PETUNJUK PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI KEDOKTERAN

DEVELOPMENT AND REPRODUCTIVE SYSTEM DISORDER

BLOK 4.3

DISUSUN OLEH:
TIM BAGIAN MIKROBIOLOGI

JURUSAN KEDOKTERAN UMUM

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2018

1
 Daftar Isi

Pengantar 3
Tata tertib 4
Materi praktikum 5
1. Identifikasi Staphylococcus saprophyticus 5
a. Pengamatan morfologi koloni S. saprophyticus 5
b. Pengecatan Gram S. saprophyticus 6
c. Uji Biokimia S. saprophyticus 8
i. Test Katalase 8
ii. Tes Koagulase 9
2. Identifikasi Candida albicans 10
a. Pengamatan morfologi C. albicans 10
b. Pengecatan Methylen Blue C.albicans 11
c. Pengecatan KOH C. albicans 12

Referensi 14
Lampiran 15
Format laporan praktikum 15
Lembar penilaian laporan praktikum 16

2
 Materi Praktikum

1. Identifikasi Staphylococcus saprophyticus

a. Pengamatan morfologi koloni Staphylococcus saprophyticus

Alat dan Bahan :

- Kultur S. saprophyticus dalam media Manitol Salt Agar (MSA)

Tujuan : pengamatan morfologi koloni S. saprophyticus

Prinsip :
Manitol Salt Agar (MSA) merupakan media selektif dan diferensial untuk isolasi dan
membedakan spesies patogen Staphylococcus. MSA mengandung 7,5% sodium klorida
dan manitol. Staphylococcus toleran terhadap kandungan 7,5% sodium klorida
sehingga dapat tumbuh di media MSA. Manitol merupakan gula berkarbon enam yang
jika difermentasi menghasilkan asam yang dideteksi dengan indikator phenol red
(Cappuccino, 2004)

Cara Pengamatan dan interpretasi :

- Pengamatan morfologi koloni S. saprophyticus dilakukan dengan cara
mengamati kultur bakteri yang telah disediakan
- Interpretasi: S. saprophyticus di media MSA pada umur 24h terbentuk
hanya sedikit zona warna kuning di sekitar koloni, bentuk bulat, smooth, cembung dan
mengkilap. Pada umur 48h zona kuning menjadi lebih luas (Brooks et al., 2013).

A B

Gambar 1. A. S. saprophyticus pada MSA inkubasi 24h B. S. saprophyticus pada

MSA inkubasi 48h

3
 Catatan: Beberapa spesies Staphylococcus (S. saprophyticus) selain S. aureus
merupakan manitol positif dan menghasilkan zona kuning di sekitar koloni pada
media MSA. Oleh karena itu diperlukan uji biokimia untuk mengidentifikasi S.
saprophyticus. Sekita 10% S. saprophyticus dapat memfermentasi manitol.

b. Pengamatan Hasil Pengecatan gram S. saprophyticus

Alat dan Bahan :

- Kaca obyek
- Jarum inokulasi
- Lampu spiritus
- Kertas isap
- Mikroskop
- Aquades steril
- Pewarna Dasar (primer) : larutan kristal violet
- Larutan Pengikat Warna Dasar (mordant) : larutan Iodium
- Larutan pencuci warna dasar : alkohol 96%
- pewarna pembanding (counterstain) : larutan safranin
- Isolat S. saprophyticus

Tujuan : Membedakan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif

Prinsip : prosedur pengecatan gram berdasarkan kemampuan mikroorganisme

dalam mempertahankan warna ungu dalam kristal violet (pewarna primer) selama
proses pelunturan warna dengan alkohol. Bakteri Gram negatif dapat dilunturkan oleh
alkohol, sehingga zat warna ungu dalam kristal violet hilang. Bakteri Gram positif tidak
luntur, sehingga warna ungu kristal violet dipertahankan. Safranin sebagai
“counterstain” merah digunakan setelah proses pelunturan untuk mengganti warna pink
pada bakteri Gram negatif yang luntur.

