LAPORAN PERCOBAAN

PENENTUAN MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION (MIC) DARI

SUATU SEDIAAN UJI YANG BERPOTENSI SEBAGAI ANTIBIOTIK

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM : Rabu, 30 November 2016

ASISTEN LABORATORIUM : 1. Rindita Aulia Lubna
2. Lily Cyntia Fauzi
NAMA ANGGOTA:
NAMA NPM
WONG YI SHAN 260110152008
CHU YUAN SHAN 260110152009
NURAIN BALQIS 260110152011
LOLINDAH CHIN 260110152018

LABORATORIUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT INFEKSI GANGGUAN

IMUNOLOGI DAN ONKOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2016
I. TUJUAN

Menentukan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) suatu sediaan uji terhadap ba

kteri Gram positif maupun Gram negatif, dengan menggunakan metoda MIC cair atau
MIC padat.

II. PRINSIP
1. MIC
Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal dengan MIC (Minimum Inhib
itory Concentration) adalah konsentrasi terendah dari antibiotika atau antimikrobial y
ang dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu (Susanti, 2009).

2. Makrodilusi
Makrodilusi adalah suatu metode penentuan MIC antibiotic menggunakan satu seri ta
bung reaksi yang diisi media cair dan bakteri tertentu serta ditambahkan sejumlah anti
biotic dengan konsentrasi yang berbeda-beda tiap tabungnya dengan kekeruhan medi
a sebagai penentu dimana MICnya(Volk, 1998).

3. Pertumbuhan Bakteri
Adanya pertumbuhan bakteri atau tidaknya dilihat dari kekeruhan pada media cair pa
da tabung reaksi(Waluyo, 2007).

4. Teknik Aseptis
Teknik aseptis adalah suatu metode atau teknik didalam memindahkan atau mentransf
er kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kont
aminasi oleh mikroba lain dalam kultur (Pratiwi, 2008).
III. REAKSI
-
IV. TEORI DASAR
Antibiotik adalah zat kimia yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang mempuny
ai kemampuan dalam larutan encer, untuk menghambat pertumbuhan dan membunuh
mikroorganisme. Salah satu jenis antibiotik adalah kloramfenikol. Kloramfenikol adal
ah antibiotik spektrum luas yang efektif terhadap beberapa jenis bakteri dan kuman an
aerob (Dian, 2015).
Konsentrasi minimun penghambatan atau lebih dikenal dengan MIC (Minimum I
nhibitory Concentration) adalah konsentrasi terendah dari antibiotika atau antimikrobi
al yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba tertentu. Nilai MIC adalah spesifik
untuk tiap-tiap kombinasi dari antibiotika dan mikroba. MIC dari sebuah antibiotika t
erhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensitivitas dari mikroba terhadap anti
biotika. Nilai MIC berlawanan dengan sensitivitas mikroba yang diuji. Semakin rend
ah nilai MIC dari sebuah antibiotika, sensitivitas dari bakteri akan semakin besar (Jaw
etz ,1996).
Penetapan MIC dapat dilakukan dengan menguji sederetan konsentrasi yang dibu
at dengan pengenceran, metode yang digunakan dapat dengan cara turbidimetri (deng
an melihat kekeruhan) ataupun cara difusi agar. Konsentrasi terendah di mana pertum
buhan bakteri terhambat dinyatakan sebagai konsentrasi minimum untuk inhibisi (MI
C) ( Pelczar,1958 ).
Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang dalam sel tunggal a
tau berpasangan, merupakan anggota family Enterobacteriacea dan flora normal intest
inal yang mempunyai kontribusi pada fungsi normal intestine dan nutrisi tetapi bakte
ri ini akan menjadi pathogen bila mencapai jaringan di luar jaringan intestinal. Spesie
s E.coli bersifat motil dengan flagel peritrik yang dimilikinya, tetapi beberapa ada yan
g nonmotil. Manifestasi klinis dari infeksi E. coli ini tergantung pada daerah infeksi d
an tidak dapat dibedakan dari gejala yang disebabkan oleh bakteri lainnya (Noviana,
2014).
 Antibiotik adalah zat kimia yang dihasilkan oleh suatu mikroba yang mempunyai
khasiat antimikroba. Mekanisme kerja antibiotik antara lain adalah menghambat sinte
sis dinding sel, merusak permeabilitas membran sel, menghambat sintesis RNA (pros
es transkripsi), menghambat sintesis protein (proses translasi), menghambat replikasi
DNA. (Immanudin, 2010).
Antibiotik kloramfenikol akan melekat pada subunit 50s ribosom bakteri sehingg
a menghalangi enzim Peptidil-tranferase. Enzim inilah yang melaksanakan 3 langkah
dengan membentuk ikatan peptida antara asam amino baru yang masih melekat pada t
RNA-nya, dan asam amino terakhir peptida yang sedang berkembang. Hal ini menye
babkan sintesis protein terhenti seketika. Bila tidak terjadi perubahan struktur purin o
leh bakteri maka sensitifitasnya tidak akan berkurang. Purin merupakan tempat masu
knya antibiotik agar antibiotik dapat bekerja pada dinding sitenya. Struktur purin yan
g tetap pada dinding sel bakteri menyebabkan bakteri. Escherichiacoli masih sensitif
terhadap antibiotik kloramfenikol. (Goodman, 2007).

