Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228

daftar isi yang tersedia di ScienceDirect

Jurnal Metode imunologi

j ourna l homepage: www.el sev i er.com/ l ocate / j im

telaahan

Peningkatan penghapusan agregat antibodi dengan kromatografi hidroksiapatit di hadapan polietilen

glikol

Pete Gagnon •
Divalidasi Biosystems, 240 Avenida Vista Montana, Suite 7F, San Clemente, CA 92672, USA

artikel Info abstrak

Pasal sejarah: Makalah ini melaporkan sebuah metode untuk meningkatkan efektivitas penghapusan agregat dari antibodi monoklonal
Menerima Februari 2008 9 dengan menggunakan hidroksiapatit (HA) di hadapan polietilen glikol (PEG). PEG istimewa meningkatkan retensi agregat,
Diterima dalam bentuk direvisi 30 Maret 2008 Diterima 5
sehingga meningkatkan derajat pemisahan antara antibodi agregat dan non-agregat. PEG memiliki efek yang sama pada
Mei 2008 Tersedia online 2 Juni 2008
penukar ion tetapi hanya setengah peningkatan diamati dengan HA. Metode HA cocok untuk persiapan agregat bebas IgG
dan IgM antibodi monoklonal untuk penelitian, diagnostik, atau aplikasi terapi.

Kata kunci:
Hidroksiapatit Antibodi puri fi kation
IgG IgM
© 2008 Elsevier-undang.

penghapusan agregat
Polyethylene glycol

1. Perkenalan
Hydroxyapatite (HA) telah dilaporkan sering untuk mendukung fraksinasi yang baik
agregat antibodi dan polimer. gradien fosfat sederhana telah terbukti cukup untuk
fraksinasi polimer IgA ( Aoyama dan Chiba, 1993; Luellau et al., 1997, 1998 ), Fraksinasi
dari IgM monomer dari pentamers dirakit secara lengkap ( Yamakawa dan Chiba, 1988,
Aoyama dan Chiba, 1993; Coppola et al., 1989 ), Dan penghapusan agregat dari
beberapa monoclonals IgG ( Josics et al., 1991; Franklin, 2002 ). gradien fosfat di hadapan
ion klorida baru-baru ini telah ditunjukkan untuk memperluas jangkauan IgG antibodi
monoklonal dari yang agregat dapat dihapus ( Gagnon et al., 1996, 2006, Sun, 2003,
2007 ). Bahkan tingkat agregat setinggi 40 - 60% dikurangi menjadi kurang dari 0,1%.
gradien klorida / fosfat secara bersamaan mendukung hingga 2 log pengurangan
kontaminan protein sel inang, lebih dari 3 log pengurangan DNA, lebih dari 4 log
pengurangan endotoksin, 2 - 3 log tercuci protein Pengurangan, dan 3 - pengurangan 4 log
virus menyelimuti ( Giovannini dan Freitag, 2001, Schubert dan Freitag, 2007, Gagnon et
al., 1996,
The puri superior fi kinerja kasi klorida gradien / fosfat berada dalam kemampuan
mereka untuk secara mandiri mengontrol dua mekanisme retensi antibodi primer HA ini:
fosforil pertukaran kation, dan af kalsium logam fi nity. Efek diferensial klorida dan fosfat
pada elusi antibodi yang fi pertama diakui pada tahun 1959 oleh Hjerten (1959 ). publikasi
berikutnya de fi interaksi ned hidroksiapatit dengan protein ( Gorbunoff, 1984a, b;
Gorbunoff dan Timasheff 1984 ) Yang mengarah ke rekomendasi untuk skrining rutin
dengan fosfat dan klorida ( Kawasaki, 1991; Gagnon, 1996 ). Dengan tidak adanya fosfat,
yang paling antibodi IgGmonoclonal tidak akan terelusi dari HA bahkan pada 2 M natrium
klorida, sehingga menunjukkan retensi mereka dengan kalsium af fi nity. Mayoritas
bagaimanapun, dapat dielusi dalam natrium klorida gradien pada konsentrasi fosfat
serendah 5 - 15 mM. Sebaliknya, BSA membutuhkan sekitar 100 mM fosfat untuk elusi,
bahkan di hadapan 2 M NaCl, dan DNA membutuhkan lebih dari 200 mM fosfat. Hal ini
menunjukkan bahwa meskipun ketahanan terhadap natrium klorida, komponen
pengikatan kalsium dari IgG relatif lemah. Menetapkan tingkat rendah konstan fosfat
menunda kalsium af lemah fi nity interaksi tapi daun interaksi ionik yang kuat utuh. Sebuah
gradien natrium klorida kemudian dapat memisahkan ikatan ion, eluting non-agregat IgG.
Agregat mengelusi pada konsentrasi klorida natrium tinggi. Tercuci protein kompleks
A-IgG dan kontaminan terfosforilasi

2006, Sun, 2003, 2007, Ng et al., 2006 ).

• Tel .: +1 949 276 7477; fax: 1 949 606 1904.