Cara Kerja :
1. Buat preparat ulas dari suspensi kuman S. saprophyticus
2. Lakukan fiksasi dengan hati-hati

4
3. Genangi preparat dengan kristal ungu (zat warna primer) dan dibiarkan selama
20 detik
4. Cuci dengan air mengalir selama 2 detik dan dikeringkan
5. Genangi preparat dengan kalium iodida (mordant) dan dibiarkan selama 1 menit
6. Cuci dengan alkohol aseton (95% ) sampai warna ungu hilang dan dikeringkan
selama 10-20 detik
7. Cuci dengan air mengalir selama 2 detik
8. Genangi preparat dengan safranin (counterstain) dan dibiarkan selama 20 detik
9. Cuci dengan air mengalir selama 2 detik dan dikeringkan
10. Amati preparat dengan mikroskop.(Benson, 2001)

Gambar 2. Alur pewarnaan Gram. (Benson, 2001)

Interpretasi: Kokus Gram positif, dinding sel berwarna ungu. Sel tersusun dalam
kelompok tak beraturan (kokus tunggal, berpasangan, tetrad, rantai).

5
 Gambar 3. Staphylococcus saprophyticus, Gram positif coccus

Catatan: kristal violet menyebabkan bakteri Gram positif dan Gram negatif berwarna
ungu setelah 30 detik setelah pewarnaan. Jika Iodine (mordant) dituangkan selama 1
menit maka kedua jenis bakteri ini tetap berwarna ungu. Fungsi mordant adalah
untuk kombinasi dengan kristal violet untuk membentuk senyawa yang relatif tidak
larut pada bakteri Gram positif. (Benson, 2001).

c. Uji Biokimia Staphylococcus saprophyticus

i. Test Katalase

Alat dan bahan

- Object glass
- Jarum ose
- Reagen Hidrogen Peroksida (H2O2) 3%
- Isolat Staphylococcus saprophyticus

Tujuan:
Uji ini digunakan untuk menentukan apakah bakteri tersebut merupakan bakteri
penghasil enzim katalase (katalase positif) atau bukan (katalase negatif)

Prinsip:
Uji katalase dapat menunjukkan bahwa enzim kalatalas e dimiliki oleh bakteri.
Enzim katalase akan mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen
yang ditandai dengan adanya gelembung udara. Jika bakteri tersebut

6
 menghasilkan banyak enzim katalase, maka gelembung yang terbentuk akan
banyak walalupun inokulum yang digunakan sedikit.

Cara Pengamatan dan Interpretasi :

1. Test katalase positif : pada object glass yang sudah diletakkan isolat bakteri
kemudian ditetesi 3% H2O2 . Amati terbentuknya gelembung udara (S.
saprophyticus)
2. Test katalase negatif : tidak terbentuk gelembung udara (Clostridium)

A B

Gambar 4. Tes Katalase; A. Katalase negatif ; B. Katalase positif (Mazza et

al., 2001)

ii. Pengamatan Hasil Test Koagulase

Metode : Tube test

Alat dan bahan :

1. Tabung reaksi
2. Lampu bunsen
3. Water bath
4. Jarum ose
5. Isolat S. saprophyticus

Tujuan : Untuk membedakan Staphylococcus yang koagulase positif (S.

aureus) dengan Staphylococcus yang koagulase negatif (S. saprophyticus)

Prinsip :

9
 Tes koagulase digunakan untuk membedakan Staphylococcus yang koagulase positif
dengan yang koagulase negatif . S. aureus memiliki dua bentuk koagulase yaitu
koagulase terikat dan koagulase bebas. Pada tube test yang dicari ialah adanya
koagulase bebas.

Cara Pengamatan dan interpretasi:

Tube test yang berisi plasma kemudian diinokulasikan beberapa loop isolat S.
saprophyticus. Tube test tersebut kemudian diinkubasi di water bath 37° C. Periksa
adanya koagulase setiap 30 menit.
Koagulase positif : Hasilnya positif kuat jika tabung tes dibalik, gumpalan plasma
tidak terlepas dan tetap melekat pada dinding tabung (S. aureus)
Koagulase negatif : tidak ada gumpalan plasma (S. saprophyticus)

Gambar 5. Hasil Tes Koagulase

Catatan :

Perlu ditekankan bahwa hasil tes koagulase valid hanya untuk bakteri gram positif seperti
Staphylococcus, karena beberapa gram negatif seperti Pseudomonas dapat menyebabkan
false positif.