V. ALAT DAN BAHAN

V.1. Alat
1. cawan petri V.2. Bahan
2. Inkubator 1. Air suling
3. Labu ukur 100 ml 2. Nutrient Broth (NB) double
4. lampu spirtus strength
5. Mortir dan stamper 3. Nutrient Broth (NB)
6. Ose 4. Pelarut sediaan uji
7. Rak tabung 5. Sediaan uji
8. Tabung reaksi besar dan kecil 6. suspensi bakteri (E.coli)
9. Volume pipet berukuran 1 ml dan 1
0 ml
 V.3. Gambar Alat

No alat gambar alat

1. cawan petri

2. labu ukur

3. lampu spiritus
4. mortir dan stamper

5. ose

6. pipet volume

7. rak tabung uji dan tabung uji

VI. PROSEDUR
MIC CAIR

Sediaan kloramfenikol dimasukkan ke dalam labu ukur dan dilarutkan dengan

sedikit pelarutnya. Kemudian, air suling steril ditambahkan sampai tanda batas.
Pengenceran direncanakan dan dihitung konsentrasi campuran pada masing-masing
tabung besar dan tabung-tabung kecil. Pengenceran bertingkat larutan sediaan uji
dibuat dengan air suling steril dalam tabung-tabung reaksi besar. Tabung reaksi kecil
pertama diisi dengan 1 ml NB double strength, sedangkan tabung-tabung reaksi
selanjutnya dengan 1 ml NB biasa. Hasil pengenceran terakhir sebanyak 1 ml
dipipetkan ke dalam tabung 1 berisi NB double strength, kocok sampai homogen.
Campuran dari tabung 1 sebanyak 1 ml dipipetkan ke tabung 2, kocok sampai
homogen. Langkah tersebut diulangi sampai tabung terakhir. 1 ml campuran dibuang
dari tabung terakhir. Bakteri sebanyak 1 ose ditambahkan ke dalam masing-masing
tabung kecil, kocok sampai homogen. Satu kontrol postif dan satu kontrol negatif
dibuat. Kontrol positif terdiri dari 1 ml NB dan 1 ose bakteri. Kontrol negatif hanya
berisi 1 ml NB. Semua tabung kecil diinkubasikan pada suhu 37 ˚C selama 18-24
jam, kekeruhan yang terjadi diamati dan dibandingkan dengan kontrol positif dan
negatif. MIC ditentukan daripada tabung bening yang terakhir atau sebelum tabung
keruh pertama.

MIC PADAT

Kloramphenicol digerus terlebih dahulu kemudian dimasukkan dalam labu

ukur dan dilarutkan dalam pelarutnya. Kemudian ditambah dengan aquadest sampai
tanda batas labu ukur 100ml. Kemudian rencanakan pengenceran dan konsentrasi tiap
tabung dihitung konsentrasi masing-masing pengenceran dalam tabung besar yang
diinginkan adalah 300µg, 200 µg, dan 100 µg.

Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat larutan antibiotik dan air suling

steril pertama disiapkan tiga buah tabung reaksi besar, kemudian tabung diisi dengan
1.5 ml sampel antibiotik yang telah dilarutkan dalam labu ukur dan11 ml aquadet
steril. Dikocok. Setelah itu Disiapkan 3 buah cawan petri. Permukaan cawan
kemudian dibagi 2 dua bidang sama besar, dan diberi label nama bakteri yang akan
digunakan pada setiap area. Masing-masing pengenceran yang telah dibuat
dimasukkan ke dalam cawan-cawan petri sebanyak 1 ml, dan kemudian ditambahkan
ke dalamnya 19ml NA/Nutrient Agar. Cawan petri tersebut kemudian digoyangkan
perlahan agar campuran tercampur rata. Dan akhirnya didiamkan hingga membeku.
Goreskan masing-masing bakteri pada area yang terpisah dengan menggunakan ose.

Kontrol positif terdiri dari 20 ml NA dan satu ose bakteri. Semua tabung
reaksi diinkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Amati pertumbuhan bakteri dari
koloni-koloni yang tampak. Bandingkan morfologi koloni-koloni tersebut dengan
kontrol positif. Tentukan dimana MIC nya. MIC terletak pada cawan petri terakhir
yang tidak tampak koloni bakteri.

VII. DATA PENGAMATAN

MIC CAIR

No Perlakuan Hasil Gambar

.
1. Sediaan kloramfenikol Didapatkan larutan
dimasukkan ke dalam labu kloramfenikol
ukur, dilarutkan dengan sebanyak 100 mg/ml.
pelarut dan ditambahkan air
suling steril sampai tanda
batas.

2. Pengenceran bertingkat Didapatkan larutan

larutan sediaan uji dibuat pengenceran
dengan air suling steril sebanyak 2 ml dalam
dalam tabung-tabung tabung reaksi.
reaksi.

3. Tabung reaksi kecil Didapatkan 1 ml NB

pertama diisi dengan 1 ml double strength,
NB double strength, sedangkan tabung-
sedangkan tabung-tabung tabung reaksi
reaksi selanjutnya dengan 1 selanjutnya dengan 1
ml NB biasa. ml NB biasa.

4. Hasil pengenceran terakhir Didapatkan hasil

sebanyak 1 ml dipipetkan pengenceran terakhir
ke dalam tabung 1 berisi sebanyak 1 ml
NB double strength, kocok dipipetkan ke dalam
sampai homogen. tabung 1 berisi NB
Campuran dari tabung 1 double strength yang
sebanyak 1 ml dipipetkan homogen dan
ke tabung 2, kocok sampai campuran dari tabung
 homogen. Langkah tersebut 1 sebanyak 1 ml
diulangi sampai tabung dipipetkan ke tabung
terakhir. 2 yang homogen.
5. Bakteri sebanyak 1 ose Didapatkan larutan
ditambahkan ke dalam 5ml NB dan (sediaan
masing-masing tabung uji+air suling steril)
kecil, kocok sampai beserta 1 ose bakteri
homogen. yang homogen.

6. Satu kontrol postif dan satu Kontrol positif terdiri

kontrol negatif dibuat. dari 1 ml NB dan 1
ose bakteri. Kontrol
negatif hanya berisi 1
ml NB.