Alamat email: pete_gagnon@mac.com .

0022-1759 / $ - melihat hal depan © 2008 Elsevier-undang. doi: 10,1016 / j.jim.2008.05.002

 P. Gagnon / Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228
seperti DNA, endotoksin, dan lipid menyelimuti virus semua menunjukkan af kalsium
yang kuat fi nity dan tetap terikat sampai kolom dibersihkan dengan 500 - 600 mM fosfat.
Meskipun utilitas mereka, efektivitas klorida / gradien fosfat tampaknya berbanding
terbalik dengan konsentrasi fosfat diperlukan dukungan elusi antibodi tertentu dalam
gradien natrium klorida. penghapusan agregat umumnya baik dengan IgG antibodi
monoklonal yang dapat dielusi dalam NaCl pada konsentrasi fosfat dari 5 - 15 mM tetapi
menurun dengan antibodi yang membutuhkan lebih dari 20 mM fosfat untuk elutewithina
gradien NaCl. penghapusan ef fi siensi kontaminan lainnya menurun secara paralel. Hadir
pengalaman menunjukkan bahwa lebih dari setengah dari klon IgG jatuh ke dalam
kelompok lowphosphate, tapi ini meninggalkan sejumlah besar antibodi yang berpotensi
membutuhkan metode yang efektif untuk menghilangkan agregat. Pendekatan klorida /
fosfat juga gagal untuk mengakomodasi antibodi IgMmonoclonal dievaluasi sampai saat
ini.
penyelidikan sebelumnya telah menunjukkan bahwa PEG meningkatkan retensi
protein pada penukar ion ( Band et al., 1989, Gagnon et al., 1996, 2006 ). PEG adalah
istimewa dikeluarkan dari permukaan protein, meninggalkan themsurrounded oleh zona
eksklusi PEG bebas ( Arakawa dan Timasheff, 1985 ). Diskontinuitas antara zona eksklusi
ini dan-PEG tinggi fase mobile termodinamika tidak menguntungkan. PEG adalah juga
dikeluarkan dari permukaan fasa diam kromatografi ( Arakawa, 1985 ). Ketika protein
mengikat ke fase diam seperti HA di presenceof PEG, theyare dapat
sharehydrationwater, memungkinkan air untuk mentransfer ke fase gerak, sehingga
menurunkan konsentrasi massal PEG. Hal ini akan mengurangi besarnya diskontinuitas
dalam konsentrasi PEG antara zona eksklusi dan fase gerak. Selain itu, luas permukaan
terhidrasi dari protein terikat lebih rendah dari daerah permukaan aditif dari protein dan
fase stasioner secara terpisah. Kedua fenomena yang termodinamika menguntungkan
dan menstabilkan hubungan protein dengan fase diam. Protein akibatnya mengelusi pada
konsentrasi eluannya lebih tinggi dari tidak adanya PEG. Model ini mengasumsikan
bahwa PEG tidak mengganggu struktur air atau karakteristik hidrasi asli dari protein atau
fase diam.
Hasil dengan penukar ion menunjukkan korelasi linier antara log dari berat molekul
protein dan sejauh mana PEG meningkatkan retensi. Hal ini menunjukkan kemungkinan
menggunakan PEG untuk berbeda-beda meningkatkan retensi agregat, mungkin suf fi sien
untuk meningkatkan efektivitas penghapusan mereka dari persiapan antibodi. Makalah ini
menantang hipotesis itu, dan meluas ke perbandingan dengan efek PEG pada
penghapusan agregat oleh HA. Hasil percobaan menunjukkan bahwa PEG tidak
meningkatkan penghapusan agregat pada penukar ion, tetapi tingkat peningkatan
setidaknya 2 kali lipat lebih besar dengan HA. rami praktis fi kation teknologi dibahas.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. bahan
Protein A puri fi ed IgG antibodi monoklonal dan unpuri fi ed monoklonal IgM
disediakan oleh Avid Bioservices (Tustin, CA). komponen penyangga yang dibeli dari
Sigma / Aldrich (St Louis, MO). Sebuah 5 × 300 mm Bio-Sil ™ 400-5 eksklusi ukuran
kolom dan keramik hidroksiapatit CHT ™ Tipe I,
223
20 pM dan 40 pM, digunakan untuk IgG (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). CHT Tipe
II, 40 m digunakan untuk IgM. Hydroxyapatite dikemas menjadi 5 × 50 mm (1 mL) dan
11.3 × 100 mm (10 mL) MediaScout® kolom dengan Atoll GmbH (Weingarten, Jerman).
Sebuah 7,8 × 300 mm TSK-gel ™
G4000SWXL columnwas digunakan untuk analisis ukuran pengecualian dari IgM (Tosoh
Bioscience, Montgomeryville, PA). 1 mL ReSOURCE® Q dan S kolom diperoleh dari GE
Healthcare (Piscataway, NJ). Semua percobaan dilakukan pada AKTA® Explorer 100
(GE Healthcare).
2.2. Prosedur
2.2.1. Persiapan bahan referensi agregat IgG
Sebuah protein A-puri fi ed monoklonal IgG 1 antibodi (MAb1) containingmore dari 40%
aggregateswas fractionatedbyHA dalam gradien klorida / fosfat. Sebuah 10 mL
MediaScout kolom CHT Tipe I, 40 mikron itu diseimbangkan dengan 5 mM natrium fosfat,
20 mM MES, pH 6,5. Kolom penuh dengan 250 mg protein A puri fi ed antibodi, dan dielusi
dengan gradien 30 Volume kolom (CV) linear sampai 5 mM natrium fosfat, 20 mM MES,
2,0 M natrium klorida, pH 6,5. The fractionwas agregat dikumpulkan dan dianalisis
dengan eksklusi ukuran pada kolom Bio-Sil. Sekitar 65% dari populasi agregat terdiri
bentuk 4-antibodi, dengan jumlah yang lebih kecil dari bentuk-bentuk yang lebih besar.
Kondisi dan kromatogram perwakilan diberikan dalam Gagnon et al. (2006) . Tambahan
