Bakteri adalah domain yang terdiri dari makhluk hidup yang tidak memiliki

membran inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti

coccus, basil, dan spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat
bakteri sangat bervariasi, dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuhhewan,
(Betsy dan Keogh. 2005). Bakteri umumnya tidak memiliki pigmensehingga
tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan karena tidak kontrasdengan
medium dimana mereka hidup.

Oleh karena itu, perlu dilakukanpewarnaan agar bakteri tampak jelas bila
diamati dengan mikroskop (Harleydan Presscot, 2002). Pewarnaan
dikelompokkan menjadi pewarnaan langsungdengan pewarnaan basa,
pewarnaan tak langsung atau pewarnaan negatif danpewarnaan gram
(Dwidjoseputro, 2003). Pewarnaan basa adalah pewarnaanyang langsung
mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah pewarnaan yangtidak langsung
mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar belakang preparatbakteri
tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan pewarna
yangbersifat asam seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan Presscot,
2002).

Pewarnaan gram merupakan pewarnaan umum dalam bidang

bakteriologi.Dengan pewarnaan ini, kelompok bakteri dibedakan menjadi dua
yaitu bakterigram positif dan bakteri gram negatif (Ramona dkk, 2007). Hasil
akhir daripewarnaan gram adalah bakteri gram positif akan berwarna
ungu/biru,sementara bakteri gram negatif akan berwarna merah (Harley dan
Presscot,2002)

Pewarnaan garam atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram
(1853-1938) yang mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan gram bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu
pewarnaan penimbang (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu yang
membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah
muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen,yang berarti
mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat potogen ini berkaitan dengan
komponen tertentu pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan
lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau Endotoksin).

Tujuan pewarnaan yaitu :

 Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, ataupu fungi.

 Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.
 Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.
 Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang di berikan sehingga sifat-sifat fisik
dan kimia yang ada akan dapat di ketahui.
Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak
digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat
warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah
bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya
bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk
pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan
sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna
basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru,
kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi
lagi menjadi dua jenis pewarnaan.

1. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan
tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam
pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin.

1. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada
pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini
menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan Diferensial (Gram)

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif
dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka.
Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun
1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella
pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak
mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan
setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur
dinding sel mereka.

1. Bakteri Gram Negatif

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol,
sementara bakteri gram negative tidak.

1. Bakteri Gram Positif

Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru
atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan
berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini
terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri
(Aditya,2010)

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat
diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki
selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan
dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh
alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi
terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu
dekolorisasi terlalu pendek (Fitria, 2009).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri garam (+) Bakteri gram negatif(-)

Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi

Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan

Penghambatan oleh pewarna

basa (VK) Lebih dihambat Kurang dihambat

Kebanyakan spesies relatif

Kebutuhan nutrisi kompleks Relatif sederhana

Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).

Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh –

Neelson dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan
pewarna tandingan metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti
dengan penggunaan pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi
tegangan permukaan lemak, untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang
mengandung pembasah ini disebut pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).

Faktor – faktor penentu keberhasilan dalam pewarnaan bakteri ialah :

 Fiksasi
Fiksasi dilakukan sebelum zat warna digunakan, bertujuan untuk :

– Melekatkan sel pada gelas objek.

– Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.

– Melepaskan granular protein menjadi gugus reaktif-NH3 yang akan bereaksi

dengan gugus OH– dari zat warna.
– Mencegah terjadinya otolitis sel, yaitu proses pecahnya sel yang
disebabkan oleh enzim yang ada didalamnya.
– Merubah daya ikat zat warna.

Fiksasi dapat dilakukan secara fisik dengan pemanasan ataupun pengeringan

secara dingin, sedangkan yang paling umum dilakukan secara kimia dengan
penambahan sabun, formalin, fenol, dan sebagainya.

 Pelunturan warna
Pelunturan warna bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah
diwarnai. Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras
pada sel mikroba sehingga dengan jelas dapat dilihat dibawah mikroskop
misalnya.

Pada umumnya sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula
dilunturkan, sedangkan sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit
pula untuk dilunturkan. Sifat cepat dan lambatnya cara pelunturan inilah yang
diperbedakan untuk membedakan kelompok mikroba setelah diberi
pewarnaan.

Dari segi ketahanan sel terhadap senyawa kimia, dibidang mikrobiologi

dikeSnal ada tahan asam, tahan alkohol, tahan air dan sebagainya.
Ketahanan terhadap suatu zat kimia inipun dipergunakan untuk membedakan
kelompok mikroba.