BAHAN DAN METODE

Isolasi kultur bakteri: Semua sampel dikumpulkan dari tanah dekat penyamakan kulit
limbah ditemukan di Penyamakan Asia Timur, Hazaribagh, Dhaka, Bangladesh. Sampel
disimpan dalam botol kaca steril untuk analisis lebih lanjut. Untuk isolasi bakteri, sampel tanah
seri diencerkan dan disebar di piring agar skim susu. Pada awalnya, sampel dicampur larutan
NaCl 0,85% steril dan dihomogenkan menggunakan vorteks. Dengan Sepuluh kali pengenceran
serial, diikuti dengan menyebarkan 0,1 mL dari masing-masing pengenceran secara aseptik pada
skim milk agar piring dengan menggunakan penyebar kaca. Pelat diinkubasi pada 37 0C dalam
inkubator selama 24 jam. Setelah 24 jam inkubasi, zona bening diamati dan pola pertumbuhan
diferensial . Bakteri ditemukan di setiap piring agar susu skim. Dalam proses ini, sejumlah kecil
inokulum dari masing-masing koloni tunggal morfologis berbeda, melesat ke atas
starch agar plate dan diinkubasi pada 37 0C selama 24 jam.

Skrining primer bakteri penghasil α-amilase dan analisis komparatif α-

Aktivitas amilase: Isolat bakteri disaring untuk sifat amilolitik oleh pati untuk uji hidrolisis pada
plat agar pati (Atlas et al. , 1995). Isolat mikroba adalah bergaris sebagai garis di piring agar pati
dan kemudian piring diinkubasi pada 37 oC. untuk 24 jam Setelah inkubasi, piring dilumasi
yodium Lugol 1% yang baru disiapkan larutan. Kehadiran warna biru gelap di piring
menunjukkan hasil negatif sementara zona bening hidrolisis yang mengelilingi pertumbuhan
menunjukkan hasil positif. Jadi, isolat yang menghasilkan zona hidrolisis yang jelas dianggap
sebagai produsen α-amilase dan diameter zona aktivitas dan koloni diukur dalam satuan mm.
Zona khusus dihitung sebagai rasio diameter zona bening dan diameter koloni.

Penilaian aktivitas ekstraseluler enzim: Isolated strain bakteri dikultur

dalam 50 ml medium cair pati ke dalam labu 250 ml pada 37 ° C selama 24 jam pada 120 rpm
agitasi. Sel dipanen dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 15 menit dan supernatannya
dipindahkan ke tabung segar. Kemudian, 20 µL supernatan dipindahkan ke pati agar
piring dengan antibiotik. Setelah 24 jam, zona aktivitas diukur dalam satuan mm dan
Identifikasi isolat bakteri α-amilolitik ampuh : Serangkaian konvensional tes biokimia
dilakukan untuk identifikasi genus strain bakteri menurut Bergey's Manual of bacteriology
sistemik (Sneath et al. , 1986). Identifikasi molekuler juga dilakukan dengan sekuensing gen 16S
rRNA. Dua universal primer untuk amplifikasi gen 16 rRNA digunakan untuk tujuan PCR. 27F
(AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG) digunakan sebagai primer forward sementara U1492R
(GGTTACCTTGTTACGACTT) digunakan sebagai primer terbalik. Gen rRNA 16s adalah
diurutkan menggunakan ABI 3700 Genetic Analyzer di Laboratorium Dasar 1 SdnBhd,
Malaysia. Urutan gen rRNA 16s diselaraskan menggunakan perangkat lunak BioEdit7.2. Itu
sekuens sampel dianalisis menggunakan BLAST-NCBI.