IgG 1 ( MAb2) dengan sekitar 10% dari total agregat disiapkan dan dianalisis dengan cara
yang sama. Sampel ini digunakan untuk mengkarakterisasi distribusi agregat dalam
metode kromatografi berikut.
2.2.2. kromatografi pertukaran ion di hadapan dan tidak adanya PEG
Sumber Q itu diseimbangkan dengan 10 mM natrium fosfat, pH7.5 di linear fl Tingkat
ow dari 565 cm / jam (3ml / menit). 50 uL protein A puri fi ed MAb1 atau sampel referensi
agregat disuntik, dan kolom dicuci dengan equilibrium penyangga. The columnwas dielusi
dengan 20 CV linear gradient 500 mM sodiumphosphate, pH 7,5. Percobaan diulangi
dengan
7,5% PEG-4600 ditambahkan ke kedua buffer. Sumber S itu diseimbangkan dengan 10
mM natrium sitrat, pH 6,0 pada linear fl Tingkat ow dari 565 cm / jam. 50 uL protein A puri fi edMAb1
atau sampel referensi agregat disuntik, dan kolom dicuci dengan equilibrium penyangga.
Kolom dielusi dengan 20 CV linear gradien untuk 200 mM natrium sitrat, pH 6,0.
Percobaan diulangi dengan 7,5% PEG-4600 ditambahkan ke kedua buffer. Setelah
digunakan, kedua kolom yang dibersihkan dengan 1 M natrium klorida,
sanitizedwith1Msodiumhydroxide, dan disimpan IN20% etanol.
2.2.3. HA kromatografi IgG dengan elusi gradien fosfat di hadapan dan tidak adanya PEG
A 1 mL kolom CHT Tipe I, 20 μmwas diseimbangkan dengan 10 mM sodium fosfat,
20 mM MES, pH 6,5, di linear
fl Tingkat ow dari 300 cm / jam (1 mL / menit). 100 uL protein-A puri fi ed MAb1, MAb2,
atau referensi agregat masing disuntik, kolom dicuci dengan equilibrium penyangga,
kemudian dielusi dalam 30 CV linear gradient 500 mM natrium fosfat, pH 6,5. Percobaan
diulangi di hadapan 3,75%, 5,625%, dan 7,5% PEG-4600 di buffer gradien. Kolom HA
dibersihkan dengan 500 mM
224 P. Gagnon / Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228
Gambar. 1. Anion exchange elusi pro fi les yang sangat dikumpulkan IgG di hadapan dan tidak adanya
PEG.MAb1.PEG-4600. Lihat Bagian 2.2.2 untuk rincian eksperimental.
natrium fosfat, pH 6,5, dibersihkan dengan 1 M natrium hidroksida, dan disimpan dalam
0,1 M natrium hidroksida. Sebuah protein ketiga A puri fi ed IgG antibodi monoklonal
(MAb3) dimuat dan dielusi dalam kondisi non-PEG yang sama. Percobaan diulangi
dengan 10% PEG-1000 ditambahkan ke mencuci dan elusi buffer. Sumber daya Q kolom
itu disetimbangkan 50 mM Tris, pH 8,5. IgG puncak dari percobaan HA masing dititrasi
untuk pH 8,5, kemudian dimuat oleh dilusi in-line pada proporsi 10% sampel, 90%
equilibrium penyangga. Kolom dicuci dengan equilibrium penyangga dan dielusi dalam 15
CV linear gradien untuk 50mMTris,
0,5 M natrium klorida, pH 8,5. agregat dari dua persiapan dievaluasi pada kolom Bio-Sil.
2.2.4. Puri fi kasi IgM dengan tidak adanya PEG selama kromatografi HA
Antibodi IgMmonoclonal adalah puri fi ed seperti yang dijelaskan dalam
Gagnon et al. (2008) . Singkatnya, sebuah mL kolom 10 jenis CHT II 40 μmwas
diseimbangkan dengan 10 mM fosfat, 20 mMMES, pH 6,7, di linear fl ow tingkat 200 cm /
jam (3,33 mL / menit). 1 L dari supernatan dimuat, kolom dicuci dengan baseline dengan
equilibrium penyangga, kemudian dielusi dengan 30 CV linear gradient 500 mM natrium
fosfat pH 6,7. The IgM puncak dari langkah CHT diaplikasikan pada kolom penukar kation
dan dielusi
Gambar. 2. Kation dipertukarkan elusi pro fi les yang sangat dikumpulkan IgG di hadapan dan tidak
adanya PEG.Mab1.PEG-4600. Lihat Bagian 2.2.2 untuk rincian eksperimental.
Gambar. 3. pemisahan agregat pada HA sebagai fungsi konsentrasi PEG fosfat
gradients.Mab1.PEG-4600. Lihat Bagian 2.2.3 untuk rincian eksperimental.
di gradien linier 10-500 mM natrium fosfat. agregat dievaluasi pada kolom TSK-gel.
2.2.5. Puri fi kasi IgM di hadapan PEG selama kromatografi HA
Metode yang dijelaskan dalam Bagian 2.2.4 diulangi kecuali bahwa mencuci dan
elusi gradien dari langkah HA dilakukan di hadapan 10% PEG-600. agregat dievaluasi
pada kolom TSK-gel.
2.2.6. HA kromatografi IgG dengan klorida / fosfat elusi gradien di hadapan dan tidak
adanya PEG
A 1 mL kolom CHT tipe I, 20 μmwas diseimbangkan dengan 10 mM sodium fosfat,
20 mM MES, pH 6,5, di linear
fl Tingkat ow dari 300 cm / jam (1 mL / menit). 100 uL protein-A puri fi ed IgG MAb1 atau
referensi agregat disuntikkan dan columnwas dicuci dengan equilibrium penyangga,
kemudian dielusi dalam 30 CV linear gradien untuk 10 mM natrium fosfat, 20mMMES,
1MNaCl, pH 6,5. Percobaan diulangi dengan 3,75% dan 7,5% PEG-4600 di buffer
gradien. Setelah digunakan, kolom dibersihkan dengan 500 mM natrium fosfat, pH 6,5,
dibersihkan dengan 1 M natrium hidroksida, dan disimpan dalam 0,1 M natrium
hidroksida.
Gambar. 4. retensi diferensial agregat dan non-agregat IgG sebagai fungsi konsentrasi PEG di
gradients.MAb1 fosfat. Lihat Bagian
2.2.3 untuk rincian eksperimental.
 P. Gagnon / Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228 225

