2012/12/18

Company
OH

OH
LOGO PENDAHULUAN
HO O
OH

OH

S1-Kimia (Ekstensi) ● Komponen aktif

Institut Pertanian Bogor
● Jenis, sumber & aktivitas komponen aktif
● Gejala internal dan eksternal
KIMIA BAHAN ALAM ● Pendugaan aktivitas

Company Company
LOGO LOGO Aktivitas
● Komponen (bio)aktif
Komponen/senyawa yang dapat mempegaruhi suatu organisme  Antibakteri  Mempercepat gugur
Contoh:  Antivirus daun
MAP 30: menghambat sel tumor
GAs : membantu perpanjangan batang  Larvasida  Antitumor
Vitamin E: menghambat penuaan  Antifeedant  Antioksidan
 Atraktan dan repelen  Antikoagulan
● Jenis/Golongan, sumber dan aktivitas komponen
 Inhibitor enzim  Antidiabetes
Sumber: Tumbuhan, mikroba, hewan, kapang, biota lautdsb
 Inhibitor  Hepatoprotektan
Jenis/Golongan: Alkaloid, terpenoid, steroid, flavonoid, protein, glukosida,
karbohidrat, asam organik perkecambahan  Menunjang
 pelangsing pertumbuhan
tanaman

Company Company
LOGO Gejala eksternal dan internal LOGO Gejala eksternal dan internal
 Gejala eksternal dan internal memengaruhi  Secara internal
komponen aktif
 Gejala eksternal
 Secara fisik tidak tampak dari luar
 Secara fisik mudah diamati  Mungkin tidak ada perubahan fisik secara
 Pertumbuhan tinggi, lebar daun, panjang akar, bobot badan, eksternal dan internal
dsb
 Gugur daun/bunga  Aktivitas enzim: perubahan kadar
 Mati senyawa tertentu seperti glukosa, fosfat,
 Lumpuh
 Menolak/menghindari
fenol, dll.
 Tertarik
 Proliferasi sel

1
 2012/12/18

Company Company
LOGO Pendugaan aktivitas LOGO Berdasarkan penggunaan di masyarakat

 Berdasarkan penggunaan di masyarakat  Sejenis tumbuhan /kerang/organisme lainnya

digunakan sebagai obat panas/penyakit kuning,
 Berdasarkan pengamatan di lingkungan
dsb
 Berdasarkan keinginan untuk eksplorasi  Panas ≈ demam ≈ mikrobe/bakteri: antibakteri???
sumber  Penyakit kuning ≈gangguan lever:
hepatoprotektan???
 Sejenis tumbuhan/kerang/organisme lain
biasanya dikonsumsi dan konsumen umumnya
 Awet muda: antioksidan???
 Langsing: antiobesitas???

Company Company
LOGO Berdasarkan pengamatan lingkungan LOGO Berdasar keinginan eksplorasi

 Suatu tumbuhan coba-coba: penapisan (skrining) awal

 Di tanah, di bawah & di sekitar tumbuhan tsb berdasarkan:
tidak ada tumbuhan lain: menghasilkan  Tanaman satu genus,
inhibitor perkecambahan???
 tanaman satu famili,
 Tidak dihinggapi/dimakan serangga/ulat, dsb:
 banyaknya terdapat di alam,
antifeedant???? Repelen???
 dll
 Banyak dirubungi organisme tertentu:
attraktan??? Contoh: uji aktivitas terhadap larva udang

Company Company
LOGO Uji aktivitas sebagai bagian dari analisis LOGO Tahapan analisis
 Tahap Analisis • Pengambilan
 Representatif
 Bebas kontaminan
 Saat uji dan tahap analisis contoh  Waktu/saat pengambilan
• Penyiapan contoh  Mengeringkan
 Bahan dan organisme uji • Ekstraksi
 Menggiling dan mengayak
 Ukuran butiran/serbuk: mesh
 Kontrol positif dan kontrol negatif komponen  Penting: mencegah kerusakan
• Pemisahan komponen: suhu
 Perhitungan Jumlah bahan dan organisme komponen  Pemilihan pelarut
 Pemilihan cara
uji • Identifikasi  Penting: mencegah kerusakan
komponen komponen: suhu

2
 2012/12/18

Company Company
LOGO Tahapan analisis LOGO Saat Uji dan tahap analisis
Contoh
 Pengendapan
Ekstraksi (berbagai pengekstrak, atau bertahap)
• Pengambilan  Komponen target
Ekstrak
Komponen pengganggu/pengotor
contoh  Uji Aktivitas (berbagai ekstrak)
 Ekstraksi pelarut-pelarut Ekstrak aktif
• Penyiapan
 Kromatografi kolom/planar Fraksinasi ekstrak aktif
contoh
 Reaksi spesifik
Fraksi n
• Ekstraksi  Kromatografi planar
Fraksi 1 Fraksi 2 Fraksi 3 Fraksi 4

komponen  HPLC/GC
Uji Aktivitas (berbagai fraksi)

