Struktur & Fungsi (Isolasi &

BT6112 - Teknologi Biokatalis & Enzim

Pemurnian) :
In vitro and in silico characterization
of alkaline serine protease from
Bacillus
subtilis D9 recovered from Saudi
Heliyon 7 (2021) https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e08148
Arabia
Topik : Alkaline Serine Protease

Agung Gunawan
NIM.21121039

Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung

 DAFTAR ISI
PENDAHUL KESIMPUL
UAN
A D AN

METODE
PENELITIA B
N
DAFTAR
E PUSTAKA
HASIL DAN
PEMBAHAS C
AN
PENDAHULUAN
 PENDAHULUAN
Isolasi &
Karaterisasi
Bacillus subtilis
Bakteri diisolasi dari Bacillus subtilis
tanah untuk diketahui merupakan salah satu
golongan bakteri bakteri proteolitik dan
proteolitik dan alkali memiliki Alkaline serine
serin protease. protease AkD9

Analisis 16S Alkaline serine protease

rRNA AkD9
Alkaline serine protease
Berdasarkan analisis
AkD9 menunjukkan
16S rRNA diketahui
kesamaan urutan tinggi
aktivitas protease
Aplikasi Alkaline serine protease AkD9 dan hubungan filogenetik
tertinggi pada B. subtilis
Alkaline serine protease AkD9 menjadi yang dekat dengan
AkD9 protease serin AprX
kandidat signifikan dalam aplikasi industri
karena stabilitas, hidrofilitas, peningkatan
termostabilitas, & stabilitas alkali-halo
 METODE
PENELITIAN
 METODE PENELITIAN
ISOLASI & PENAPISAN BAKTERI PENGHASIL
1 PROTEASE ALKALI
Sampel tanah dimasukkan dalam erlenmeyer yang berisi agar kasein alkali (pH 9.4),
agar (15 gr/L), pepton (5 gr/L), kasein (5 gr/L), dan ekstrak ragi (1 gr/L) dan
diagitasi dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 40 oC. Isolat bakteri dilakukan
pengenceran bertingkat mendapatkan koloni tumbuh pada permukaan agar cawan
petri. Inkubasi dilakukan selama 24 jam pada suhu 40 oC. Selanjutnya, isolat bakteri
proteolitik dimurnikan melalui penggoresan kuadrat pada agar nutrien cawan Petri
(pH 9,0) yang terdiri dari: Agar (15 gr/L), pepton (5 gr/L), natrium klorida (5 gr/L),
ekstrak daging (1 gr/L), dan ekstrak ragi (2 gr/L). Isolat bakteri yang diperoleh
kemudian diawetkan ke dalam gliserol 20% (v/v) pada suhu -80 oC.
 METODE PENELITIAN
UJI PENAPISAN KUALITATIF
2 PRODUKSI ENZIM ENZIM
Isolat bakteri D9 dipilih untuk penyelidikan
mikrobiologi dan biokimia lebih lanjut, karena
menghasilkan zona penghambatan tertinggi di
sekitar koloni yang tumbuh pada agar kasein.
Penapisan kualitatif protease basa (AKD9) dari
isolat D9 dilakukan pada media basal yang
dijelaskan oleh Kotb (2015) yang mengandung
(g/L): Bubuk kedelai (5), gula laktosa (10),
K2HPO4 (0,5), KH2PO4 (1.5), CaCl2 (2), dan
MgSO4.7H2O (0,5). Pertumbuhan dibiarkan
selama 48 jam pada suhu 40oC dalam media 50
mL (pH 9,5). Inokulasi dilakukan menggunakan
1% (v/v) kaldu bakteri semalaman yang
mengandung A600 sekitar 0,2 dan diinkubasi
dalam pengocok orbital pada kecepatan 120
rpm.
Casein
 METODE PENELITIAN
KUANTIFIKASI PROTEIN & UJI
2 PRODUKSI ENZIM AKTIVITAS PROTEASE
Kuantifikasi protein diukur langsung pada
A280. Aktivitas protease dievaluasi dengan
mencampurkan 1 ml enzim dengan 1 ml
kasein 1,0% (b/v) yang dilarutkan dalam
buffer 0,1 M Glisin-NaOH, pH 10,0. Campuran
enzim substrat diinkubasi pada suhu 45oC
selama 30 menit. Reaksi dihentikan dengan
menambahkan 2 ml larutan penghenti asam
trikloroasetat 10% (b/v). A280 supernatan
diukur dan diubah menjadi setara tirosin. Satu
unit aktivitas protease (U) didefinisikan
sebagai jumlah protease yang melepaskan
satu mikromol setara L-tirosin/menit pada
kondisi standar pengujian.

Biobase Auto Processeur Elisa Biobase 1000

 METODE PENELITIAN
PEMURNIAN ENZIM
2 PRODUKSI ENZIM
Setelah memproduksi protease basa AKD9 pada kondisi
sebelumnya, supernatan kultur bakteri difraksinasi dengan
menerapkan 30-60% pengendapan (NH4)2SO4. Protein
yang dihasilkan dikumpulkan dengan sentrifugasi selama
20 menit pada kecepatan 10.000 (g-force) dan
disuspensikan kembali dalam 6 ml 20 mM buffer borat (pH-
8,5). Elusi pertama dari enzim kasar dilakukan melalui
+ 20 mM borat kolom DEAE-Sepharose CL-6B (2,5-30 cm2)
diseimbangkan dengan buffer tipikal. Selanjutnya, protein
yang tidak terikat dielusi pada laju 1 ml/menit dengan
buffer yang sama dengan kenaikan linier dalam kekuatan
ionik dari 20 mM menjadi 800 mM. Fraksi aktif protease
kemudian dipekatkan dan dilakukan elusi kedua melalui
kolom Sephadex G-100 FF (2-70 cm2) dengan kecepatan
0,5 ml/menit menggunakan 20 mM buffer borat (pH-7,4).
Fraksi protease kuat terakhir diliofilisasi dan dianalisis
kemurnian enzimatiknya dengan analisis SDS-PAGE,
menurut Andrew (1986), menggunakan 10% gel pengurai
dan gel susun 4% dengan volt konstan 60V.
 METODE PENELITIAN
KARAKTERISASI
3 ENZIM
PENGARUH SUHU PADA AKTIVITAS &
STABILITAS ENZIM