Gambar. 5. Resolusi agregat dari antibodi non-agregat sebagai fungsi konsentrasi PEG fosfat Gambar. 7. Resolusi agregat dari antibodi non-agregat sebagai fungsi konsentrasi PEG dalam gradien
gradients.MAb1 Lihat Bagian 2.2.3 untuk rincian eksperimental. fosfat. Lihat Bagian 2.2.3 untuk rincian eksperimental.

3.2. Perbandingan kinerja, gradien fosfat di hadapan dan tidak adanya PEG

2.2.7. analitis SEC

Bio-Sil 400-5 dan G4000SWXL kolom yang diseimbangkan dengan 0,2 M arginin,
20mMMES, pH 6,5. 50 uL IgGwas diterapkan pada kolom Bio-Sil di linear fl ow tingkat 150 Gambar. 3 menggambarkan elusi pro fi les dari MAb1 pada HA dielusi dalam gradien

cm / jam (0,5 mL / menit). 50 uL IgMwas diterapkan pada kolom TSK-gel di linear fl ow fosfat, pada serangkaian konsentrasi PEG-4600 mulai 0-5,625%. Pro fi les selaras pada

tingkat 62 cm / jam (0,5 mL / menit). titik di mana antibodi non-agregat mulai mengelusi untuk memfasilitasi perbandingan efek
PEG-dimediasi. distribusi agregat disorot dalam abu-abu. Tidak ada pemisahan agregat
jelas dengan tidak adanya PEG. pemisahan agregat sebesar 3,75% PEG lebih unggul

3. Hasil pertukaran anion 7,5%, dan kira-kira setara dengan tukar kation sebesar 7,5%.
pemisahan dasar dari populasi agregat dicapai oleh HA di 5,625% PEG-4600.

3.1. Perbandingan kinerja, gradien pertukaran ion di hadapan dan tidak adanya PEG

Gambar. 1 menggambarkan elusi pro fi les dari MAb1 pada anion exchanger kinerja Gambar. 4 menggambarkan peningkatan relatif aggregatedand antibodi non-agregat

tinggi dengan tidak adanya dan kehadiran sebagai fungsi konsentrasi PEG. poin Data menunjukkan kadar fosfat di pusat puncak.