Persiapan inokulum dan fermentasi terendam untuk produksi α-amilase: Untuk

persiapan inokulum, 50 ml media kaldu nutrisi dipindahkan ke masing-masing 250 ml
labu Erlenmeyer 250 ml yang dicolokkan dengan kapas, dan disterilisasi dalam autoklaf selama
15 menit. Setelah pendinginan suhu kamar, 1 ml kultur bakteri secara aseptik dipindahkan ke
masing-masing labu. Labu dimasukkan ke dalam inkubator 37 ° C selama 24 jam sambil diaduk
pada 150 rpm. Produksi amilase dilakukan di media basal steril (Asgher et al. , 2007) (0,1%
KH 2 PO 4 , 0,25% Na 2 HPO 4 , 0,1% NaCl, 0,2% (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,005% MgSO 4 .7H 2 O,
0,005%
CaCl 2 ) mengandung 0,2% tryptone dan 1% pati terlarut. PH awal medium adalah
disesuaikan dengan 7.0. Erlenmeyer flasks (250 ml) mengandung 50 ml medium diinokulasi
dengan 1 ml kultur semalam dan diinkubasi pada 37 ° C dalam inkubator pengocok rotari di
150 rpm selama 48 jam.

Pemisahan sel dari media kultur: Setelah inkubasi, kaldu yang difermentasi adalah
disentrifugasi pada 4 ° C, 8000 rpm selama 15 menit dalam centrifuge pendinginan. Supernatan
dikumpulkan dan diawetkan atau digunakan untuk uji enzim.

Penentuan aktivitas α-amilase: Uji untuk α-amilase dilakukan menggunakan metode 3, 5-

dinitrosalicylic acid (DNS) (Miller, 1959) dan aktivitas α-amilase diukur (Bernfeld, 1955). Pada
awalnya, 0,5 g larutan pati 0,5% disiapkan lalu melarutkan 0,5g pati larut dalam 100 mL 0,02 M
buffer natrium fosfat (pH 6,9) (Gomes et al ., 2001). Kemudian 0,5 mL larutan enzim diencerkan
menjadi 1 mL air suling dan 0,2 mL larutan kanji ditambahkan dan diinkubasi pada 37 0 C
selama 5 menit. Kemudian, 3 mL DNS reagen ditambahkan kemudian. Larutan disimpan dalam
air mendidih pada 90 0 C atau 15 menit dan kemudian di bawah air keran yang mengalir untuk
mendinginkan pada suhu kamar. Selanjutnya, 10 mL air suling ditambahkan ke dalamnya.
Absorbansi diukur pada 540 nm dengan UV-Vis spektrofotometer (Optizen pop, Mecasys Co.,
Ltd., Taiwan). Satu unit (U / mL) dari aktivitas α- amilase didefinisikan sebagai jumlah α-
amilase yang dibutuhkan untuk membebaskan 1 mg
mengurangi gula (maltose) dari pati / menit, di bawah kondisi pengujian.

Pengaruh periode budidaya untuk produksi α-amilase: Efek periode budidaya pada produksi
α-amilase diselidiki dengan melakukan fermentasi selama 72 jam pada 37 0 C sebagai ukuran
optimalisasi kondisi budaya. Sampel dikumpulkan setiap 24 jam untuk mengamati produksi
enzim. PH dan volume medium adalah 7,0 dan 50 ml masing-masing dan pengujian dilakukan
dengan periode reaksi 5 menit.

Karakterisasi parsial dari α-amilase mentah: Aktivitas α-amilase ditentukan dengan konversi
pati menjadi gula sederhana. Larutan segar dari 0,5% pati disiapkan dengan melarutkan 0,5 g
pati larut dalam 0,02 M buffer natrium fosfat (pH 6,9) untuk memperoleh 100 mL larutan. 0,2
mL pati yang sudah siap dipindahkan ke dalam tabung reaksi bersama 0,5 ml α-amilase dan
diinkubasi dengan sesuai. Jumlah gula pereduksi itu ditentukan oleh metode DNS (Miller, 1959).
Untuk menyelidiki waktu inkubasi optimal dari α-amilase, reaksi dilakukan pada interval waktu
yang berbeda (5, 10, 15, 25, 30 dan 60 min) dan aktivitas enzim dicatat. Selain itu, untuk
penentuan optimal suhu untuk aktivitas maksimum α-amilase mentah, sampel enzim
diinkubasi selama 5 menit pada suhu mulai dari 30 ° hingga 90 ° C. Sekali lagi, pH optimum
pada aktivitas minyak mentah α-amilase ditentukan menggunakan sistem bufer yang berbeda
dalam pH 6,0- 10,0 (0,2 M buffer glycine-NaOH dan 0,2 M buffer natrium fosfat). Maka enzim
aktivitas ditentukan dan uji dilakukan selama periode inkubasi 5 menit.