7. Semua tabung kecil Didapatkan tabung

diinkubasikan pada suhu 37 kecil pada suhu 37
˚C selama 18-24 jam, ˚C setelah 18-24 jam
kekeruhan yang terjadi dan diamati.
diamati dan dibandingkan
dengan kontrol positif dan
negatif.
Hasil pengamatan gambar diatas:

Pengamata Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 Tabung 5 Tabung 6

n
Kekeruhan + + + + + +

Perhitungan MIC cair:

100 mg 100000 µg
= = 1000 µg / mL
100 mL 100 mL

Pengenceran :

1. Tabung 1 V1 1000 = 5 . 100

V1 N1 = V2 N2 V1 = 0.5 mL
2. Tabung 2 N2 = 6.25 µg / mL

V1 N1 = V2 N2
5. Tabung 5
V1 100 = 5 . 50
N1 V1 = N2 V2
V1 = 2.5 mL
1 . 6.25 = 2 . N2

3. Tabung 3 N2 = 3.125 µg /
mL
N1 V1 = N2 V2

25 . 1 = N2 . 2
6. Tabung 6
N2 = 12.5 µg /mL
N1 V1 = N2 V2
4. Tabung 4
1 . 3.125 = 2 . N2
N1 V1 = N2 V2
N2 = 1.5 µg / mL
1 . 12.5 = 2 . N2
MIC PADAT

No Pelakuan Hasil Gambar

1. Pengenceran Kloramfenikol
Kloramfenikol encer 50mg/mL
Dalam tabung reaksi terhasil.
tersedia larutan
Kloramfenikol
100mg/mL. dari tabung
uji dipipet sebanyak
2.5mL dan dimasukkan
ke dalam tabung reaksi
yang bertanda A.
2. Ditambah aquades Sebanyak 5mL
sebanyak 2.5mL dan larutan diperoleh.
dikocok hingga
homogen.

3. Dari tabung reaksi A, Kloramfenikol

dipipet sebanyak 1mL encer 25mg/mL
dan dimasukkan ke terhasil
dalam tabung reaksi
yang bertanda B.
4. Ditambah aquades Sebanyak 2mL
sebanyak 1mL ke dalam larutan diperoleh
tabung B.

5. Dari tabung reaksi B, Kloramfenikol

dipipet sebanyak 1mL encer 12.5mg/mL
dan dimasukkan ke terhasil.
dalam tabung reaksi
yang bertanda C.

6. Ditambah aquades Sebanyak 2mL

sebanyak 1mL ke dalam larutan diperoleh
tabung C.

7. Sebanyak 1mL dari Media menjadi

tabung reaksi A dipipet padat setelah 10
dan dicampurkan menit
bersama 19mL media
yang telah dicairkan dan
dibiarkan memadat di
dalam cawan petri.
8. Langkah ini diulang Media padat
dengan tabung reaksi B dengan
dan juga C. antibiotika
terhasil

9. Setelah memadat, Suspensi ditebar

sebanyak 20 microliter atas media padat.
suspensi E.coli di
masukkan ke dalam
piring petri yang telah
bertanda A, B dan C.
seterusnya ditebarkan
dengan menggunakan
rod kaca.
11. Piring dibiarkan Media diinkubasi
sebentar dan kemudian selama 18 hingga
diinkubasi. Hasil 24 jam.
diamati setelah 24 jam

HASIL INKUBASI

No Pring Petri Gambar

1. A

2. B

3. C
VIII. PEMBAHASAN

MIC CAIR

Dalam pratikum ini, kami akan menguji MIC ( minimum inhibitory concentration
sesuatu antibiotik (kloramfenikol) terhadap mikroba( E.coli) maupun secara metode
MIC cair dan MIC padat.

Nilai MIC (Minimum inhibitory concentration) diperoleh dengan menentukan kon

sentrasi minimum senyawa obat yang mampu menghambat aktivitas protease bakteri l
ebih dari 99%. Dosis efektif antimikroba merupakan fungsi dari kadar hambat minim
al (minimum inhibitory concentration/MIC), kemampuan pertahanan tubuh individu, l
okasi infeksi, dan profil farmakokinetika antimikroba.

MIC dari sebuah antibiotika terhadap mikroba digunakan untuk mengetahui sensit
ivitas dari mikroba terhadap antibiotika. Nilai MIC berlawanan dengan sensitivitas m
ikroba yang diuji. Semakin rendah nilai MIC dari sebuah antibiotika, sensitivitas dari
bakteri akan semakin besar.