7,5% PEG-4600. Gambar. 2 menggambarkan sesuai pro fi le pada kinerja tinggi penukar Seperti yang diharapkan, populasi agregat lebih responsif. Gambar. 5

kation. distribusi agregat disorot dalam abu-abu. Tidak ada pemisahan agregat jelas di
kedua penukar dengan tidak adanya PEG. retensi agregat ditingkatkan pada penukar plot resolusi kromatografi sebagai fungsi PEG, dengan rumus R = Δ V / ((w 1+ w 2) / 2) di

anion tetapi tidak Suf fi sien untuk mencapai pemisahan dasar. Resolusi lebih baik pada mana Δ V = volume penyangga pusat inmL betweenpeak, w 1 = thewidth inmL dari IgGpeak

penukar kation, tapi masih insufisiensi fi sien untuk mencapai pemisahan dasar. non-agregat di 10% peakheight, dan w 2 = thewidth dari puncak agregat. Horizontal garis
putus-putus menunjukkan nilai R = 1.5, yang berlaku umum untuk sesuai dengan resolusi
dasar.

Gambar. 6. retensi diferensial agregat dan non-agregat IgG sebagai fungsi konsentrasi PEG dalam
gradien fosfat. Lihat Bagian 2.2.3 untuk rincian eksperimental. Gambar. 8. Ukuran analitis kromatografi eksklusi dari puri fi ed IgG.MAb3. 10.% PEG-1000. Lihat Bagian
2.2.3 dan 2.2.7 untuk rincian eksperimental.
226 P. Gagnon / Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228

Gambar. 9. Ukuran analitis kromatografi eksklusi dari puri fi ed monoklonal IgM.10% PEG-1000. Lihat Gambar. 11. retensi diferensial agregat dan non-agregat IgG sebagai fungsi dari konsentrasi PEG di
Bagian 2.2.4, 2.2.5, dan 2.2.7 untuk rincian eksperimental. klorida / gradients.MAb1 fosfat. Lihat Bagian 2.2.6 untuk rincian.

Gambar. 6 menggambarkan plot overlay pemisahan agregat untuk MAb1 dan MAb2.
plot yang solid menggambarkan perilaku agregat. plot putus-putus menggambarkan
PEG dan telah dihapus dari kolom dengan langkah pembersihan di 500 mM fosfat (w / o
perilaku antibodi non-agregat. Vertikal mengimbangi betweenplots hasil dari dana
PEG, data tidak ditampilkan). Data ini menunjukkan bahwa penggunaan PEG setidaknya
sebelumnya ofMAb2 elusi. Fitur themost mencolok namun theparallelismof respon
sama efektif untuk antibodi monoklonal IgM, dan menggambarkan ef fi keampuhan dari
terhadap PEG. Gambar. 7 menggambarkan plot overlay resolusi agregat untuk dua
berat molekul belum rendah PEG. Kenyataan bahwa kedua IgG dan IgM agregat
antibodi, dengan plot putus-putus menggambarkan MAb2. Dalam konteks Gambar. 6 ,
dipertahankan oleh HA sampai itu dibersihkan dengan 500 mM fosfat menunjukkan
Hasil yang ditunjukkan pada Gambar. 7 menunjukkan bahwa antibodi eluting sebelumnya
bahwa lebih rendah konsentrasi PEG dan / atau berat molekul rendah mungkin efektif.
memerlukan sedikit lebih PEG untuk mencapai resolusi agregat setara, tetapi seperti
dalam

Gambar. 6 , Fitur yang paling mencolok dari data adalah paralelisme antara dua antibodi.
3.3. Perbandingan kinerja, fosfat / gradien klorida dengan adanya dan tidak adanya PEG
Ini ditafsirkan untuk menunjukkan bahwa PEG mendominasi selektivitas asli dari HA,
terlepas dari karakteristik retensi antibodi individu. Data ini menunjukkan bahwa respon
PEG harus sama seragam dengan antibodi monoklonal IgG lainnya.
Gambar. 10 menggambarkan gradien klorida / fosfat dari MAb1 dan efek
ditambahkan PEG. Resolusi dekat baseline bahkan tanpa adanya PEG, tapi jelas lebih
baik di 3,75% PEG, dan secara dramatis unggul dalam 7,5% PEG. Gambar. 11 menggambarkan
Gambar. 8 membandingkan analisis SEC pro fi les IgG MAb3 disiapkan di hadapan
peningkatan relatif dari antibodi agregat dan non-agregat sebagai fungsi konsentrasi
dan tidak adanya 10% PEG-1000. Tidak ada agregat yang diamati dalam sampel
PEG. Retensi non-dikumpulkan IgG meningkat hanya sedikit pada konsentrasi PEG yang
diproses dengan PEG. Dalam percobaan HA yang sesuai, agregat tidak mengelusi
lebih tinggi. retensi agregat meningkat lebih dari non-agregat IgG, tetapi untuk tingkat
sampai 500 mM membersihkan fosfat langkah (w / o PEG, data tidak ditampilkan). Data
yang lebih rendah daripada yang diamati dalam gradien fosfat. Namun demikian, efek
ini menggambarkan ef fi keampuhan persiapan PEG berat molekul yang lebih kecil.
senyawa klorida, fosfat, dan PEG menyediakan kira-kira pemisahan yang sama sebesar
3,75% PEG seperti yang diperoleh pada 5,625% PEG dalam gradien fosfat ( Gambar. 3 ). Gambar.
12 plot kromatografi
Gambar. 9 membandingkan analisis SEC pro fi les IgM puri fi ed dengan adanya atau
tidak adanya PEG-600 pada langkah HA. Tidak ada agregat yang diamati dalam sampel
processedwith PEG. Seperti IgGMAb3, IgM agregat gagal mengelusi di hadapan