HASIL DAN DISKUSI

Isolasi strain bakteri dan skrining primer dari produser α-amilase: produksi industri enzim
dan aplikasi bioteknologinya, kuncinya adalah selalu memilih mikroorganisme yang tepat.
Isolasi dan pemilihan sesuai organisme sangat penting untuk produksi amilase ekstraseluler.
Anggota dari genus Bacillus ditemukan menjadi produsen yang lebih baik dari berbagai jenis α-
amilase (Nusrat dan Rahman , 2007). Dalam hubungan ini, 36 isolat bakteri ditemukan pada
awalnya skrining dari sampel tanah limbah penyamakan kulit. Di antara mereka, 8 dari isolat
ditemukan menjadi produksi protease sementara 12 dari mereka mampu menghasilkan α-
amilase. Menariknya, semua produsen protease memiliki kemampuan menghasilkan α-amilase
dan menghasilkan α-amilase ke dalam media. Perbandingan aktivitas α-amilase isolate
didemonstrasikan pada plat agar pati dan zona bening diamati setelahnya pengobatan dengan
larutan yodium Lugol dalam metode yang dijelaskan sebelumnya (Suman & Ramesh,
2010). Diameter untuk zona bening diukur dalam milimeter (mm) dan disajikan pada Tabel 1.
Di antara 8 isolat bakteri yang diuji, bakteri penghasil 2 amilase IBLR204 (amilase atas
produser), IBLR82 (produsen amilase top di antara strain proteolitik) dipilih untuk
studi biokimia lebih lanjut dan identifikasi molekuler berikutnya. bakteri penghasil α-amilase,
urutan 16 rRNA, limbah penyamakan kulit, Hazaribag, Bangladesh 5
IBL adalah singkatan dari Industrial Biotechnology Laboratory sedangkan R untuk orang yang
melakukan eksperimen

Penilaian aktivitas ekstraseluler enzim: fermentasi terendam dilakukan untuk produksi α-

amilase seperti yang dilaporkan sebelumnya (Riaz et al., 2009). Di antara 2 isolat, IBLR204
ditemukan menjadi produsen α-amilase yang lebih baik daripada IBLR82 (Tabel 2). Oleh karena
itu, hasil menunjukkan bahwa meskipun dikumpulkan dari sumber yang sama, strain IBLR204
hanya menghasilkan amilase sementara strain IBLR82 menghasilkan kedua enzim (α-amilase
dan protease). Namun, aktivitas proteolitik strain IBLR82 juga ditemukan tinggi. Sebagai
IBLR204 adalah produser α amilase terbaik, itu dipilih untuk penyelidikan lebih lanjut untuk
karakterisasi parsial α-amilase. Namun, kedua strain itu menjadi sasaran identifikasi molekuler.

Identifikasi biokimia dan molekuler dari isolat terpilih: Biokimia

identifikasi isolat yang dipilih dilakukan sesuai dengan manual Bergey dari Bakteriologi sistemik
(Sneath et al., 1986) dan kedua isolat diduga diidentifikasi sebagai Bacillus sp . Hasil uji
biokimia disajikan pada Tabel 3.16S rRNA amplifikasi gen dan sekuensing sebelumnya
digambarkan sebagai sarana untuk mengidentifikasi sebagai serta karakteristik Bacillus sp.
(Gomma & Momtaz, 2007). Penggunaan molekul teknik bersama dengan metode mikroskopis
dan biochmical, menambahkan lebih banyak presisi dan akurasi untuk identifikasi filogenik dan
juga untuk refleksi sebenarnya dari mikroba perbedaan.