2. Identifikasi Candida albicans

a. Pengamatan morfologi koloni Candida albicans

Alat dan Bahan :

- Kultur C. albicans dalam media Sabaroud Dextrose Agar (SDA)

10
 Tujuan : pengamatan morfologi koloni C. albicans

Prinsip : Sabaroud Dextrose agar (SDA) merupakan media selektif untuk

pertumbuhan yeast Candida albicans (Kayser et al., 2005).

Cara Pengamatan dan interpretasi :

- Pengamatan morfologi koloni C. albicans dilakukan dengan cara mengamati kultur
mikroorganisme yang telah disediakan
- Interpretasi: C. albicans pada media SDA : koloni berbentuk bulat, ukuran sedang,
halus mengkilat, cembung, tepian rata, warna yang mempunyai bau seperti ragi.

Gambar 6 . Koloni Candida albicans di media SDA

b. Melakukan Pengecatan Methylen Blue Candida albicans

Alat dan bahan
- Objek glass
- Jarum ose
- Mikroskop
- Methylen Blue
- Isolat Candida albicans

Tujuan :
Mengetahui struktur sel yeast

Prinsip:
Methylen blue sebagai pewarna sederhana mewarnai sel yeast sehingga morfologi
kapang dapat terlihat. Sel yeast yang terwarnai methylen blue adalah sel yeast yang
mati, sedangkan sel yeast yang hidup akan terlihat transparan.
11
 Cara Kerja :
1. Tempatkan spesimen atau isolat pada objek glass yang bersih
2. Teteskan methylen blue pada objek glass yang sudah ada isolatnya
3. Biarkan selama satu menit
4. Cuci dengan air mengalir kemudian keringkan
5. Amati di bawah mikroskop

Interpretasi : Terlihat C. albicans (ada pseudohifa) yang mati berwarna biru,

sedangkan yang masih hidup tampak transparan

Pseudohifa

Gambar 7. C.albicans berwarna biru

NB : semakin lama sel yeast terwarnai methylen blue, maka semakin banyak sel yeast yang
mati.

c. Melakukan pengecatan KOH Candida albicans

Metode : slide KOH

Alat dan Bahan :

1. 10% KOH
2. Gelas objek
3. Penutup gelas objek
4. Mikroskop
5. Ose
6. Api bunsen
7. Spesimen
 Tujuan : Mempelajari morfologi sel yeast Candida albicans

Prinsip :
Potassium hydroxide (KOH) memisahkan elemen jamur dari sel jamur utuh dengan
proses digesti protein debris dan membuang substansi semen yang menempel dengan
sel berkeratin sehingga memudahkan visualisasinya di bawah mikroskop.

Cara Kerja
d. Tempatkan spesimen seperti biopsi epiderma, kuku, goresan kulit atau
jaringan pada gelas objek yang bersih
e. Teteskan 10% KOH pada spesimen dan tutup dengan gelas penutup
f. Biarkan 5-10 menit.
g. Periksa di bawah mikroskop

Interpretasi : C. albicans berbentuk bulat, memiliki budding yeast dan pseudohifa

Gambar 8. Pengecatan KOH, Candida albicans (a.Pseudohifa;b.budding

yeast)
Catatan :

Jika spesimen tidak terlarut secara merata, sebaiknya dibiarkan beberapa saat dalam
petridish berisi kertas saring dan direndam dengan air di dasarnya. Pemanasan yang berlebih
harus dihindari sehingga tidak terbentuk Kristal KOH. Pemanasan dapat diganti dengan
menggunakan Dimethyl sulfoxide (DMSO). Campuran larutan 20% KOH dan setengah
bagian dari tinta parker dapat digunakan untuk pengecatan elemen jamur.(Cappuccino and
Sherman, 2001)
Referensi

Benson. (2001). Microbiological Applications Lab Manual, Eighth Edition: The

McGraw−Hill Companies.
Brooks, F.G., Janet S. Butel, L. Nicholas Ornston, 1996, Jawetz, Melnick dan Adelberg,
Mikrobiologi Kedokteran Edisi, 20. EGC
Cappuccino, J. G. and Sherman, N. (2001). Microbiology A Laboratory Manual. Sixth
Edition, 264-266.
Goldberg, S. (2011). Atlas Of Microbiology Retrieved from www.webmaster.net
Kayser, F. H., Bienz, K. A., Eckert, J. and Zinkernagel, R. M. (2005). Medical
Microbiology
Murray, P. R. (2013). Microbiology 101. Infectious Disease Board Review Course.