan pH awal

Nilai pH dari larutan sampel memiliki peran peting dalam proses ekstraksi dengan cara
menentukan keadaan analit apakah berada dalam keadaan ionik atau dalam keadaan
molekulnya, serta sifat permukaan material absorben. Dalam penelitian ini, pengaruh pH
diteliti dengan rentang pH 2-10.

Gambar 2A menunjukkan bahwa pada pH 4 semua quinolone berada pada kapasitas

adsorpsi yang optimum jika dibandingkan dengan pH yang lainnya. pH 10 menunjukkan
bahwa kapasitas adsorpsi semua quinolone berada dalam keadaa yang paling rendah. Hal
tersebut dikarenakan adanya ikatan cyclodextrin dan quinolone, utamanya merupakan
interaksi hidrofobik. antibiotik quinolone merupakan senyawa amfoter yang memiliki dua
pKa. Ketika quinolone berada dalam keadaan molekul, maka quinolone ini cocok dengan
rongga cyclodextrin yang nonpolar. Dalam pH yang asam, molekul quinolone merupakan
bentuk kation dan prortonasi hidroksida dari cyclodextrin menurunkan interaksi antara
cyclodextrin dan quinolon. Dalam kondisi alkali, quinolone memiliki muatan negatif dan
hidroksida dari cyclodextrin mengalami ionisasi membentuk ion alkoksi dengan muatan
yang negatif, gaya tolakan elektrostatik rendah.
Kurva Adsorpsi kinetika CDP

Kurva adsorpsi kinetika dari CDP pada quinolone yang berbeda ditampilkan dalam
gambar 2B. selama 20 menit pertama, laju adsorpsi meningkat secara cepat dan
kesetimbangan dicapai pada saat menit ke-50. Persamaan pseudo-first-order digunakan
untuk menjelaskan adsorpsi ini, kapasitan kesetimbangan adsorpsi (qe) dari fleroxacin,
ciproxacin, gatifloxacin, dan norfloxacin yaitu 27.56, 48.50, 47.38, dan 30.09 g mg1
yang lebih rendah jika dibandingkan dengan jumlah Q dari kesetimbangan adsorpsi
(69.94, 137.29, 87.75 and 80.30 g mg1), nilai R2 dari penelitian ini yaitu 0.9988,
0.9974, 0.9986 dan 0.9998, menunjukkan bahwa memiiki tingkat korelasi yang tinggi
(Tabel 1), dan penerapannya merupakan chemisorpsi.

Optimisasi kondisi SPE

Untuk mengevaluasi sifat CDP sebagai sorben SPE untuk ekstraksi quinolone, parameter
variabel yang mempengaruhi efisiensi ekstraksi termasuk jumlah CDP, eluen, dan jumlah
adsorpsi serta waktu desorpsi. Ketika salah satu parameter diubah, maka parameter
lainnya tetap dijaga pada nilai optimalnya.

Pengaruh jumlah adsorben yang digunakan

Selama proses ekstraksi, jumlah CDP meupakan salah satu faktor yang penting. Luas
permukan adsorben yang spesifik dan kemampuan sisi adsorpsi yang lebih meningkat
dengan meningkatnya jumlah adsorben. Dengan meningkatna jumlah adsorben dalam
bentuk derajatnya, jika total konsentrasi adsorbat konstan dalam sistem ini, maka
peningkatan yang lebih dari jumlah adsorben maka akan menurunkan jumlah adsorpsi per
satuan luas. Perbedaan jumlah adsorben yang digunakan adalah 4 hingga 20 mg. seperti
pada gambar 3A, ketika jumlah adsorben sebesar 4 mg, quinolone yag berbedaa memiliki
recovery yang berbeda pula, dan semua data menunjukkan lebih dari 86%. Pada saat 8
mg, semua recovery quinolone mencapai 94%. Jadi dalam penelitian ini digunakan 8 g
CDP karena memiliki recovery yang maksimal.

Pengaruh kondisi desorpsi

Desorpsi quinolone dari CDP diteliti untuk mengetahui adanya perbedaan pelarut organik
yang digunakan seperti aseton metanol, etanol, dan acetontrile-1% acetic acid (6:4)
(CAN-HAC). Berdasarkan gambar 3B maka dapat dilihat bahwa kemampuan desorpsi
dari asetonitril mengandung 1% asam asetat lebih baik jika dibandingkan dengan pelarut
lainnya. Gambar 3C menunjukkan bahwa sebanyak 1.15 mL merupakan jumlah yang
digunakan pada proses desorpsi yang efektif. Pengaruh dari waktu desorpsi dari 5 menit
hingga 25 menit pada recovery dari analit terlihat pada gambar 3D, ketika waktu
desorpsinya 5 menit, recovery desorpsi lebih dari 50%, dan setelah 20 menit , telah
mencapai titik kesetimbangan.

Aplikasi dan Kinerja Analitik

Untuk mengukur akurasi dan kemudahan dari metode yang dikembangkan, parameter
kuantitatif metode, seperti rentang linier, korelasi, koefisien, limit deteksi, limit
kuantitasi, dan recovery telah dievaluasi.