Pengaruh periode inkubasi pada produksi enzim: Optimalisasi kondisi budaya sangat penting
untuk pertumbuhan mikroba maksimum dan produksi enzim oleh mikroorganisme (Kathiresan &
Manivannan, 2006). Dari waktu belajar saja goyah Budaya ditemukan bahwa tingkat enzim
meningkat dengan durasi fermentasi dan mencapai aktivitas maksimumnya setelah inkubasi 48
jam (Gbr. 1). Berkepanjangan waktu inkubasi di atas 48 jam tidak meningkatkan produksi enzim.
Temuan ini mirip dengan hasil yang dilaporkan oleh (Haq et al., 2010). Gula pereduksi diukur
dengan menambahkan 3, 5-dinitro asam salisilat reagen, menggunakan maltosa sebagai standar
(Miller, 1959) dan aktivitas enzim enzim kasar dihitung sebagai 2,13 U / ml / menit. Enzim ini
fermentasi tidak dioptimalkan dengan benar dan menunjukkan aktivitas yang lebih sedikit
dibandingkan dengan studi sebelumnya pada B. subtilis (Riaz et al. , 2003). bakteri penghasil α-
amilase, urutan 16 rRNA, limbah penyamakan kulit, Hazaribag, Bangladesh 7
Ara. 1. Pengaruh periode budidaya pada produksi α-amilase oleh IBLR204

Pengaruh waktu inkubasi pada aktivitas crude α-amylase: Aktivitas maksimum untuk
enzim ekstraseluler yang diproduksi oleh IBLR204 diamati pada 25 menit yang telah direkam
kira-kira 2,34 unit / ml / menit (Gbr. 2). Namun, aktivitas tampak menurun secara bertahap jika
masa inkubasi diperpanjang.
Gambar. 2. Pengaruh waktu inkubasi pada aktivitas minyak mentah α-amilase
Pengaruh suhu pada aktivitas minyak mentah α-amilase : Suhu optimum untuk aktivitas α-
amilase biasanya berhubungan dengan suhu pertumbuhan mikroorganisme. Namun, dilaporkan
juga bahwa enzim ekstraseluler secara optimal aktif suhu di atas dan di luar suhu pertumbuhan
optimum organisme inang (Vieille dan Zeikus, 2001). Kisaran suhu 40 hingga 60 0 C ditemukan
menjanjikan dengan 50 0 C

Pengaruh pH pada aktivitas crude α-amylase : Enzim menunjukkan aktivitas tinggi di

kondisi asam atau netral dengan pH optimal 7.0 (Gbr. 4) yang berada dalam kisaran
nilai-nilai untuk sebagian besar strain bakteri pengurai pati (Gupta et al., 2003). Sehubungan
dengan
Genus bacillus , enzim α-amilase dengan aktivitas optimum pada nilai pH serendah-rendahnya
3,5 atau setinggi 10,6 seperti yang dilaporkan sebelumnya (Hayashi et al., 1988).
Gambar. 4. Pengaruh pH pada aktivitas minyak mentah α-amilas

bakteri penghasil α-amilase, urutan 16 rRNA, limbah penyamakan kulit, Hazaribag, Bangladesh
9
Spesies bakteri bisa menjadi sumber yang baik untuk produksi α-amilase dan B.
amyloliquefaciens (R204) bisa menjadi kandidat yang baik untuk produksi α-amilase. Itu
Penelitian ini menunjukkan bahwa α-amilase dari B. amyloliquefaciens memiliki pH optimum
7.0 dan
suhu 50 0 C. Pekerjaan di masa depan harus menggunakan pemurnian lengkap α-amilase
bahwa kegiatan spesifik yang lebih tinggi dapat dicapai. Sekali lagi, karakterisasi lebih lanjut
dari
enzim dapat memberikan hubungan fungsi struktur informasi dan menjelaskan
mekanisme aksi. Ini akan membuka kemungkinan untuk perbaikan genetik α-
strain produksi amilase, enzim dan pemanfaatan selanjutnya dalam hal yang terkait
industri.
Pengakuan: Para penulis ingin mengakui pendanaan dari INSPIRE
proyek yang didukung oleh British Council, Bangladesh