Isolasi dan Krakterisasi Kitinase Isolat Jamur

Akuatik Kitinolitik KC3 dari Kecoa (Orthopetra)

(Karso, dkk., 2014)
1. Peremajaan dan Aktivasi Jamur Akuatik KC3

Spora biakakan murni sel jamur akuatik

- Diinokulasikan pada media padat kitin

- Diinkubasi pada suhu ruang
- Diinokulasikan pada media cair
- Diinkubasi pada shaker inkubatr selama 3 hari dengan kecepatan 50 rpm

Inokulum aktif
Media Padat Kitin:

- KH2PO4 0,1 %,
- MgSO4.7H2O 0,05 %,
- KCl 0,05 %,
- agar 3 %
- Kitin koloidal 0,5 %.
2. Pembuatan Kurva Pertumbuhan

20 mL media cair dalam buffer fosfat pH 5

- Dimasukkan ke dalam 10 botol gelas

- Disterilisasi dengan autoklaf selama 20 menit
- Ditambahkan 0,8 mL inokulum jamur akuatik (sampel)
- Dimasukkan ke dalam shaker inkubator dengan kecepatan 50 rpm pada suhu ruang
- Diambil tiap 6 jam untuk diukur berat keringnya
- Ditentukan kurva pertumbuhannya

Kurva Pertumbuhan
3. Produksi Enzim Kitinase

10 mL inokulum aktif

- Dipindahkan ke dalam 250 mL medium produksi

- Diinkubasi dengan shaker inkubator
- Setelah mencapai fase log, disaring dengan kertas saring

Filtrat Residu
- Disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 5 °C selama 30 menit

Ekstrak kasar enzim Endapan

4. Fraksinasi dengan Amonium Sulfat
Ekstrak Kasar Enzim

- Dicampur dengan ammonium sulfat

- Diaduk dengan magnetic strirer dengan kecepatan lambat sampai padatan ammonium
sulfat larut sempurna. Tingkat kejenuhan: F1, 20-40%; F2, 40-60%; F4, 80-90%
- Disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 20 menit pada suhu 5 °C

Filtrat
Endapan
- Digunakan untuk - Disuspensikan dengan buffer asetat
fraksinasi selanjutnya 0,2 M pH 5
Fraksi Lanjut Fraksi 1
5. Dialisis
Mmembran selofan yang mengandung enzim
- Direndam dalam 800 mL buffer asetat 0,0002 M pH 5
- Diaduk dengan magnetic stirrer dalam kondisi dingin
- Diganti buffer tiap 2 jam
- Diuji ammonium sulfatnya dengan BaCl2

Enzim bebas ammonium sulfat

6. Penentuan Aktivitas Kitinase
1 mL kolodial kitin 0,3 %
- Dimasukkan ke dalam tabung reaksi
- Ditambahkan 2 mL buffer asetat 0,2 M pH 5
- Ditambahkan 1 mL filtrat enzim
- Diinkubasi dalam suhu ruang selama waktu tertentu
- Dipanaskan dalam air mendidih selama 20 menit
- Diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri λ = 660 nm
- Diukur kadar protein dengan metode Lowry

Aktivitas Enzim
 Aktivitas E𝑛𝑧𝑖𝑚 Kitinase
Aktivitas Spesifik =
Kadar Protein
 KESIMPULAN

Kitinase dapat diisolasi dari isolat jamur akuatik

kitinolitik KC3 dengan menggunakan kitin koloidal
sebagai inducer. Aktivitas spesifik diperoleh pada
fraksi 1 yaitu 73,258 U/mg.