Linearitas, LOD, dan LOQ

Linearitas dari analit dipelajari dengan menggunakan sampel air bersih. Semua penelitian
yang dilakukan secara paralel dilakukan pengulangan sebanyak 3 kali. Limit deteksi
(LOD) dari senyawa merupakan konsentrasi terendah yang ditentukan dengan cara
perbandingan antara sinyal dan pengganggu dengan rasio = 3 dan nilai LOQ diperoleh
dengan cara perbandingan antara sinyal dan pengganggu = 10. Rentang linier, koefisien
korelasi (R2) daan LOD ditampilkan dalam tabel 3. Hasil menunjukkan bahwa rentang
linier 25-5000 ng/ mL. Semua analit menunjukkan liniearitas yang bags dengan koefisien
regresi yang memuaskan (R2 = 0.9994). limit deteksi (LOD) untuk fleroxacin,
ciprofloxacin, gatifloxacin, norfloxacin adalah 2.67, 3.17, 4.75 dan 5.50 ng mL1.

Presisi dan Akurasi

Recovery dari metode ini divalidasi dengan menggunakan metode standar adisi. Tabel 4
memberikan informasi tentang perhitungan recovery setalah dilakukan spiking sebanyak
3 kali pada konsentrasi yang berbeda (konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi) dari analit.
Recovery merupakan nilai rata-rata dari 3 sampel yang telah ditentukan. Recovery berada
pada rentang 95.4799.20%, 96.09101.86%, 98.01101.89% dan 96.43103.3% untuk
forfleroxacin, ciprofloxacin, gatifloxacin dan norfloxacin, dengan standar deviasi sebesar
0.81% dan 4.44%. hasil ini menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan mmeiliki
akurasi dan presisi yang bagus.

Keabsahan
Keabsahan dari metode ini ditentukan dengan menggunakan larutan pada 2500 ng mL-1
dengan cara mengubah beberapa kondisi seperti rasio fasa gerak, laju alir, suhu oven, dan
pH fasa gerak. Hasilnya ditunjukkan pada tabel 5, perbedaan yang dapat diabaikan dalam
hal ini adalah parameter, %RSD dari peak yang kuran dari 6.7. Hasil penelitian juga
menunjukkan bahwa adanya indikasi yang bagus selama pemakaian normal. Hal ini
menunjukkan performa yang bagus dari metode analitik yang dikembangkan.

Analisis sampel
Untuk melakukan validasi metode yang dikembangkan untuk analalisis fleroxacin,
ciprofloxacin, gatifloksasin dan norfloksasin dalam sampel air limbah, maka recovery
metode ini divalidasi dengan menggunakan metode standar adisi. Standar pembanding
telah ditambahkan ke dalam 3 konsentrasi yang berbeda (konsentrasi rendah, sedang, dan
tinggi) dengan 5 kali percobaan pada masing-masing konsentrasi. Semua penelitian ini
dilakukan pengulangan 3 kali dan hasilnya ditunjukkan pada tabel 6. Berdasarkan tabel,
dapat dilihat bahwa rentang recover adalah 96.43% hingga 101.95% untuk 4 target analit.
Tujuan metode ini adalah untuk analisis sampel air limbah. Kromatogram ditunjukkan
pada gambar 4. Berdasarkan gambar dapat dilihat bahwa tidak ada interferen/
pengganggu dalam sampel air limbah. Hasil juga menunjukkan bahwa tujuan metode ini
didasarkan pada CDP, dan memiliki spesifitas yang bagus dalam penentuan fleroxacin,
ciprofloxacin, gatifloksasin dan norfloksasin.

Perbandingan dari metode yang berbeda untuk ekstraksi quinolone

Konsentrasi quinolone (ng L-1) dalam air sangat rendah, maka HPLC-UV yang memiliki
limit deteksi dalam mikro gram per liter sulit digunakan dalam deteksi ini. Quinolone
dalam sampel air lingkugan dapat dideteksi dengan menggunakan HPLC yang
dikombinasikan dengan MS atau tandem MS ataau deteksi fluresens. Meskipun
kombinasi memiliki detektor yang sensitif, SPE merupakan langkah yang penting.
Penggunaan cartridge komersial, seperti kolom Oasis, HLS cartridge dan Bondensil C18
cartridge, namun hal ini memiliki kekurangan dianataranya yatu biaya yang tinngi, waktu
yang lebih panjang dalam analisis, recovery yang rendah, gangguan serta kondisi pH
asam kuat. Jika dibandingkan dengan metode yang lain, maka metode ini memiliki
beberapa kelenihan, diantaranya efisiensi ekstraksi, harga murah, limit deteksi rendah,
recovery yang bagus, dan rentang konsentrasi linier yang lebar.

Kesimpulan

Dalam penelitian ini, metode dengan menggunakan polimer cclodextrin berpori dibentuk
sebagai ekstraksi untuk mendeteksi 4 macam quinolone. Melalui serangkaian evaluasi
untuk adsorpsi, efisiensi ekstraksi yang lebih tinggi, deteksi limit yang rendah, recoveri
yang bagus, dan rentang linier yang besar. Metode ini menggunakan SPE (Solid Phase
Extraction) dan HPLC-DAD yang berhaasil diterapkan untuk deteksi quinolone dalam air
limbah dengan konsentrasi yang sangat keci. Reagen dan material yang digunakan dalam
penelitian ini menggunakan bahan-bahan yang murah dan ramah lingkungan.