• Pemisahan  Spektroskopi, UV, Vis, IR, MS,

Fraksi aktif Bisa > 1 fraksi
Fraksinasi/pemurian lanjut
komponen NMR
Diikuti dengan uji aktivitas
• Identifikasi  Gravimetri Komponen aktif
 Titrimetri Identifikasi Komponen aktif
komponen
Struktur /golongan senyawa komponen aktif

Company Company
LOGO Bahan Uji dan Organisme Uji LOGO Kontrol dalam analisis
 Bahan Uji: Kontrol positif
 Bahan/zat yang diuji aktivitasnya
 Ekstrak, fraksi, komponen yang telah diisolasi/diidentifikasi atau zat Bahan yang diketahui pasti memiliki aktivitas tertentu
murni sintetik
Misal: Lentrex (antirayap), streptomisin (antimikrobe)
 Organisme uji
Guna: Menunjukkan efek yang pasti
 Organisme (mikroba, larva, virus, tikus, tumbuhan, dll) yang menjadi
objek untuk pengujian bahan uji Pembanding aktivitas → kesetaraan
 Organismenya langsung, inang organisme, produk organisme
Kontrol negatif
 contoh
Bahan yang tidak diketahui aktivitasnya tetapi
 Uji aktivitas anti TMV:
diharapkan tidak memiliki aktivitas
 Bahan uji:
 Organisme uji; virus TMV: pengamatan pada inang yaitu tembakau
Misal: pelarut yang digunakan untuk ekstraksi/ melarutkan zat
Guna: Menentukan aktivitas yang sebenarnya dari bahan uji
 Uji aktivitas antifeedant:
 Bahan uji:
 Organisme uji: larva serangga/nyamuk
16

Company Company
LOGO Perhitungan Jumlah Bahan dan Organisme Uji
(termasuk media dan inang) LOGO Latihan
Dasar Pertimbangan:  Contoh tumbuhan dianalisis komponen aktif antifeedantnya. Contoh
Menjamin ketersediaan bahan uji maupun organisme diekstraksi dengan 3 pelarut didapat 3 ekstrak yang ketika diuji
sampai analisis komponen aktif selesai aktivitasnya hanya 1 ekstrak aktif. Ekstrak aktif difraksinasi
menghasilkan 2 fraksi dan hanya 1 yang aktif. Fraksi aktifnya
Cara Perhitungan difraksinasi lanjut dan diperoleh 6 fraksi, dan dua yang aktif. Pada
fraksinasi lanjutan untuk fraksi aktif satu didapat 2 fraksi dan dari
1. Jumlah bahan (zat uji, kontrol positif, kontrol negatif, media) fraksi 2 didapat 4 fraksi, yang masing-masing diuji aktivitasnya.
untuk setiap kali pengujian setiap pengujian dilakukan 3 ulangan dan digunakan 15 larva, 2 g
2. Jumlah organisme uji (larva, inokulan virus, tikus, inang dsb) pakan dan 1 ml bahan uji dengan konsentrasi 100 ppm(ekstrak), 50
ppm (fraksi hasil tahap 1); 30 ppm (fraksi hasil tahap 2 dan 20 ppm
3. Jumlah pengujian (fraksi hasil tahap 4). Kadar air tumbuhan contoh 70%, rendemen
▪ Pada berapa tahap analisis 7,5% (ekstrak kasar) 5%(fraksi tahap 1), 5% (fraksi tahap 2) dan 5%
(fraksi tahap 3). Hitunglah
▪ jumlah ekstrak/fraksi pada setiap pengujian analisis a. jumlah larva yang diperlukan sampai pengujian hasil tahap 3
b. Jumlah contoh tumbuhan
c. Jumlah pakan
17

