Kromatografi adalah proses pemisahan yang digunakan untuk memisahkan substansi

campuran menjadi komponen-komponennya berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi

komponen dan distribusi molekul-molekul dalam dua fasa diam (adsorben) dan fasa
bergerak (eluen).

Dengan perkataan lain prinsip dasar dalam analisa kromatografi adalah berdasarkan
pada prinsip distribusi fasa yakni suatu perpindahan komponen-komponen zat yang
dianalisa dari suatu fasa yang bergerak (eluen) menuju ke fasa lain yang diam (adsorben)
yang dilaluinya.

Eluen adalah pelarut yang dipakai dalam proses migrasi/pergerakan dalam membawa
komponen-komponen zat sampel atau fasa yang bergerak melalui fasa diam dan
membawa komponen-komponen senyawa yang akan dipisahkan.

Jenis-jenis adsorben :

1. Silika digunakan untuk memisahkan asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam le

mak, lipida, minyak esensial, anion dan kation organik, sterol, terpenoi.
2. Alumina digunakan untuk memisahkan alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-
vitamin, karoten, asam-asam amini
3. Bubuk selulosa digunakan untuk memisahkan asam-asam amino, alkaloid,
nukleotida
4. Pati digunakan untuk memisahkan asam-asam amino

Sedangkan adsorben adalah fasa diam yang mengikuti/menyerap zat yang dianalisa,
contohnya kertas, kanji, selulosa, silika gel, dll.

Distribusi fasa atau perpindahan molekul suatu komponen dari fasa yang bergerak
menuju ke fasa diam yang dilaluinya merupakan suatu proses kesetimbangan. Apabila
tetapan kesetimbangan dari molekul komponen-komponen dari zat yang akan dianalisa
terhadap ke dua fasa yang bergerak dan fasa diam yang dilaluinya berbeda, maka akan
terjadi pemisahan komponen-komponen tersebut. Bila suatu komponen mempunyai daya
ikat pada fasa diam yang dilaluinya lebih besar, maka komponen tersebut akan lebih
dahulu terikat/diadsorbsi oleh fasa padat daripada komponen yang lainnya. Sebagai hasil
analisa kromatografi, daerah pemisahan komponen pada fasa diam akan berupa pita
lurus.
Distribusi molekul dapat berupa distribusi fasa adsorbsi dan distribusi fasa partisi.

Distribusi fasa adsorbsi yaitu distribusi fasa yang terjadi karena adanya perbedaan
daya adsorbsi komponen-komponen pada fasa padat. Sedangkan distribusi fasa partisi
yaitu distribusi fasa yang terjadi karena perbedaan kelarutan komponen-komponen
dalam pelarut-pelarut yang tidak saling melarutkan.
Kromatografi dapat digunakan untuk sbb:
1. Menentukan konsentrasi suatu zat sampel.
2. Menentukan kemurnian zat sampel.
3. Memisahkan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat.
4. Menentukan komponen-komponen yang terdapat dalam suatu zat sampel dengan
menghitung harga Rf (Ratio formation) tiap komponen.

Rf = Jarak titik awal ke titik noda dibagi Jarak titik awal ke titik akhir pergerakan
eluen

Dengan demikian menurut gambar di atas, Rf = a/b.

Harga Rf dipengaruhi oleh keadaan zat sampel, temperatur, dan jenis komponen.
Keakuratan hasil pemisahan dengan kromatografi bergantung pada beberapa faktor sbb:
a. Pemilihan adsorben sebagai fasa diam.
b. Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai dengan fasa gerak.
c. Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlah material yang akan
dipisahkan.
d. Laju elusi atau aliran fasa gerak.
Analisa kromatografi dapat dibagi menjadi kromatografi kertas, kromatografi gas,
kromatografi lempeng tipis, dan kromatografi kolom

b. Kromatografi lempeng tipis (KLT)

Adalah kromatografi atau pemisahan komponen-komponen zat dari campuran
berdasarkan pada jenis distribusi fasa adsorbsi cair-padat. Sebagai fasa padat atau
adsorbennya berupa lapisan tipis bubur alumina atau silika gel yang menempel pada
permukaan selembar lempengan kaca atau selembar plastik kaku. Sedangkan sebagai
fasa cairnya ialah eluen yang digunakan untuk membawa zat yang akan diperiksa
bergerak melalui fasa padat. KLT digunakan untuk menganalisa suatu senyawa, untuk
mengetahui komponen-komponen senyawa tersebut dengan menghitung Rf komponen-
komponen yang ada. Disamping itu dapat juga digunakan untuk menentukan eluen yang
paling cocok bagi suatu senyawa dalam kromatografi kolom.