Gambar. 12. Resolusi agregat dari antibodi non-agregat sebagai fungsi dari konsentrasi PEG di klorida /
Gambar. 10. separationonHAas agregat sebuah functionof PEGconcentration inchloride / fosfat gradients.MAb1 fosfat. Lihat Bagian
gradients.MAb1.PEG-4600. Lihat Bagian 2.2.6 untuk rincian eksperimental. 2.2.6 untuk rincian.
 P. Gagnon / Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228
resolusi di klorida / fosfat / sistem PEG. Dua perbedaan penting dari gradien fosfat yang
jelas. Besarnya peningkatan 0-7,5% PEG kurang dari yang diperoleh dalam gradien
fosfat, dan respon pada dasarnya linear.
4. Diskusi
PEG meningkatkan pemisahan IgG agregat pada penukar ion seperti yang
diharapkan, tetapi peningkatan setidaknya 2 kali lipat lebih besar pada HA. Ini memiliki
proses rami penting fi kation. PEG meningkatkan viskositas penyangga, dan viskositas
mengurangi difusivitas ( Chicz dan Regnier, 1990 ). Berpori berdasarkan partikel Media
kromatografi seperti penukar ion dan HA bergantung pada difusi untuk transportasi
massal, sehingga viskositas tinggi dapat menekan kapasitas, peningkatan dielusi puncak
lebar, dan / atau memerlukan berkurang fl ow tingkat untuk mengkompensasi ( Afeyan et
al., 1990 ). Jadi, meskipun tingkat PEG bisa dibayangkan ditingkatkan suf fi sien untuk
penukar ion untuk menawarkan pemisahan sebanding dengan HA, kompromi akan
cenderung menjadi tak tertahankan. tekanan operasi kemungkinan akan menjadi faktor
pembatas juga, dan patut dipertanyakan apakah konsentrasi PEG tersebut akan
digunakan dalam hal apapun karena PEG adalah antibodi awellknown mengendapkan
agen.
Bentuk retensi peningkatan dan resolusi kurva menawarkan petunjuk tentang
mengapa HA lebih responsif. Seperti telah dibahas sebelumnya, tujuan untuk tingkat
rendah fosfat dalam gradien natrium klorida adalah untuk melemahkan kalsium af fi interaksi
nity. Hal ini membuat HA dominan sebuah fosforil penukar kation, dan seperti yang
diilustrasikan pada Gambar. 2 , Tingkat peningkatan pada penukar kation adalah
sederhana dibandingkan dengan HA di gradien fosfat. Implikasinya adalah bahwa PEG
bertindak kooperatif dengan baik af kalsium fi nity dan mekanisme pertukaran kation
fosforil untuk mencapai peningkatan besar dari metode single-mode seperti pertukaran
ion. Hal ini juga dapat explainwhy HA di gradien fosfat menawarkan pemisahan yang
lebih baik dari IgA dan IgM polimer dari penukar ion.
Dominasi PEG atas selektivitas dasar HA penyederhanaan fi es pengembangan
metode. Jika tujuannya adalah untuk cepat memperoleh antibodi agregat bebas untuk
tujuan penelitian, template berikut kemungkinan akan melayani tanpa modi fi kation untuk
antibodi IgG atau IgM. Menyeimbangkan kolom HA dengan 10 mM sodium fosfat, 20 mM
MES, pH 6,7; menerapkan sampel; mencuci dengan 10 mM sodium fosfat, 20 mM MES,
10% PEG-1000, pH 6,7; kemudian mengelusi dalam 30 CV linear gradient ke 500mm
sodiumphosphate, 10% PEG-1000, pH 6,7. CHT Tipe I direkomendasikan untuk IgG dan
Tipe II untuk IgM.
Meskipun kurang luas berlaku, klorida / fosfat / PEG gradien menawarkan
penghapusan lebih efektif dari protein sel inang, tercuci protein A, DNA, endotoksin, dan
virus dari antibodi monoklonal IgG. Pengguna dengan akses ke sistem robot throughput
yang tinggi dapat memilih untuk mengeksplorasi ruang lingkup penuh fosfat / klorida
kombinasi / PEG, tetapi template berikut menyediakan titik awal yang baik untuk
sebagian besar IgG. Menyeimbangkan dengan 10 mM sodiumphosphate, 20mMMES, pH
6,7; menerapkan sampel; mencuci dengan 10 mM sodium fosfat, 20 mM MES, 10%
PEG-1000; mengelusi dengan 30 CV linear gradien untuk 10 mM sodiumphosphate,
20mMMES, 10% PEG-1000, 2,0 M natrium klorida, pH 6,7. Jika IgG gagal untuk