3
 2012/12/18

Company Company
LOGO JAWABAN LOGO
b. Jumlah bahan uji pada uji aktivitas
serbuk
ekstraksi (4)= 2 Fr(A121+A122)x1 mLx20mg/L x3 =0,12 mg →  3ekx1mLx100mg/Lx3=0,9mg → (atau A=0,3mg) → A
A12=100/5x0,12=2,4 mg (yang difrakinasi) tapi
A B C
karena rendemen sama 5%, A12 yang difraksinasi total=Afr+Auji=21,560g+0,3mg=21,5603g → total ABC
Uji aktivitas (1)
=A15= 4,8mg(asumsi tidak ada fraksinasi lanjutan (karena rendemen sama)=3x21.5603g=64.6809g →
A pada A121 dst, hanya uji aktivitas)
fraksinasi
serbuk= 100/7.5x64,6809g=862.412g → Contoh
(4)= 4 Fr(A151-A154)x1 mLx20mg/L x3 =0,24 mg →
A15=100/5x0,24=4,8 mg(yang difraksinasi) tumbuhan = 100/(100-70)x862.412g=g = 2847.71g
A1 A2 (3)= 6 Fr(A11-A16)x1 mLx30mg/L x3 =0,54 mg
Uji aktivitas (2) → A1=100/5x0,54=11.8 mg  Catatan: yang dihitung adalah kebutuhan minimal tanpa
A15(4)=4,8mg → total A11-A16 (karena rendemen
A1
fraksinasi sama 5%) = 6xA15=6x4.8mg = 28.8 mg → memperhitungkan kemungkinan berkurang karena
A11 A12 A13 A14 A15 A16
A1=100/5x26.8 = 536mg (untuk fraksinasi) menempel pada wadah dsb yang biasanya tidak dapat
(2)=2frx1mLx50mg/Lx3=0,3mg→
Uji aktivitas (3) A=100/5x0,3mg=6mg → dihindarkan, sehingga perlu tambahan 25-50% →Contoh
A12 A15 A1=A1uji+A1fr=3mg+536=539mg karena rendemen = 1,5x2847,71g= 4,31 kg
fraksinasi sama 5% → Total A1+A2=2x539=1078mg →
(
A=100/5x1078mg= 21560 mg= 21,560 g
A121 A122 A151 A152 A153 A154

Uji aktivitas (4)

Company Company
LOGO LOGO EKSTRAKSI KOMPONEN

Catatan:
Ekstraksi komponen:
Pengambilan komponen dari contoh asalnya (biasanya dengan
Perhitungan tersebut tanpa memperhitungkan pergantian pakan. Setiap
menggunakan pelarut tertentu dan cara tertentu)
pergantian pakan maka zat uji digunakan yang baru
Bila pergantian pakan 4 x, maka total zat uji jadi 5x
Faktor pertimbangan:
a. Jumlah pengujian (4 tahap pengujian): 3 BU(1) + 2BU(2) + 6 BU (3)+6BU(4) = ● Sifat komponen
17 x 3 ulangan = 51
▪ Kepolaran Pemilihan pelarut
c. Jumlah pakan uji: Jumlah larva = 51x 15=765
▪ Ketahanan terhadap suhu Pemilihan cara (tanpa atau
Jumlah pengujian (4 tahap pengujian):= 3 BU(1) + 2BU(2) + 6 BU (3)+6BU(4) = dengan pemanasan)
17 x 3 ulangan = 51 ● Sifat pelarut
JUmlah pakan pada awal= 51x2g=104g
▪ Kepolaran Komponen polar larut dalam pelarut polar
JUmlah pakan pengganti (setelah pengamatan, biasa pakan diganti, bila
pergantian 4x, maka pakan penggganti = 4x 51x2g=416g
▪ Titik didih suhu ekstraksi & waktu penguapan
Jumlah pakan total (awal + pengganti) = 520 g
▪ Daya melarutkan Dipilih yang tinggi

Company Company
LOGO Cara ekstraksi LOGO ▪ Maserasi

● Tanpa pemanasan

▪ Untuk komponen yang tidak tahan dan yann tahan terhadap suhu tinggi ampas

Ampas dimaserasi ulang, 2-3x

▪ Cara: Maserasi (perendaman) 2-8
& disaring
jam

● Dengan pemanasan
▪ Untuk komponen yang tahan terhadap suhu tinggi ekstrak

▪ Cara: penggodogan (dengan atau tanpa refluks), sokslet

Ekstraks kasar (siap dipekatkan)
● Penyulingan (destilasi)

▪ Untuk komponen yang mudah menguap (misal: minyak cengkeh)

4
 2012/12/18

Company Company
LOGO ▪ Penggodogan (dengan refluks) LOGO ▪ Soksletasi
Sampel dibungkus Ditempatkan dalam
dengan kertas saring labu sokslet

Labu didih diisi

Air
keluar 2-6 jam pelarut & batu didih
Disaring, ampas
digodog ulang , Dihubungkan dengan labu
disaring dst soklet berisi sampel

Ekstrak kasar siap dipekatkan

2-8 jam

dipanaskan
Sirkulasi (Uap pelarut naik dan kemudian
Air
masuk tetesan pelarut melarutkan komponen
dalam sampel, turun sebagai ekstrak
pelarut
Batu didih ( 1sirkulasi = 1 ulangan ekstraksi); 6
sampel
sirkulasi/jam