Mula-mula disiapkan alat dan bahan yang steril. Alat dan bahan harus disterilisasi
kan karena dibutuhkan teknik aseptis pada perhitungan MIC ini agar didapatkan hasil
MIC yang tepat dan tidak terjadi kontaminan. Steril artinya tidak didapatkan mikroba
yang tidak diharapkan kehadirannya, baik yang mengganggu atau merusak media ma
upun mengganggu kehidupan dan proses yang sedang dikerjakan. Semua proses baik
fisika, kimia, dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan, terutama mikro
organisme disebut dengan sterilisasi.

Kloramfenikol dilarut dalam labu ukur dengan air suling steril kemudian dilakuka
n pengenceran bertingkat di dalam tabung reaksi besar. Mekanisme kerja kloramfenik
ol sebagai anti bakteri bersifat stereospesifik, karena hanya satu ste- reoisomer yang
memiliki aktivitas anti bakteri, yaitu d-threo isomer. Kloramfenikol bekerja pada spe
ktrum luas, efektif baik terhadap Gram positif maupun Gram negatif. Mekanisme kerj
a kloram- fenikol melalui penghambatan terhadap biosintesis protein pada siklus pem
anjangan rantai asam ami- no, yaitu dengan menghambat pembentukan ikatan peptid
a. Antibiotika ini mampu mengikat subunit ribosom 50-S sel mikroba target secara ter
pulihkan, akibatnya terjadi hambatan pembentukan ikatan peptida dan biosintesis prot
ein. Kloramfenikol umumnya bersifat bakteriostatik, namun pada konsentrasi tinggi d
apat bersifat bakterisid terhadap bakteri-bakteri tertentu.

Selanjutnya dilakukan pengenceran antibiotic kloramfenikol. Prinsip metode peng

enceran adalah senyawa antibakteri diencerkan hingga diperoleh beberapa macam ko
nsentrasi, kemudian masing-masing konsentrasi ditambahkan suspensi bakteri uji dala
m media cair. Perlakuan tersebut akan diinkubasi dan diamati ada atau tidaknya pertu
mbuhan bakteri, yang ditandai dengan terjadinya kekeruhan.

Larutan uji senyawa antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adan
ya pertumbuhan bakteri uji, ditetapkan sebagai Kadar Hambat Minimal (KHM) atau
Minimal Inhibitory Concentration (MIC). Larutan yang ditetapkan sebagai KHM ters
ebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan bakteri uji ataupu
n senyawa antibakteri, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terliha
t jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM) atau Mini
mal Bactericidal Concentration (MBC).

Teknik dilusi sangat penting dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua m
etode penelitian dari penghitungan jumlah sel mikroba menggunakan teknik ini. Peny
iapan media pertumbuhan mikroorganisme harus mengandung nutrisi yang dibutuhka
n bakteri supaya dapat tumbuh membentuk koloni dan harus steril sehingga tidak ada
kontaminan dari lingkungan. Jadi media pertumbuhan mikorba yang digunakan dalam
praktikum kali ini adalah Nutrient Broth.
 Lalu, dari tabung reaksi besar, larutan antibitok dilakukan pengenceran bertingkat
ke sejumlah 6 tabung reaksi kecil. Tabung 1 berisi 1 ml NB double strength. NB doub
le strength ini adalah cairan NB yang konsentrasinya dua kali dari biasanya. Double st
rength ini dimaksudkan untuk agar pada saat pengenceran ke tabung kedua, konsentra
si antibiotik berasal dari konsentrasi yang sebanding dengan konsentrasi yang tadinya
berada dalam labu ukur ke tabung reaksi besar. Untuk tabung-tabung selanjutnya diis
i dengan 1 ml NB biasa. Konsentrasi mulai dari tabung 1 sampai tabung 6 secara
berturut-turut adalah, 50 µg/ml;25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 6,25µg/ml; 3,125 µg/ml dan1,5
625 µg/ml.

Setelah itu, ke dalam masing-masing tabung yang sudah berisi media pertumbuha
n bakteri dan antibiotik, dimasukkan 1 ml suspensi bakteri Escherichia coli dengan m
enggunakan mikro pipet agar hasilnya akurat. Pekerjaan ini harus selalu dilakukan sec
ara aseptis agar tidak ada bakteri lain yang masuk ke dalam wadah percobaan dan aga
r mendapatkan hasil yang diinginkan. Bekerja secara aseptis dapat dilakukan dengan
cara selalu mendekatkan alat-alat yang digunakan dengan api yang menyala dan prak
tikan tidak boleh banyak berbicara.

E. coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang pendek, motil aktif dan
tidak membentuk spora. Pembiakkan E. coli bersifat aerob atau fakultatif anaerob, per
tumbuhan optimum pada suhu 37ºC.

Setelah itu, membuat kontrol positif. Hal ini dilakukan agar pada saat pengamata
n hasil percobaan bisa dibandingkan dengan kontrol positif tersebut. Kontrol positif di
buat dari 1 ml NB yang ditempatkan di dalam tabung reaksi. Dalam melakukan prose
dur ini, juga harus dilakukan secara hati-hati (dalam arti aseptis) agar bisa menjadi pe
mbanding yang baik pada saat pengamatan hasil percobaan. Setelah semua selesai, ta
bung-tabung reaksi tadi dimasukkan ke dalam inkubator yang suhunya telah disesuaik
an agar bakteri bisa tumbuh. Sampel percobaan diinkubasi selama 18-24 jam pada su
hu 37ºC.

Selanjutnya adalah penentuan MIC. MIC ditentukan dengan membandingkan men

gamati kekeruhan cairan yang berisi di dalam tabung uji. Misalnya, jika cairan dalam
tabung uji ternampak keruh ditandai masih ada bakteri. Jika cairan di dalam tabung uj
i ternampak bening ditandai bakteri sudah mati.

Dalam praktikum ini, konsentrasi hambat minimal untuk kloramfenikol tidak dapa
t ditentukan, karena selepas inkubasi selama 24jam, dalam semua tabung uji cairan ter
nampak masih keruh, ini menandai masih ada bakteri di dalamnya dan tidak dibunuh
oleh kloramfenikol. Hal ini mungkin disebab oleh tidak melakukan prosedur yang ben
ar. Misalnya, tidak fiksasikan loop ose selepas digunakan, tidak masukkan ose ke dala
m tabung uji dekat dengan api, atau konsentrasi kloramfenikol yang ditambah tidak b
enar dan sebagainya.
IX. KESIMPULAN

Dalam praktikum ini, kami mengetahui cara untuk menentukan Minimum Inhibitory
Concentration (MIC) suatu sediaan uji terhadap bakteri Gram positif maupun Gram n
egatif, dengan menggunakan metoda MIC cair atau MIC padat.

X. DAFTAR PUSTAKA

Dian, Fatimawali, Budiarso. 2015. Uji Resistensi Bakteri Escherichiacoli Yang

Diisolasi Dari Plak Gigi Terhadap Merkuri Danantibiotik Kloramfenikol.

Jurnal E-Biomedik (Ebm). Volume 3.

Goodman , Gilman, 2007. Dasar Farmakologi Terapi Edisi 10. Jakarta: Penerbit
Buku Kedokteran EGC.

Jawetz, A. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. Jakarta: EGC.

Noviana, Hera. 2004. Pola kepekaan antibiotika Escherichia coli yang diisolasi
dari berbagai spesimen klinis. J Kedokter Trisakti .Vol. 23 No. 4.

Pelczar, M. 1958. Microbiology. London: Mc Graw-Hill Book Company, Inc.

Pratiwi, Sylvia. T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta:Penerbit Erlangga.

Susanti, E. 2009. Validasi Metode Bioautografi Untuk Determinasi

Kloramfenikol. Jurnal Kedokteran Indonesia. Vol. 1

Volk dan Wheeler. 1988. Mikrobiologi Dasar. Edisi Kelima. Jilid I . Jakarta:
Penerbit Erlangga.

Waluyo, Lud. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: Penerbit Universitas Malang.