Teknik Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi DNA rekombinan meliputi beberapa teknik, yaitu :

1. Teknik untuk mengisolasi DNA
Isolasi DNA yang diawali dengan melakukan perusakan serta penghilangan dinding
sel. Dalam proses ini dapat dilakukan secara mekanis ataupun dengan cara enzimatis. Setelah
perusakan sel telah dilakukan, langkah selanjutnya adalah pelisisan sel hal ini dapat
dilakukan dengan menggunakan buffer nonosmotik, serta deterjen yang kuat seperti triton X-
100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Remukan sel yang diakibatkan oleh lisisnya sel
dibuang dengan melakukan sentrifugasi sehingga bias dibedakan antara bagian yang rusak
serta organel target yang pada akhirnya didapatlkan DNA yang nantinya dilakukan
pemurnian dengan penambahan amonium asetat dan alcohol.

2. Teknik untuk memotong DNA

Pemotongan DNA dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease. Pemutusan
ini dilakukan di dalam strain tertentu yang bertujuan untuk mencegah agar tidak merusak
DNA. Selain itu strain tersebut juga mempunyai suatu system modifikasi yang menyebabkan
pemutusan basa pada urutan tertentu yang merupakan recognition sites bagi enzim restriksi
tersebut. Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor dengan menggunakan enzim restriksi
ini harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel dalam arti setiap fragmen
DNAnya harus dapat disambungkan dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.

3. Teknik untuk menggabungkan atau menyambungkan DNA

Tahap penyambungan DNA terdapat beberapa cara, yaitu penyambungan dengan
menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri, penyambungan dengan menggunakan DNA
ligase dari sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau sering disebut dengan
enzim T4 ligase. Serta dengan pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk
menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan
diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

4. Teknik untuk memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel hidup

Analisa terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor serta analisis
hasil ligasi molekul molekul DNA dengan menggunakan teknik elektroforesis. Hasil dari
penyambungan ini dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat.
Dalam hal ini pada campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga
 ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain.
Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan transformasi.
Sehingga diharapkan sel inang mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul
DNA rekombinan.

5. Seleksi transforman dan seleksi rekombinan

DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka
kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA
rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan
masih harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa
fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen
yang diinginkan dilakukan dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak
(probe), yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi
polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).
Rekombinasi memiliki tiga mekanisme dasar dalam menjalani prosesnya yaitu:
1. Transformasi merupakan transfer DNA telanjang yang umumnya berasal dari satu sel bakteri
ke dalam sel yang berbeda. Prosesnya adalah ketika sebuah sel bakteri pecah atau lisis maka
DNA sirkular akan terlepas ke lingkungan. Efisiensi transformasi bergantung pada
kompetensi sel.
2. Konjugasi merupakan pemindahan materi genetik berupa plasmid secara langsung melalui
kontak sel dengan membentuk struktur seperti jembatan diantara dua sel bakteri yang
berdekatan. Umumnya terjadi pada bakteri gram negatif.
3. Transduksi merupakan transfer materi genetik dari satu bakteri ke bakteri lainnya dengan
menggunakan virus bakteri sebagai vektor. Transfer ini menggunakan prinsip dasar dari galur
donor yang menyediakan DNA bagi galur resipien. Perbedaan utamanya dengan transfer
DNA lainnya adalah DNA ditransfer melalui perantaraan bakteriofag.