Company Company
Perbandingan metode ekstraksi
LOGO LOGO ▪ Pemekatan ekstrak
Sifat Cara maserasi Pendggodogan Penggodogan Soskletasi - Perlu dihindarkan rusaknya komponen → suhu tinggi dihindari
tanpa refluks dengan refluks - Cara: penguapan biasa; rotavapor
Suhu Suhu ruang T>T ruang T>Truang T>Truang Keuntungan penggunaan rotavapor dibanding penguapan biasa:

komponen Tahan panas & Tahan panas Tahan panas Tahan panas
tidak tahan panas - Suhu rendah (adaya pompa vakum, tekanan udara rendah, TD larutan
turun; pelarut menguap pada suhu << TD normal) kemungkinan
Kemungkinan Sangat kecil Mungkin ada Mungkin ada Mungkin ada rusaknya komponen kecil sekali
rusaknya
komponen
Penggunaan Boros (3 ulangan Lebih boros dari Sama dengan Paling hemat (12 - Penguapan cepat (labu didih berisi ekstrak berputar; luas permukaan
pelarut = 3v) maserasi(>>3v) maserasi (3v) ulangan, v) bertambah; penguapan lebih cepat)

Kepekatan encer Lebih pekat dari Lebih pekat dari Paling pekat - Pelarut relatif murni diperoleh kembali ( uap pelarut didinginkan di kondensor,
ekstrak kasar hasil maserasi hasil maserasi (ulangan banyak, mengembun, jatuh ke labu penampung)
pelarut sedikit)
Rendemen sedikit >maserasi > maserasi >>> maserasi
Perhatikan: saat pemekatan dengan rotavapor, labu ekstrak harus tetap
terendam dalam air pada wadah yang berthewrmostat.

Company Company
LOGO Uji Aktivitas terhadap Lava udang LOGO Aktivitas Antibakteri
▪ Memberikan gambaran tentang kemungkinan aktifnya suatu bahan
Antibakteri:
▪ LC50 <1000 ppm; kemungkinan berpotensi sebagai antitumor
Zat yang menghambatnpertumbuhan bakteri dan digunakan untuk
▪ Bahan uji: ekstrak, zat murni dsb
mengobati infeksi oleh bakteri
Organisme uji : larva udang (Artemia salina)
Media: air laut
pengamatan : jumlah larva yang mati; LC50 Cara kerja/efek antibakteri

▪ Cara pengujian Bakterisidal : membunuh bakteri

Dalam vial atau multiwell

Bakteriostatik: menghambat pertumbuhan bakteri
Vial diisi 5 mL air laut/multiwell diisi 2,5 mL air laut
Inkubasi, 25C Perubahan efek: zat antibakteri yang bakteriostatik pada konsentrasi
15 larva dimasukkan dalam vial/multiwell 2X24 jam rendah, bisa menjadi bakterisidal pada konsentrasi tinggi
Dihitung jumlah larva mati n hidup Hubungan log C & jumlah yang
mati

5
 2012/12/18

Company Company
LOGO Uji Aktivitas Antibakteri LOGO Metode gores.

●Cara/sistem kerja: aseptik steril, bebas dari kontaminan Pinggan petri berisi media yang dicampur bahan
uji/kontrol positif/kontrol negatif
▪ Peralatan, media , bahan uji: steril
▪ Cara sterilisasi:
Bakteri uji diinokulasikan dengan cara
Alat & media: autoclave, 127C, 20menit mnggoreskannya dengan ose
Bahan uji: disaring dengan filter 0,2µm

Mengapa bahan uji tidak disterilkan dengan autoclave? Inkubasi dalam inkubator selama 2x24 jam, suhu 37C, RH90%
● Diperlukan: bahan uji; kontrol positif, kontrol negatif, bakteri uji, media
a Goresan tetap ≈ bakteri tidak tumbuh →
● Metode Umum bahan uji aktif sebagai antibakteri
- Bahan uji dicampur media, kemudian bakteri diinokulasi b Goresan hilang & media menjadi keruh ≈
- Bakteri dicampur media, kemudian bahan diaplikasikan bakteri tumbuh → bahan uji tidak aktif
sebagai antibakteri
a b
● Jenis Metode

Metode gores, metode cakram, metode sumur Pertanyaan:

Apakah kelemahan(kekurangan) dan keunggulan metode gores?