mengelusi, meningkatkan konsentrasi fosfat.
persiapan PEG berat molekul tinggi yang efektif pada konsentrasi rendah, tetapi
PEG berat molekul rendah
227
lebih menguntungkan secara keseluruhan. Banyak polimer PEG dengan berat molekul
rata-rata 1000 atau kurang disetujui bahan aktif dalam formulasi parenteral ( US Food and
Drug Administration, 2008 ). polimer tersebut dapat dihapus dari
fi produk nal oleh dia fi filtrasi atau dialisis, sedangkan PEG-6000 memiliki kira-kira radius
hidrodinamik yang sama sebagai proteinwith globular berat molekul 50 - 100 kD ( Gagnon,
1996 ) Dan menghalangi metode eliminasi berdasarkan ukuran-. PEG dari berbagai
ukuran dapat dihapus dengan mengikat antibodi dalam langkah pertukaran ion berikutnya
dan memungkinkan PEG untuk fl ow melalui kolom. Untuk metode manufaktur, juga akan
menguntungkan untuk meminimalkan konsentrasi PEG, karena ini akan meminimalkan
viskositas dan berkontribusi untuk resolusi yang lebih baik serta tekanan operasi yang
lebih rendah. Residual PEG dapat diukur turun menjadi 0,5 ug / mg protein (0,0005% w:
w) oleh kompleksasi dengan barium iodida ( Skoog, 1979 ). Apakah metode yang
dipraktekkan dalam hubungannya dengan fosfat atau fosfat / klorida gradien,
penggunaan PEG kontribusi untuk pemulihan yang lebih baik dari antibodi non-agregat.
Sebagian besar metode kromatografi menderita kerugian dari resolutionwhen beban
protein besar diterapkan untuk kolom. Hal ini biasanya membutuhkan bahwa beberapa
antibodi non-agregat menjadi pengorbanan fi ced untuk memastikan penghapusan agregat
lengkap dari sisanya. PEG memungkinkan HA kolom yang akan diambil untuk kapasitas
tanpa mengorbankan penghapusan agregat. Di Gambar. 8 misalnya, pemisahan luas
7,5% PEG memungkinkan penolakan lengkap agregat tanpa puncak pemotongan pada
sisi trailing puncak non-dikumpulkan IgG; seluruh puncak dapat dipulihkan. PEG juga
dapat memfasilitasi pemulihan tinggi dalam aplikasi di mana tujuannya adalah untuk
antibodi non-agregat untuk fl ow melalui kolom pada aplikasi, sementara agregat dan
kontaminan lainnya dipertahankan.
Singkatnya, HA di hadapan PEG menyediakan metode yang memungkinkan
berharga untuk menghapus agregat dari IgG dan IgM antibodi monoklonal. Agregat
bebas antibodi dapat diperoleh pada kolom HA kecil dengan pengembangan metode
diabaikan untuk penelitian atau studi toksikologi, dan tanpa harus resor ke lambat,
alternatif rendahnya kapasitas SEC. Metode ini dapat lebih teliti dioptimalkan,
ditingkatkan, dan terintegrasi dengan puri lainnya fi metode kation untuk memenuhi
persyaratan manufaktur untuk antibodi dengan potensi komersial skala besar.
Referensi
Afeyan, N., Gordon, N., Mazaroff, J., Varaday, C., Fulton, S., Yang, Y., Regnier, F.,
1990. Arus melalui partikel untuk kinerja tinggi kromatografi cair biomolekul. J. Chromatogr. 519, 1.
Aoyama, K., Chiba, J., 1993. Pemisahan bentuk molekul mouse IgA dan
antibodi IgMmonoclonal oleh kromatografi cair kinerja tinggi pada manik-manik hidroksiapatit bola.
J. Immunol. Metode 162 (2), 201. Arakawa, T., 1985. Mekanisme peningkatan volume elusi protein
oleh
polietilen glikol. Anal. Biochem. 144, 267. Arakawa, T., Timasheff, S., 1985. Mekanisme poli
(etilena glikol)
interaksi dengan protein. Biokimia 24, 6756. Chicz, R., Regnier, F., 1990. Kinerja tinggi
kromatografi cair:
puri protein yang efektif fi kation dengan berbagai modus kromatografi. Metode Enzymol. 182, 392.
Coppola, G., Underwood, J., Cartwrigth, G., Hearn, M., 1989. Kinerja tinggi
kromatografi cair asam amino, peptida, dan protein. XCIII. Perbandingan metode untuk puri fi kation
mouse monoklonal autoantibodi imunoglobulin M. J. Chromatogr., A. 476, 269. Franklin, S., 2002.