Cara membuat lempeng tipis:

1. Cuci lempeng kaca (slide mikroskop) dengan air sabun, kemudian dengan metanol,
keringkan. Campurkan 35 gram silika gel dan 1 gram kanji, haluskan dan aduk sampai
merata, kemudian masukan ke dalam 100 ml kloroform-metanol (2:1) dalam botol
tertutup, aduk sampai merata. Ambil 2 buah slide yang dipegang dalam posisi saling
berhimpitan, kemudian masukan slide itu ke dalam suspensi tersebut, tariklah pelan-
pelan, biarkan mengering dan bila sudah cukup kering maka pisahkan ke dua slide dan
letakan perlahan-lahan.
2. Buat bubur aluminium atau silika gel yang dicampur dengan kanji (kalsium sulfat) dan
air, dengan perbandingan 30:1:65, aduk sampai merata. Pasang slide pada alat seperti di
bawah ini.

Tuangkan campuran ke atas slide tersebut, ratakan dengan menggunakan batang

pengaduk. Ambil slide tersebut, letakan dan biarkan mengering secara perlahan-lahan.
KLT tersebut sebelum digunakan panaskan terlebih dahulu pada suhu 1100C selama ±15
menit.

Cara melakukan percobaan KLT:

Letakan KLT di atas kertas yang telah diberi gambar KLT dengan tanda garis ± 1cm dari
bagian bawah. Teteskan zat sampel dengan pipa kapiler di atas garis tersebut,
keringkan, ulangi penetesan 3x. Masukan KLT ke dalam gelas kimia yang berisi eluen dan
pinggirannya telah dilapisi kertas saring, tutup gelas kimia dengan gelas arloji (noda
tidak boleh kena pada eluen). Biarkan eluen naik sampai mendekati ujung kertas KLT,
kemudian angkat dan letakan kembali di atas kertas seperti langkah pertama. Beri tanda
pada kertas batas akhir eluen, keringkan. Apabila noda tidak jelas semprot dengan
pereaksi yang cocok. Kemudian letakan kembali di atas kertas. Beri tanda letak noda
pada kertas tersebut. Tentukan banyaknya komponen dan hitung Rf masing-masing noda.
Perhatikan gambar di bawah ini.

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi

senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga

merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun

cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya

hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan

kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi

kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa

secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil.

Prinsip

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel

dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk

plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan.

Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen Semakin dekat kepolaran

antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak

tersebut

Visualisasi
Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini .

sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat

karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai

adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-

dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina.

Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi

berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.

Nilai Rf

Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu

perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama

walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai

ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan

derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut

faktor retensi.]Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :

Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa

tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang

berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa

tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi

lapis tipis.

Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai

Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki

karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa

tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda.

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-

komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip

ini.Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan

kecepatanperambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-

komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.Fase

diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akanmelarutkan zat

komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fasediam akan tertinggal.

Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akanbergerak lebih cepat.

Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan,atau kombinasi cairan-

padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerakmengalir melalui fase diam

dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalamcampuran. Komponen-komponen

yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda Proseskromatografi juga digunakan

dalam metode pemisahan komponen gula dari komponennon gula dan abu dalam tetes

menjadi fraksi-fraksi terpisah yang diakibatkanolehperbedaan adsorpsi, difusi dan

eksklusi komponen gula dan non gula tersebut terhadap adsorbent dan eluent yang

digunakan.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau

aluminayang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel

silika(atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis

tipisseringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam

sinarultra violet.Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. Fase

diamlainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom aluminium

padapermukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel

silikakemudian digunakan serupa untuk alumina.

Dalam kromatografi, eluent adalah fasa gerak yang berperan penting pada proses

elusibagi larutan umpan (feed) untuk melewati fasa diam (adsorbent). Interaksi

antaraadsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen.

Olehsebab itu pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi

oleh lajualir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran

kekuatanteradsorpsinya
 pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal iniyang banyak

digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika.Penggolongan ini

dikenal sebagai deret eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif

polar, dapat mengusir pelarut yang relatif tak polar dari ikatannyadengan alumina (jel

silika)

KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu:

1. Waktu pemisahan lebih cepat

2. Sensitive, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.

3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.