Company
LOGO Metode Cakram.
Petri dish berisi campuran media+ bakteri
2
1
3
Bulatan kertas saring diolesi/dicelup kontrol positif (1),
5 4
kontrol negatif (2), bahan uji (3,4 dan 5)
Inkubasi dalam inkubator selama 2x24 jam,suhu 37C, RH 90%
Pengamatan: pembentukan zona bening ≈ bakteri tidak
tumbuh→ bahan uji aktif sebagai antibakteri
-Kontrol positif konsentrasi tertentu (1): zona bening = 3cm
-Kontrol negatif (2): tidak ada zona bening
-Bahan uji 1, konsentrasi tertentu (3): tidak ada zona bening ;
bahan tidak aktif
- Bahan uji 2, konsentrasi tertentu (1): zona bening = 3cm
→ pada konsentrasi yang diujikan, aktivitasnya setara dengan
kontrol positif … ppm)
- Bahan uji 3; konsentrasi tertentu (5): zona being = 1,5cm
→ aktivitas bahan uji 3 < aktivitas bahan uji 1
Company
LOGO
Pertanyaan:
Apakah kelemahan & keunggulan metode cakram dibanding metode
gores?
Pengujian untuk perbandingan aktivitas :
▪ berbagai bahan uji:
Konsentrasi setiap bahan uji dibuat sama, misalnya 20 ppm → perbedaan
diameter zona bening disebabkan oleh perbedaan aktivitasnya
▪ kesetaraan aktivitas dengan kontrol positif:
Konsentrasi standar (kontrol,positif) bervariasi, atau konsentrasi bahan uji
bervariasi → konsentrasi yang menghasilkan diameter zona bening yang
sama merupakan konsentrasi kesetaraan.
Konsentrasi Hambat Minimum
Konsentrasi bahan uji terendah yang masih menghasilkan zona
bening
Dilakukan pengenceran bertahap: 2x; 4X dst, sampai diperoleh
zona bening terkecil.

Company Company
LOGO Metode Sumur. LOGO
Perbandingan metode uji antibakteri
Petri dish berisi media agar + bakteri Parameter Metode gores Metode cakram Metode sumur

Sumur (dibuat dengan melubangi media tetapi tidak Bahan uji Banyak Lebih hemat >cakram
sampai ke dasar petri) yang kemudian diisi bahan
(kontrol positif, kontrol negatif, bahan uji) Organisme uji sedikit banyak banyak

Inkubasi 2x24 jam Diamati dan diukur diameter zona bening yang Bahan banyak sedikit sedikit
37 C, RH 90% terbentuk, seterusnya seperti pada metode penunjang
cakram Peralatan banyak sedikit sedkit

Pengamatan mudah mudah mudah

Pertanyaan: aktivitas

Jika semua yang diperlukan tersedia sehingga anda bisa Membandingkan sulit mudah mudah
menggunakan ketiga metode tersebut, metode apa yang akan aktivitas
anda pilih? Mengapa? Bila perlu, dengan perhitungannya. Pengerjaan mudah mudah Sedikit sulit

6
 2012/12/18

Company Company
LOGO LOGO UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

ANTIOKSIDAN
● Zat yang menghambat/mencegah oksidasi
→ menghambat kerusakan lemak/minyak akibat oksidasi
Oksidasi Lemak: Inisiasi; propagasi; terminasi
Inisiasi : RH + I →R• + H + I(inisiator)
Propagasi : R• + O2 →ROO•
ROO• + RH → ROOH + R•
Terminasi: ROO• + ROO• →ROOR + O2
R• + R• → RR
ROO• + R•→ ROOR

Menghambat oksidasi zat yang mudah teroksidasi walau

dalam konsentrasi rendah

38

Company Company
LOGO LOGO Teknik Uji Aktivitas Antioksidan
● Penggolongan: Metode Penangkapan Radikal DPPH
• Antioksidan primer: menghentikan reaksi berantai pembentukan DPPH (difinil pikrill hidrazil) :
radikal • radikal bebas yang stabil
• Antioksidan sekunder/antioksidan preventif: mencegah reaksi
oksidasi /mengurangi laju reaksi awal (mencegah kerja faktor- • berwarna ungu dalam larutan, λmaks 515-525 nm
faktor yang mempercepat oksidasi (misalnya Fe, Cu dsb) • dapat ditangkap oleh reduktor yang memberikan atom H →
bentuk terreduksi (difinil pikril hidrazin) yang tidak
● Mekanisme kerja antioksidan
berwarna, dengan reaksi:
- Melepaskan Hidrogen
- Melepaskan elektron
NO2 NO2
- Membentuk kompleks dengan lemak
• •
O2N N N + RH O2N H N + R
● Contoh antioksidan N

Vitamin E (tokoferol), vvitamin C, karotenoid NO2 NO2

BHA (Butylated Hydroxy Anisol); BHT

Difinil pikril hidrazil antioksidan Difinil pikril hidrazin
39 (ungu) (tidak berwarna) 40

Company Company
LOGO Cara Uji LOGO Metode reduksi Cerium (IV)
Senyawa antioksidan bisa berperan sebagai pemindah elektron.
Bahan uji + → perusakan struktur oleh oksidator kuat seperti Ce(IV)sulfat
DPPH dalam metanol Inkubasi
A517 ? = A sampel
tidak terjadi, karena Ce(IV) menyerang antioksidan
30menit, 37oC

• Ce(IV) : menyerap uv λ 320 nm

Inkubasi
DPPH dalam metanol A517 ? = A blanko • Ce(IV) bereaksi dengan antioksidan → Ce(III) tidak menyerap
30menit, 37oC
pada 320 nm → serapan pada 320 nm menurun

% penangkapan radikal DPPH = (Ablangko – Asampel)/Ablangko x 100%

Perbandingan aktivitas : dengan tokoferpl, BHT dsb

41 42

7
 2012/12/18

Company Company
Cara Uji Metode pemucatan β-karoten (carotene
LOGO LOGO
bleaching)
Bahan Uji + Inkubasi Prinsip: meminimalkan kehilangan β-karoten dalam
A320
Ce(IV)sulfat 30 menit suhu ruang emulsi karena oksidasi asam linoleat yang
dalam H2SO4
menghasilkan radikal
Inkubasi
Ce(IV)sulfat A320
dalam H2SO4 30 menit suhu ruang oksidasi
sebagai blangko Asam linoleat Radikal

β-karoten + radikal Ikatan ganda Warna

Kapasitas reduksi = (Ablangko- Asampel )/Ablangko x 100% berkurang memudar

43 44

Company Company
LOGO Teknik UJi LOGO Pengujian

- 250 uL emulsi karotena-asam linoleat dimasukkan ke

dalam sumur
- 30 uL larutan sampel (ekstrak, dsb) 1000 ppm/ BHT
(kontrol positif) dalam metanol ditambahkan
Pembuatan emulsi β-karoten
- 30 uL metanol pada sumur berbeda (kontrol negatif)r
- 2 mg karoten dilarutkan dalam 10 mL kloroform
- 1mL larutan karoten dalam kloroform + 20 uL asam - Diinkubasi pada 50oC dalam waktu bervaiasi 0-195
linoleat + 200 mg Tween-40 menit
- Campuran diuapkan (vakum, 450C) - Diukur A492
- Ditambahkan 50 mL air beroksigen; diaduk kuat → - Dibuat krva hubungan waktu dengan A
terbentuk emulsi (harus selalu disiapkan segar)
- Zat Aktif: kurva relatif mendatar/kemiringan kecilr

45 46

Company
Elzawary et al. 2006
Company Metode Tiosianat
LOGO LOGO
DPPH EC50 (mg/mL)

0.8 –
0.7-
0.6 - Prinsip: asam linoleat teroksidasi menghasilkan radikal bebas;
0.5 –
0.4- radikal bebas mengoksidasi Fe2+ menjadi Fe3+ yang
0.3-
0.2-
bereaksi dengan SCN membentuk Fe(SCN) 3 yang
0.7 –
0.1- berwarna merah→ A500 ?
1 2 3
DPPH EC50 bagian tanaman alpinia
Absorbansi

0.6 – 1 - 2.51% asam linoleat dalam 99.9% etanol

0.5- 2 - Sampel dilarutkan dalam air/etanol
0.4 –

0.3 – 3 - Buffer fosfat 0,02M pH 7

4
0.2 -
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 195
- Ferroklorida (FeCl2 0,02M dalam HCl 3,5%)

Gambar 1: Aktivitas antioksidan ekstrak etilasetat berbagai bagian - Ammonium tiosianant (NH4)SCN 30%
tanaman Alpinia & BHT diukur dengan metode pemucatan β-
karoten
1.BHT 2. daun segar c, rimpang 4. kontrol negatif

47 48

8
 2012/12/18

Company Company
Penentuan Fraksi Aktif Antioksidan dengan
LOGO LOGO cara Bioautografi
4 mg sampel
4mL etanol 99.5% Sampel → diekstraksi → ekstrak difraksionasi→fraksi aktif?
Inkubasi Campuran A
4,1mL asam linoleat 2,51%
8 mL buffer fosfat 40oC, gelap Cara:
3,1 mL akuades
S1 S2 S3 S1 S2 S3
f f S1 S2 S3
f

0,1 mL campuran A
9,7 mL etanol 75% 3 menit A500
elusi Semprot DPPH
0,1 mL (NH4)SCN 30%
0,1 mL FeCl2 0,02M dalamHCl

s o o o s o
s

Sampel 1: Fraksi 2 & 4 aktif

Pengukuran dilakukan setiap 24 jam sampai A kontrol Sampel 2: Fraksi 1, 3, 4 aktif
maksimum Sampel 3: Fraksi 2 aktif
49 50

Company Company
UJI AKTIVITAS ANTITUMOR Cara Uji:
LOGO LOGO
Sel normal: berproliferasi (memperbanyak diri) Cara Kerja: aseptik
Tumor: sel yang berproliferasi tak terkendali 1. Subkultur sel tumor lestari
Zat Antitumor: menghambat pertumbuhan/proliferasi sel tumor
Sel lestari dari penyimpanan (-190C)
Untuk uji aktivitas diperlukan: bahan & alat setelah thawing ditumbuhkan pada media
Sel tumor lestari Antikapang (fungizon) Antibiotik (gentamisin) DMEM + FCS + gentamisin + fungison
Serum FCS Buffer (fosfat) Media (DMEM)dsb
Botol kultur multiwell plate Inkubator CO2 Botol kultur
Sentrifuge 103-104rpm mikroskop mikropipet, autoclave
Inkubasi CO2
& 0-30oC hemositometer alat gelas, neraca 80% konfluens panen
37C, , 2-5 hari
Sel lestari (Cell line): sel yang dikultur terus menerus melalui
puluhan subkumtur (passage, pasase), mempunyai sifat tertentu
Kultur ulang Sampai 5 x subkultur
Kultur sel:
Monolayer ; sel hidup melekat pada dinding wadah, sel mati tidak (HeLa) Sel stabil, siap untuk jadi sel uji
Multilayer: sel hidup dan sel mati tidak melekat pada dinding (K512)
51 52

Company Company
LOGO 2. Uji aktivitas zat LOGO Menghitung sel

Inkubasi CO2
37 C, 1-5 hari
Multiwell 24 lubang
Sel tumor 5x102/mL dalam DMEM + FCS
+gentamisin + fungison +/- bahan uji 80% konfluens
hemositometer

Dihitung jumlah sel yang hidup dan Ditetesi suspensi sel

Panen
yang mati dengan hemasitometer
Diamati dengan mikroskop,
pembesaran tertentu ….x,
pada ¼ bagian

53 54

9
 2012/12/18

Company Company
Perhitungan Sel hidup & sel mati % viabilitas, %
LOGO LOGO Eosin Y
proliferasi

Prinsip: pewarnaan/fluoresensi dsb, respon sel hidup bebeda
dengan sel mati, sehingga sel hidup dapat dibedakan
dari sel mati
Pengamatan: dengan mikroskop
Zat pewarna
Tripan blue
Sel mati menyerap tripan blue→ sel berwarna biru
sel hidup mengeksklusi tripan blue→sel tetap bening
Bila terlalu lama, sel hidup juga akan menyerap
tripan blue, tidak bisa dibedakan dari sel mati
Perhitungan harus selesai dalam 3 menit
55
- Sel hidup tidak meyerap (mengeksklusi) eosin, tetap bening
- Sel mati menyerap eosin, berwarna merah
- Pengamatan : warna merah tidak setajam warna biru (dengan tripan
blue)
- Kestabilan sel hidup: bisa bertahan 10 menit , batas pengujian
lebih lama dari tripan blue
Nigrosin
- Sel hidup mengeksklusi nigrosin; bening
- Sel mati menyerap nigrosin; coklat kehitaman
- Bila mikroskop kurang fokus, sel hidup n sel mati hampir tidak
dapat dibedakan; perlu keahlian menggunakan mikroskop
- Penyerapan zat ke sel, butuh waktu : 5-10 menit
- Stabilitas sel : lama (beberapa jam)
56

Company
LOGO
Fluorescein diasetat
- Diserap oleh sel hidup maupun sel mati, tetapi hanya dihidrolisis
dalam sel hidup sel hidup berfluoresensi hijau
- Penyerapan cukup lama, ditunggu 15 menit pada suhu kamar
sebelum dihitung/diamati dengan mikroskop fluorosensi
Akridina jingga – Ethidium bromida
- Sel hidup akridina jingga, dan sel mati menyerap ethidium bromida
- Sel hidup berfluoresensi hijau dan sel mati berfluoresensi jingga
- Akridina jingga dan ethidium bromida sangat mutagenik
- Akridina jingga kurang stabil pada suhu kamar
57
Company
LOGO Perhitungan % proliferasi dan % viabilitas
- Dihitung jumlah sel hidup, sel mati dan sel total pada masing2 ¼
bagian hemositometer (untuk semua perlakuan Kontrol, bahan uji)
- Dihitung rerata jumlah sel hidup, sel mati dan sel total dari 4
bagian hemositometer untuk semua perlakuan kontrol, bahan uji
- Diperhatikan faktor pengenceran suspensi sel
Jumlah sel total pada perlakuan
% proliferasi = ---------------------------------------- x 100%
Jumlah sel total pada kontrol
Jumlah sel hidup pada perlakuan/kontrol
% viabilitas = ---------------------------------------------------- x 100%
Jumlah sel total pada perlakuan/kontrol
58

Company Company
LOGOUJI AKTIVITAS ANTIVIRUS TMV (Tobacco Mosaic Virus)
LOGO
Menyerang organisme lain ●Menyerang tanaman tembakau & beberapa
Virus: (manusia, hewan, tumbuhan) anggota Solanaceae

● Gejala internal serangan TMV

Pada tumbuhan yang diserang:
Virus selalu ada Pembentukan kalosa di bagian tengah batang
Tumbuhan diperas
● Gejala eksternal serangan TMV
Perasan tumbuhan mengandung virus
Pembentukan lesio lokal pada daun
Sumber inokulan

10
 2012/12/18

Company Metode
Company setengah daun
LOGO Teknik uji aktivitas antiTMV LOGO
◊ Setiap helai daun dibagi 2 lokasi menurut tulang daunnya
● Organisme TMV (inokulan dibuat) ◊ Setengah bagian diolesi bahan uji (P), setengah bagian tidak (K)
uji: Pembuatan inokulan ◊ Inokulan diinokulasikan pada seluruh daun(setelah diampelas dsb)
◊ Tanaman sehat diinokulasi virus TMV ◊ dihitung jumlah lesio pada bagian P dan K
◊ setelah 5 hari tanaman diperas
◊ Perasan tanaman siap menjadi inokulan
untuk pengujian
● Inang: Tanaman tembakau sehat P
P

dengan 6 daun terbuka K

K
● Inokulasi virus pada tanaman inang 5 hari

◊permukaan bawah daun diampelas karborundum

◊Zat uji dioleskan ke permukaan daun inokulan

◊ Inokulan virus dioleskan

% penghambatan lesio
● Pengamatan: Jumlah lesio lokal (setelah 1- 5 hari )
= (K-P)x100%/K

Company Company
LOGO Uji cara kerja zat aktif antitmv
LOGO
Data hasil pengamatan uji aktivitas antivirus
Perlakuan Rerata jumlah lesio lokal pada ulangan* Kerja antitmv
1 2 3 4 5
Non sistemik: bekerja hanya pada lokasi aplikasi
Kontrol 79,3 75,2 80,4 80,1 78,8
Aplikasi harus pada bagian yang
Bahan UJi 9,6 9,2 10,6 9,7 10,1 diserang/akan dilindungi
*rerata dari 6 daun/tanaman; 1 tanaman = 1 ulangan
Sistemik: Bekerja tidak hanya pada lokasi aplikasi,
tapi juga pada tempat lainnya
% penghambatan pembentukan lesio:
Dapat dibawa oleh cairan tumbuhan
Ulangan 1= (79,3-9,6)x100%/79,3 = 87,89% Larut dalam air
Ulangan 2= (75,2-9,2)x100%/75,2 = 87,76%
Bisa diaplikasikan lewat perakaran
(tidak harus langsung pada tempat
Ulangan 5= (78,8-10,1)x100%/78,8 = 87,18% yang diserang/akan dilindungi)

Company Company
Teknik pengujian cara kerja
LOGO LOGO
Data hasil pengamatan uji cara kerja antitmv

• Inang: tanaman setembakau sehat dengan

12 daun terbuka Zat Aplikasi Rerata jumlah lesio lokal pada ulangan dan posisi daun
Percobaan 1 Uji
bahan uji
pada 1 2 3 4 5

• permukaan bawah 6 daun atas diampelas, daun:

a b a b a b a b a b
diberi perlakuan bahan uji dan inokulan A Atas 13,9 14,5 15,1 15,1 14,8 14,1 16,1 15,3 13,9 14,2
Bawah 14,1 15,2 14,8 15,1 13,9 14,5 15,2 14,8 13,2 14,9
• 6 daun bawah diampelas dan diberi inokulan B Atas 7,9 75,2 9,2 72,1 8,9 79,6 8,1 74,5 8,9 79,8
tanpa bahan uji Bawah 70,5 8,1 70,5 8,9 78,1 8,1 72,9 10,2 75,2 9,2

Percobaan 2 C Atas 23,3 24,5 21,9 22,4 19,9 19,2 20,1 19,8 21,1 21,4
Bawah 25,6 25,2 22,3 22,4 20,2 18,9 20,9 20,1 21,3 21,6
• permukaan bawah 6 daun atas diampelas,dan
diberi inokulan tanpa bahan uji 1. Apakahzat uji A, B, dan C bekerja secara sistemik
• 6 daun bawah diampelas dan diberi bahan uji 2. JIka dibuat perlakuan kontrol (tanpa bahan uji),
dan inokulan berapakah rerata jumlah lesio lokalnya? Jelaskan.
Pengamatan
Jumlah lesio lokal pada 6 daun atas dan 6 daun
bawah untuk kedua percobaan

11