Penghapusan agregat dari IgG 4 produk menggunakan CHT ™
hidroksiapatit keramik. Bio-Rad. Catatan tech 2940. Gagnon, P., 1996. Puri fi alat kation untuk
antibodi monoklonal. divalidasi
Biosystems, Tucson. ISBN: 0-9653515-9-9.
228 P. Gagnon / Jurnal Metode imunologi 336 (2008) 222 - 228
Gagnon, P., Godfrey, B., Ladd, D., 1996. Cara untuk memperoleh unik
selektifitas dalam pertukaran ion dengan penambahan polimer organik ke fase mobile. J.
Chromatogr., A. 743, 51.
Gagnon, P., Ng, P., Aberrin, C., Zhen, J., Dia, J., Mekosh, H., Cummings, L.,
puri Richieri, R., Zaidi, S., 2006. hidroksiapatit keramik berdasarkan fi Platform kation: penghapusan
simultan protein A pencucian, agregat, DNA, dan endotoksin. Bioproses Int. 4 (2), 50. Gagnon, P.,
Hensel, F., Richieri, R., 2008. Puri fi kasi IgM monoklonal
antibodi. Biopharm Int. 26 Mar suppl.
Giovannini, R., Freitag, R., 2001. Isolasi antibodi rekombinan dari sel
supernatan kultur: annular terus menerus terhadap batch dan kromatografi expandedbed.
Biotechnol. Bioeng. 73 (6), 522.
Gorbunoff, M., 1984a. Interaksi protein dengan hidroksiapatit. I. Peran
biaya protein dan struktur. Anal. Biochem. 136, 425. Gorbunoff, M., 1984b. Interaksi protein
dengan hidroksiapatit. II. Peran
kelompok asam dan dasar. Anal. Biochem. 136, 433.
Gorbunoff, M., Timasheff, S., 1984. Interaksi protein dengan
hidroksiapatit. AKU AKU AKU. Mekanisme. Anal. Biochem. 136, 440. Hjerten, S., 1959. Kalsium
kromatografi fosfat dari manusia normal
serum dan protein serum elektroforesis terisolasi. Biochim. Biophys. Acta 31, 216.
Josics, D., Loster, K., Kuhl, R., Noll, F., Reusch, J., 1991. Puri fi kasi
antibodi monoklonal oleh hidroksiapatit HPLC dan eksklusi ukuran HPLC, Biol. Chem.
Hoppe-Seylars 372 (3), 149.
Kawasaki, T., 1991. Hydroxyapatite sebagai kemasan kromatografi cair.
J. Chromatogr. 544, 147.
Luellau, E., Marison, W., von Stockar, U., 1997. hidroksiapatit Keramik: baru
alat untuk pemisahan dan analisis antibodi monoklonal IgA. Di:
Carondo, M., et al. (Ed.), Cell Technology Animal. Kluwer Academic Publishers, Belanda, p. 265.
Luellau, E., von Stockar, U., Vogt, S., Freitag, R., 1998. Pengembangan
Proses hilir untuk isolasi dan pemisahan monomer immunoglobulin, dimer, dan polimer dari
supernatan kultur sel.
J. Chomatogr., A. 796, 165.
Band, K., Ho, S., Henis, J., 1989. Ion kromatografi pertukaran protein: yang
Efek dari polimer netral dalam fase gerak. J. Chromatogr. 482, 133. Ng, P., Cohen, A., Gagnon, P.,
2006. monoklonal antibodi puri fi cationwith CHT.
Jenderal Eng. Berita 26, 14 http://www.genengnews.com/articles/chtitem. aspx? tid = 1833 .
Schubert, S., Freitag, R., 2007. Perbandingan hidroksi keramik dan fl uorapatite
dibandingkan resin berbasis G protein A / dalam isolasi antibodi manusia rekombinan dari
supernatan kultur sel. J. Chromatogr., A. 1142, 106. Skoog, B., 1979. Penentuan polyethylene glikol
4000 dan 6000 di
persiapan protein plasma. Vox Sang. 37, 345. Sun, S., 2003. Penghapusan berat highmolecular
agregat dari antibodi
persiapan menggunakan kromatografi hidroksiapatit keramik, presentasi lisan. Internasional ke-3
Hydroxyapatite Conference, Lisbon. Sun, S., 2007. kromatografi hidroksiapatit Keramik di antibodi
dan Fc-
puri protein fusi fi kation. Presentasi lisan. Tahunan ke-12 Waterside Conference, San Juan, Puerto
Rico.
Yamakawa, Y., Chiba, J., 1988. Kinerja tinggi kromatografi cair
tikus antibodi monoklonal pada manik-manik hidroksiapatit bola. J. Liq. Chromatogr. 11 (3), 665.
US Food and Drug Administration, 2008. Pusat Evaluasi dan Penelitian Obat, aktif Ingredient Pencarian
untuk Disetujui Obat Produk. http: // www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm.