PENDAHULUAN
analisis yang digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara
kuantitatif dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya.
pemeriksaan visual dengan studi lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh
disusunlah makalah ini untuk memepelajari dan memahami lebih lanjut tentang
1
3. Bagaimana prinsip kerja dari spektrofotometer?
4. Bagaimana jenis–jenis spektrofotometer serta penggunaannya pada laboratorium
klinik?
1.3 Tujuan
1. untuk mengetahui pengertian dari spektrofotometer.
2. untuk mengetahui bagian atau komponen dari spektrofotometer.
3. untuk mengetahui prinsip kerja dari spektrofotometer.
4. untuk mengetahui jenis–jenis spektrofotometer serta penggunaannya pada
laboratorium klinik.
2
BAB II
PEMBAHASAN
2.1 Spektrofotometer
Gambar 1. Spektrofotometer
Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika
energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah
panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan
alat pengurai seperti prisma, grating ataupun celah optis. Pada fotometer filter, sinar
dengan panjang gelombang yang diinginkan diperoleh dengan berbagai filter dari
berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang
tertentu. Pada fotometer filter, tidak mungkin diperoleh panjang gelombang yang
benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang gelombang 30-40 nm.
Sedangkan pada spektrofotometer, panjang gelombang yang benar-benar terseleksi
dapat diperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu
spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu,
3
monokromator, sel pengabsorpsi untuk larutan sampel atau blangko dan suatu alat
untuk mengukur perbedaan absorpsi antara sampel dan blangko ataupun pembanding
(Khopkar SM,1990).
Apabila sinar putih menyinari benda atau medium yang tembus sinar,
misalnya kaca berwarna atau larutan berwarna, maka benda tersebut meneruskan
hanya sebagian saja dari berbagai warna (berbagai panjang gelombang), sedang
warna-warna lainnya diserap sehingga benda tersebut tampak berwarna. Warna yang
tampak itu adalah warna yang diteruskan oleh benda tersebut. Jika benda yang
tidak tembus sinar menyerap sebagian dari warna-warna spektrum sinar putih
yang menyinarinya dan memantulkan warna-warna yang lain, maka benda tidak
4
tembus sinar itu akan tampak bewarna. Warna yang tampak adalah warna
(panjang gelombang sinar putih) yang dipantulkan oleh benda tersebut.Warna
yang dipantulkan ini disebut warna komplementer dari warna yang diserap oleh
benda. Warna dan warna komplementernya merupakan pasangan dari setiap dua
warna spectrum, yang menghasilkan sinar putih bila keduanya dicampurkan.
Tabel 1. Hubungan antara warna pada sinar tampak dengan panjang gelombang
A = ε. b . c atau A = abc
dimana, A = absorbansi (no units) ε = tetapan serapan(L/mole-cm)
5
2.2.3 Absorbsi Cahaya
Absorbsi cahaya mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-
elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan
tereksitasi berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai
cahaya atau tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi untuk transisi elektron
seharusnya tampak pada panjang gelombang diskrit sebagai suatu spectrum garis
atau peak tajam namun ternyata berbeda. Transisi elektronik dapat terjadi dari
subtingkat apa saja dari keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi.
Karena berbagi transisi ini berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang
absorpsinya juga berbeda sedikit dan menimbulkan pita lebar yang tampak dalam
spektrum itu.
Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada
konsentrasi, tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang
gelombang radiasi. Satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c
dalam molar (M) maka absorptivitas disebut dengan absorptivitas molar dan
disimbolkan dengan ε dengan satuan M -1
cm-1 atau liter.mol-1cm-1. Jika c dinyatakan
dalam persen berat/volume (g/100mL) maka absorptivitas dapat ditulis dengan
E1%1cmA1%1cm. Jumlah relatif panjang gelombang cahaya yang terabsopsi ketika melewati
sampel tergantung pada :
- Jarak yang ditempuh sinar ketika melewati sampel
(ukuran kuvet -b)
- Jumlah senyawa kimia dalam sampel yang mengabsopsi
sinar (konsentrasi analit –c)
- Kemepuan sampel mengabsopsi sinar (molar
absorptivity -e)
Jumlah relatif cahaya yang melewati sample (I/Io) dikenal dengan istilah
transmitan (T) :
6
2.2 Komponen Spektrofotometri
Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran
radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk
daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar
dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l) adalah 350 – 2200 nanometer (nm).
Monokromator
Monokromator berfungsi sebagai alat untuk memecah radiasi
polikromatis dengan pita energi yang lebar yang dihasilkan sumber radiasi menjadi
radiasi dengan pita energi yang lebih sempit atau menjadi radiasi monokromatis.
7
Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat
contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars,
plexigalass, kaca, plastik dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan
tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass,
sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV.
Semua macam cuvet dapat dipakai untuk pengukuran di daerah sinar tampak
(visible).
Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada
berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik
yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk
atau angka digital. Dengan kata lain detector mengabsorpsi foton yang
menumbuknya dan mengubahnya menjadi kuantitas yang dapat diukur seperti arus
listrik atau perubahan suhu. Sebagian besar detektor modern mengubah energi foton
menjadi sinyal listrik yang segera mengaktifkan meteran/recorder.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk
menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.
Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan
membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut
transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T) sehingga bisa
dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.
- Operasi single-beam dan double-beam
1. Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan
mengukur absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument
mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi
8
biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Radiasi dari monokromator yang
masuk didispersikan oleh prisma/ grating. Ketika alat pendispersi dirotasikan,
berbagai pita radiasi yang telah terpecah difokuskan pada celah keluar. Radiasi
dilewatkan sampel dan diterima detektor. Beberapa instrumen menghasilkan single-
beam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang
gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800
sampai 1000 nm.
9
antara sinar polikromatis dan objek. Interaksi ini mengakibatkan panjang gelombang
yang tidak terabsorbansi dipantulkan ke mata.
Cahaya/sinar tampak terdiri dari suatu bagian sempit kisaran panjang
gelombang dari radiasi elektromagnetik dimana mata manusia sensitif. Radiasi dari
panjang gelombang yang berbeda ini dirasakan oleh mata sebagai warna yang
berbeda, sedangkan campuran dari semua panjang gelombang tampak seperti sinar
putih. Sinar putih memiliki panjang gelombang mencakup 400-760 nm.
3. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
visible yang menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan
hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang
dilengkapi dengan monokromator. Spektrum absorpsi dalam daerah-daerah
ultraviolet dan sinar tampak terdiri dari satu atau beberapa pita absorpsi.
Sistem spektrofotometri UV-Vis paling banyak tersedia dan paling popular
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sampel
berwarna juga untuk sampel tak berwarna seperti senyawa organik yang berdasarkan
transisi π – π* atau η - π* dan karena itu memerlukan kromofor di dalam molekulnya.
Transisi ini terjadi dalam daerah spektrum kira–kira 200-700 nm.
10
Spektrofotometri UV-Vis melibatkan spektroskopi dari foton dalam daerah
UV-Vis, hal ini berarti menggunakan cahaya dalam daerah visible, dekat ultraviolet
(UV) dan dekat dengan kisaran inframerah (NIR). Penyerapan dalam rentang yang
terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Di wilayah
ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami transisi elektronik. Teknik
ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi berkaitan dengan transisi dari
ground state ke excitated state.
Semua molekul dapat mengabsorpsi radiasi daerah UV-Vis karena
mengandung elektron, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi.
Cahaya yang diserap oleh suatu zat berbeda dengan cahaya yang ditangkap oleh mata
manusia. Cahaya yang tampak atau cahaya yang dilihat dalam kehidupan sehari-hari
disebut warna komplementer. Misalnya suatu zat akan berwarna orange bila
menyerap warna biru dari spektrum sinar tampak dan suatu zat akan berwarna hitam
bila menyerap semua warna yang terdapat pada spektrum sinar tampak.
Alat yang digunakan dalam metode spektrofotometri menggunakan sebuah
sumber cahaya polikromatis yang dilewatkan pada sebuah monokromator prisma
dan kisi difraksi yang diposisikan secara tetap untuk menghasilkan cahaya
monokromatis. Cahaya polikromatis perlu diubah menjadi cahaya monokromatis
karena suatu larutan berwarna memerlukan warna tunggal agar penyerapan larutan
tersebut dapat maksimal (Harini dkk., 2012).
Kalibrasi spektrofotometer UV-vis penting dilakukan untuk
mengoptimalisasi performanya. Kurva yang normal memberikan hasil dengan R2
(nilai regresi) yang baik yakni membentuk model linear. Setidaknya nilainya
mendekati 1, minimal memperoleh 0,997 untuk menunjukkan keakuratan yang
maksimal (Adeeyinwo dkk., 2013).
Salah satu aplikasi penggunaan spektrofotometer UV-Vis pada laboratorium
klinik ialah pennggunaannya sebagai instrumen untuk mengukur kadar kolesterol
total dalam serum darah yang terdapat dalam jurnal penelitian Setyari, dkk. pada
tahun 2009 yang berjudul Metode Analisis Kualitatif dan Kuantitatif LDL-C
menggunakan Elektroforesisagarose Dapar Tae (Tris-Asam Asetat-Edta). Selain itu,
spektrofotometer UV-Vis juga digunakan untuk analisis kualitatif penetapan kadar
11
atau kandungan bahan aktif dalam sediaan obat, yaitu kandungan metabolit
sekundernya, misalnya kandungan flavonoid dalam tanaman obat.
Analisis kualitatif flavonoid dapat dilakukan dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis. Spektrum serapan ultra violet dan serapan tampak
merupakan cara tunggal yang paling bermanfaat untuk mengidentifikasi struktur
flavonoid. Flavonoid mengandung sistem aromatis yang terkonjugasi dan dapat
menunjukkan pita serapan kuat pada daerah UV-Vis. Metode tersebut juga dapat
digunakan untuk melakukan uji secara kuantitatif untuk menentukan jumlah
flavonoid yang terdapat dalam ekstrak metanol juga dilakukan dengan
spetrofotometer UV-Vis yaitu dengan mengukur nilai absorbansinya. Absorbansi
sebagai analisa kuantitatif dilakukan berdasarkan Hukum Lambert-Beer
(Neldawati, 2013).
12
tekanan darah serta untuk menentukan obat-obatan sintesis dari bahan alam yang
juga memiliki fungsi sebagai obat analgesik misalnya aspirin dan asetil vanilat.
BAB III
PENUTUP
A. Kesimpulan
- Spektrofotometri adalah salah satu metode dalam kimia analisis, yang umum
digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif
dan kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya.
- Komponen-komponen dalam Spektrofotometri adalah:
13
- Wadah sampel
- Sumber cahaya
- Monokromator
- Detektor
- Hukum lambert beer atau Hukum Beer, berbunyi:
“Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya)
yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi
eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”.
- Jenis-jenis Spektrometri berdasarkan cahaya adalah Visible (spektro Vis),
Spektrometri UV (ultraviolet), Spektrofotometri UV-Vis, Spektrofotometri
IR (Infra Red) sedangkan berdasrakan jenis instrumenya adalah
Spektrofotometer berkas tunggal dan Spektrofotometri berkas rangkap.
- Penerapan Spektrofometri dalam kehidupan sehari-hari adalah untuk
menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif
yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya, untuk
mengukur jumlah atau banyaknya unsur yang diteliti
B. Saran
Dengan adanya makalahini, penulis berharap agar pembaca dapat memahami
tentang spektrofotometri, jenis-jenis Spektrofotometri dan penerapan dalam
kehidupan sehari-hari.
DAFTAR PUSTAKA
Adeeyinwo, C.E., Okorie, N.N., and Idowu, G.O., 2013, Basic Calibration of UV/
Visible Spectrophotometer, International Journal of Science and Technology,
2(3): 247-251.
Harini, B.W., Dwiastuti, R., dan Wijayanti, L.W., 2012, Aplikasi Metode
Spektrofotometri Visibel Untuk Mengukur Kadar Curcuminoid Pada
Rimpang Kunyit (Curcuma Domenstica),Prosiding Seminar Nasional
Aplikasi Sains dan Teknologi (SNAST) Periode III, 3(1): 31-36.
14
Neldawati, Ratnawulan dan Gusnedi, 2013, Analisis Niali Absorbansi dalam
Penentuan Kadar Flavonoid untuk berbagai Jenis Daun Tanaman Obat,
Phillar of Physics, 2(1): 76-83.
Setyari, P. S., Wirasutha, I. G., dan Junitha, I. K., 2009, Metode Analisis Kualitatif
dan Kuantitatif LDL-C menggunakan Elektroforesisagarose Dapar Tae (Tris-
Asam Asetat-Edta), Fak MIPA Udayana, 22-30.
15