Review

Article

HEPPY SETYA
PRIMA
1921652006

PASCASARJANA UNIVERSITAS
ANDALAS
JURUSAN BIOTEKNOLOGI
PADANG
2019
 Latar
Belakang
Bakteri asam laktat (BAL)
merupakan bakteri yg menghasilkan
asam laktat sebagai metabolit
utamanya
Bakteri asam laktat dapat ditemukan dalam makanan fermentasi

Bakteri asam laktat telah diteliti dapat memberikan

manfaat baik bagi kesehatan yg membuatnya disebut
sebagai probiotik potensial

Sampai saat ini BAL telah banyak diidentifikasi

berdasarkan karakterisitik fenotipnya, namun identifikasi
ini tidak sepenuhnya akurat serta membutuhkan waktu
yg relatif lama

saat ini identifikasi BAL telah beralih ke arah molekuler,

salah satunya menggunakan gen 16S rRNA
 BAHAN DAN METODE

Amplifikasi DNA
Fermentasi Elektroforesis

Isolasi Bakteri Ekstraksi DNA Purifikasi Gel DNA

Sekuensing
Pewarnaan Uji Katalase
Gram

Analisis Data
 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi Program
Studi Farmasi, Laboratorium Penelitian ini terlaksana pada bulan
Mikrobiologi Oktober 2018 – November 2018.
Laboratorium Bioteknologi Jurusan
Biologi Fakultas MIPA Universitas
Sam Ratulangi.

Alat dan Bahan Bahan yg digunakan Yaitu:

-. selada romain
Alat yg
-. MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) agar
digunakan Yaitu:
-. Geneaid Presto™ Mini gDNA Bacteria
alat PCR (GBB100),
(TOYOBO KOD FX -. Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zym
Neo Catalog No. Research),
KFX-201) -. PCR Buffer KOD FX neo
alat ekstraksi DNA
(Presto™ Mini gDNA -. dNTPs
Bacteria) -.Primer 27F
-. Primer 1492R,
-. KOD FX Neo,
-. bubuk agarose
-. buffer TBE (Tris-Boric EDTA) 1X,
alat purifikasi gel DNA -. DNA ladder
alat elektroforesis
(Zymoclean™ Gel DNA
 Fermentasi

Proses fermentasi dilakukan

diberi pemberat dan pada suhu ruang selama 4
Daun selada romain ditambahkan larutan hari tanpa cahaya di dalam
dimasukkan ke garam 10%. wadah fermentasi yg
dalam wadah ditutup rapat
Isolasi bakteri
fermentasi,

Sebanyak 100 diencerkan dgn cairan hasil fermentasi

μL cairan hasil pengenceran yg telah diencerkan Diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37oC
fermentasi berseri sampai 10- ditebar pada media
dipipet 5. MRS agar yang
mengandung CaCO3 Setelah bakteri tumbuh

masing-masing koloni dgn

zona bening disekitarnya
dimurnikan pada MRS agar
 Pewarnaan Gram

1 Ose bakteri diambil

digoreskan pada kaca preparat
ditetesi akuades kemudian diwarnai
difiksasi di atas pembakar Bunsen
menggunakan
metode (Reynolds,
2011).

Uji Katalase

Masing-masing isolat dan

bakteri pembanding (E. Coli)
ditetesi 2 tetes larutan H2O2 5% lalu diamati
yg telah dibiakkan diambil
terlebih dahulu
menggunakan jarum Ose

diletakkan di kaca preparat yg sama dibandingkan reaksi pada isolat dgn bakteri pembanding
 Ekstraksi DNA Elektroforesis

Sebanyak 5 μl DNA ladder

Fragmen DNA diamplifikasi dimasukan ke dalam gel agarosa
menggunakan kit PCR KOD 1% untuk menghasilkan ukuran
FX Neo Catalog No. KFX-201 pita DNA. Ag
(Toyobo).
produk PCR yg mengandung
loading dye dimasukkan ke
dalam sumur-sumur gel
Amplifikasi DNA agarosa

