BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini yaitu susu ultramilk rasa

cokelat low fat, larutan induk BSA 1,28 mg/mL, larutan Lowry B (Na2CO3 2 % dalam

NaOH 0,1 N, larutan Na-K-Tartrat 2 % dan larutan CuSO4.5H2O 1%,), larutan Lowry A

(larutan Follin Ciocalteus dan akuades), tissue roll dan kertas label.

3.2 Alat Percobaan

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini yaitu rak tabung, tabung reaksi,

gelas kimia 100 mL, gelas kimia 50 mL, pipet tetes, kuvet, pipet skala, bulb, labu

semprot, vortex dan spektrofotometer 20D+.

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Uji Kadar Karbohidrat

Sebanyak 1 g sampel dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan

dengan aquades. Sejumlah 10 mL larutan dimasukkan dalam labu Kjeldahl 500 ml,

ditambahkan 10 ml H2SO4 (93 – 98% bebas N). Ditambahkan 5 gr campuran Na2SO4 –

HgO (20 : 1) untuk katalisator. Larutan kemudian dididihkan sampai jernih dan

dilanjutkan pendidihan sampai 30 menit lagi. Setelah dingin dinding labu Kjeldahl

dicuci dengan aquades dan dididihkan lagi selama 30 menit. Kemudian setelah dingin

ditambahkan 140 ml aquades dan ditambahkan 35 ml larutan NaOH-Na2S2O3, beberapa

butiran zink. Kemudian dilakukan destilasi; destilat ditampung sebanyak 100 ml dalam

Erlenmeyer yang berisi 25 ml larutan jenuh asam borat dan beberapa tetes indikator
metilen biru. Selanjutnya larutan dititrasi dengan 0,02 N HCl dan 0,1 N HCl. Titik akhir

titrasi ditunjukkan dengan warna merah muda.

3.3.1 Pembuatan Larutan Standar

Pembuatan larutan deret standar dilakukan melalui proses pengenceran larutan

induk BSA 10 mg/mL. Larutan deret standar yang dibuat adalah dengan konsentrasi

1 mg/mL; 2 mg/mL; 4 mg/mL dan 8 mg/mL. Larutan induk yang dipipet dengan volume

0,2 mL; 0,4 mL; 0,8 mL dan 1,6 mL. Kemudian ditambahkan akuades dengan volume

masing-masing 1,8 mL; 1,6 mL; 1,2 mL; 0,4 mL, dan kemudian dihomogenkan.

3.3.2 Pembuatan Reagen Lowry

3.3.2.1 Pembuatan Reagen Lowry A

Pereaksi Lowry A dibuat dengan mencampurkan larutan follin-clocalteus dengan

akuades dengan perbandingan 1:1. Dipipet larutan follin-clocalteus sebanyak 2 mL dan

akuades sebanyak 2 mL dimasukkan ke dalam gelas kimia dan dihomogenkan.

3.3.2.2 Pereaksi Lowry B

Pereaksi Lowry B dibuat dengan mencampurkan Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N,

CuSO4.5H2O 1%, dengan Na-K-tartrat 2 % dengan perbandingan 100:1:1. Dipipet

larutan Na2CO3 dalam NaOH 0,1 N sebanyak 20 mL, CuSO4.5H2O 1 % sebanyak 0,20

mL dan Na-K-tartrat 2 % sebanyak 0,20 mL dimasukkan ke dalam gelas kimia

kemudian dihomogenkan.

3.3.3 Preparasi Sampel

Larutan sampel dilakukan dengan pengenceran 10 kali, yaitu dengan memipet

sampel sebanyak 0,2 mL, lalu diencerkan dengan akuades sebanyak 1,8 mL sehingga

volume total larutan adalah 2 mL. Kemudian dihomogenkan.

3.3.4 Penentuan Kadar Protein Sampel

Disiapkan 6 buah tabung reaksi kemudian dipipet masing-masing 2 mL larutan

sampel, larutan standar 1 mg/mL; 2 mg/mL; 4 mg/mL dan 8 mg/mL, dan blanko.

Kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Pada setiap tabung reaksi, ditambahkan

2,75 mL pereaksi Lowry B, lalu dihomogenkan menggunakan vortex dan didiamkan

selama 15 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan pereaksi Lowry A sebanyak

0,25 mL, lalu dihomogenkan menggunakan vortex dan didiamkan selama 30 menit pada

suhu kamar. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansi dengan menggunakan

spektronik 20D+ pada panjang gelombang maksimum.