Pengaruh suhu pada aktivitas protease basa AKD9

dianalisis pada kisaran suhu yang bervariasi (30–80-
C). Stabilitas termal diperiksa dengan pra-inkubasi
enzim selama 60 menit pada kisaran suhu yang
sama, diikuti dengan mengukur persentase aktivitas
residunya terhadap substrat.
 METODE PENELITIAN
KARAKTERISASI
3 ENZIM
PENGARUH pH PADA AKTIVITAS &
STABILITAS ENZIM
Pengaruh pH pada aktivitas enzim dinilai
menggunakan sistem buffer 0,1 M yang terdiri
dari buffer fosfat (pH 6-7), buffer Tris-HCl (pH
8-9), dan buffer Glisin-NaOH (pH 10-12).
Analisis stabilitas pH dilakukan sebelum
inkubasi enzim protease selama 1 jam pada
suhu 35oC dalam buffer yang sama (pH 6-12),
dan aktivitas residu dianalisis.
 METODE PENELITIAN
KARAKTERISASI
3 ENZIM
PENGARUH ION LOGAM &
PENGHAMBAT PROTEASE PADA
PROTEASE MURNI
Pengaruh berbagai ion logam pada aktivitas
protease AkD9 murni diselidiki dengan
menambahkan ion logam (Fe2+, Ca2+, Mn2+, Zn2+,
Cu2+, Ba2+, Mg2+, dan Hg2+) ke enzim dan diinkubasi
selama 1 jam. Pengaruh protease inhibitor juga
dinilai menggunakan EDTA, PMSF, SBTI, TLCK,
aprotinin, 2,20-bipiridin, dan o-fenantrolin. Aktivitas
enzim tanpa ion logam dan inhibitor diambil
sebagai aktivitas 100%.
 METODE PENELITIAN
ANALISIS IN SILICO DARI ISOLAT BAKTERI DAN GEN
4 PROTEASE ALKALINYA
AMPLIFIKASI PCR DARI 16S rRNA DAN
KARAKTERISASI FISIKOKIMIA
GEN PROTEASE

ANALISIS URUTAN LOKALISASI SUBSELULER

GENBANK SUBMISSION PENENTUAN STRUKTUR SEKUNDER

PENYELARASAN SEKUENS GANDA DAN

STUDI PROTEIN DOCKING
ANALISIS FILOGENETIK

PREDIKSI SITUS FUNGSIONAL DAN

PERSIAPAN PROTEIN TARGET
KEKERABATAN PROTEIN

PROSES PROTEIN DOCKING

 HASIL DAN
PEMBAHASAN
Pemurnian & Penentuan Berat Molekul Protease dari Isolat AkD9
Analisis Fungsional gen AkD9

Alat pencarian ScanProsite digunakan

untuk memindai protease serin AKD9
untuk kecocokan dengan profil dan pola
PROSITE untuk mengidentifikasi domain
protein, kekerabatan, dan situs
fungsional.
Domain subtilase (peptidase S8)
diprediksi pada posisi asam amino 122-
439 dari AKD9 (dibandingkan dengan
Entri PROSITE PS51892), termasuk
subtilase triad katalitik. Triad katalitik
subtilase_ASP155, subtilase_HIS187,
dan subtilase_SER384 diprediksi dengan
skor 44,6 (Gambar 6).
Karakterisasi Fisikokimia
Dua belas rangkaian protease serin
mewakili perbedaan spesies Bacillus
diambil dari NCBI-BLASTp dan
dibandingkan dengan protease serin AkD9
untuk menyelidiki lebih baik gen yang
mengkode protease AKD9 (Table 2).
Struktur Sekunder Protease AkD9

Prediksi penentuan struktur

sekunder protease serin AkD9
dengan aplikasi/alat SOPMA

biru (h)¼ alphahelix menyumbang sekitar

32,81%. merah¼ lembar beta menyumbang
sekitar 15,16%. yang hijau ¼ giliran beta
menyumbang sekitar 7,24%. si kuning¼
kumparan acak menyumbang sekitar 44,80%.
KESIMPULAN
 KESIMPULAN
Berdasarkan penghambatan PMSF enzim AKD9, multiple
sequence alignment, filogenetik dan prediksi fungsional, AKD9
protease diklasifikasikan sebagai alkaline serin protease dan
subtilase S8 family.

Analisis biokimia menunjukkan stabilitas protease AKD9

pada suhu 65oC dan pH 8-11.

Sifat fisikokimia dari struktur primer

mengungkapkan bahwa protease AKD9 bersifat
hidrofilik, termostabil, dan stabil alkalihalo.

Analisis struktur sekunder menegaskan dominasi

kumparan meningkatkan aktivitas dan stabilitas
protease AKD9 di bawah kondisi salin dan basa.
DAFTAR PUSTAKA
DAFTAR PUSTAKA
 Sekian
TERIMA KASIH!