Komponen master mix PCR

yaitu: lalu dialirkan listrik dengan tegangan 100 Volt selam
5 μl ddH2O
12.5 μl PCR Buffer KOD FX neo
5 μl dNTPs Fragmen DNA
0.5 μl KOD FX Neo divisualisasi
1 μl DNA template menggunakan UV-
0.5 μl primer 27F (forward)Program amplifikasi yang transluminator dan
0.5 μl primer 1492R (reverse).
digunakan: didokumentasi
Tahapan Suhu Durasi menggunakan
(°C) kamera digital
pre 95 3
denaturasi menit
denaturasi 98 15
 Purifikasi Gel DNA Analisis Data

Gel DNA hasil Kromatogram disunting akhir dari sekuens

elektroforesis dipurifikasi menggunakan Geneious yg mengandung
menggunakan kit 11.1.5. Sebanyak 50 primer dihilangkan.
Zymoclean™ Gel DNA nukleotida di bagian awal
Recovery. Konsensus sekuens diperoleh
Sekuensing dgn cara pairwise alignment
dari sekuens forward dan
reverse
Fragmen DNA yg telah
diamplifikasi beserta dgn sekuens DNA dianalisis menggunakan Basic
primernya dikirim ke 1Base C.O Local Alignment Search Tool (BLAST) untuk
Malaysia untuk dilakukan proses mencari sekuens yg serupa yang tersedia di
sekuensing. GenBank

Kemudian Sekuens 16S rRNA dijajarkan

menggunakan Multalin 5.4.1
Sekuensing dilakukan
untuk menentukan
urutan fragmen DNA. pohon filogenetik dibuat menggunakan piranti MEGA
7.0.26 dengan metode UPGMA

Jarak genetik diperoleh berdasarkan Kimura-2

parameter method yg terintegrasi pada MEGA
7.0.26
 Hasil dan Pembahasan
Isolasi Bakteri Asam Laktat

Terdapat perbedaan
jumlah koloni yg pada pengenceran 10-4 terdapat 26 koloni bakteri
tumbuh pada setiap
pengenceran. Sehingga dapat dinyatakan
Pada pengenceran 10-5 terdapat 5 koloni bakteri bahwa semakin banyak
pengenceran yang dilakukan
maka jumlah koloni bakteri
pada pengenceran 10-3, 10-2, 10-1
akan semakin berkurang.
serta cairan fermentasi tanpa
pengenceran koloni bakteri tidak
dapat dihitung

Dari pengenceran 10-4 dan 10-5 Koloni-koloni ini dimurnikan menggunakan

diperoleh 2 koloni dgn morfologi yg
berbeda serta memiliki zona bening
di sekitarnya
metode streak plate sehingga didapat 2
isolat murni yg diberi nama MG1 dan MG2.
MG1 memiliki warna putih susu,
tepian yg tidak beraturan, berbentuk
bulat, berukuran kecil dan berelevasi
cembung.
MG2 memiliki warna putih,
tepian rata, berbentuk bulat,
berukuran sedang dan
berelevasi cembung.
 Pewarnaan Gram

Hasil pewarnaan Gram dapat dinyatakan bahwa ke 2 isolat

menunjukkan bahwa kedua merupakan bakteri Gram positif
isolat baik MG1 maupun MG2
berwarna ungu
Hasil pengamatan di bawah mikroskop menurut Lahtinen et al. (2012) BAL merupakan
dgn perbesaran 100 X menunjukkan bakteri Gram positif yg berbentuk batang atau
bahwa isolat MG1 maupun MG2 kokus.
memiliki bentuk sel kokus

Uji Katalase

Ke 2 isolat baik MG1 dikarenakan kedua isolat tidak

maupun MG2 memiliki menghasilkan gelembung
katalase negatif. ketika ditetesi larutan H2O2
5%.
Hasil ini dibandingkan dgn bakteri menandakan bahwa ke
pembanding (Escherichia coli) yg 2 isolat tidak
diketahui memiliki katalase + serta menghasilkan enzim
menghasilkan gelembung ketika katalase.
ditetesi dgn larutan H2O2 5%.
dapat mengkatalisis H2O2 menjadi 2H2O
dan O2, dimana O2 merupakan gelembung
yg terlihat pada pengujian katalase dari E.
Identifikasi Molekuler Menggunakan Gen 16S rRNA

Berdasarkan hasil elektroforesis

(Gambar 1) dapat diketahui bahwa Setelah dilihat menggunakan Geneious 11.1.5, diketahui
fragmen DNA yg diamplifikasi memiliki bahwa MG1 memiliki panjang 1400 bp
panjang sekitar 1400 bp.
MG2 memiliki panjang 1411 bp.

Hasil identifikasi menunjukkan dgn kebanyakan spesies Enterococcus faecium yang

bahwa MG1 memiliki kemiripan
99% dan MG2 memiliki kemiripan
100%
diteliti, kecuali E. faecium strain JE1.
menyatakan bahwa ke 2 isolat merupakan spesies yg
sama meskipun memperlihatkan morfologi yg berbeda

dikarenakan karakteristik morfologi yg ditunjukkan oleh

MG1 maupun MG2 sangat dipengaruhi oleh kondisi
lingkungan, seperti suhu dan pH,

identifikasi berdasarkan karakteristik morfologinya saja

bisa tidak akurat.
Gambar 1. Hasil elektroforesis
 Hasil rekonstruksi pohon filogenetik
dapat dilihat pada Gambar 2,

isolat MG1 dan MG2 berada dalam

spesies yang sama dengan
Enterococcus faecium

dibandingkan dengan
pembandingnya yaitu
E. faecalis

Jarak genetik antar taksa

dihitung menggunakan metode
Kimura 2-parameter (Tabel 1)

Gambar 2. Rekonstruksi filogenetik

 Jarak genetik antara isolat MG1 Jarak genetik antara MG2 dengan E. faecium lainnya
dengan MG2 dan E. faecium yaitu 0.000,
lainnya yaitu 0.002 (0.2%),

kecuali dengan strain JEI yaitu 0,001 (0,1%)

kecuali strain JEI yaitu 0,004 (0,4%)

Menurut Konstantinidis dan Tiedje (2005), berdasarkan

identitas sekuens gen 16S rRNA, bakteri dapat
dinyatakan spesies yg sama apabila kemiripannya lebih
besar dari 97%.

Edgar (2018) menyatakan bahwa ambang identitas

optimal spesies bakteri yaitu ~99% untuk sekuens 16S
rRNA utuh, dan ~100% untuk daerah V4 yang
 Tabel 1. Jarak genetic antar taksa menggunakan metode Kimura 2 parameter

ciri-ciri
Genus Enterococcus -. Gram positif,
termasuk ke dalam -. katalase negatif,
bakteri penghasil asam -. tidak membentuk spora,
laktat -. fakultatif anaerob serta berbentuk kokus
 Enterococcus faecium memiliki banyak Enterococcus faecium dapat dijadikan starter dalam
manfaat menguntungkan bagi kesehatan, proses fermentasi makanan (Gomes et al., 2010)

membuatnya dapat mencegah

dapat mengasimilasi kolestrol (El-Jeni et al., 2015),
kontaminasi dari makanan yg
dapat menurunkan angka kejadian difermentasi.
diare (Jatkauskas dan Vrotniakienė,
2014), asam laktat yg diproduksinya dapat
memberikan cita rasa unik pada makanan
yg membuatnya disukai banyak orang
apat meningkatkan sistem imun (Scharek et al., 2005)
(Lahtinen et al., 2012).

pat meningkatkan berat badan (Simonova et al., 2009)

memiliki aktivitas antibakteri dari

bermacam-macam bakteriosin yg
diproduksinya (Cintas et al., 1997; El-Jeni
et al., 2015)
KESIMPU Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka
dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri asam laktat
LAN MG1 dan MG2 hasil fermentasi selada romain
merupakan Enterococcus faecium.