Anda di halaman 1dari 48

PENGERTIAN

 Merupakan karakter/senyawa/DNA yang


dapat menjadi penanda suatu karakter
lain yang dicari
 Kedua karakter tersebut selalu muncul
bersama-sama
 Secara genetik dikendalikan oleh gen-
gen yang letaknya berdekatan / linkage
sehingga jika terjadi segregasi selalu
bersama-sama
KEGUNAAN
 Karakter penanda memudahkan untuk
menentukan ada tidaknya karakter yang
dicari
 Jika ingin mengetahui keragaman
genetika : cukup dengan mengamati
markernya
 Tidak harus mengetahui gen yang
mengendalikan karakter yang dicari
 tidak perlu melakukan sequencing DNA
MACAM penanda
genetika
A. PENANDA MORFOLOGI / VISUAL
MARKERS
 Misalnya : padi dengan ligula membulat
selalu rasanya enak
 Karakter ligula membulat dapat menjadi
penanda genetik dari karakter rasa enak
 Gen A : karakter ligula membulat
Gen B : rasa enak
 Gena A dan B letaknya berdekatan, jika
terjadi pindah silang atau segregasi
selalu bersama-sama
kelebihan dan
kekurangan
kelebihan kekurangan

Mudah diamati Hanya dapat diamati


pada umur dan organ
tertentu
Murah dalam Keragaman kecil
penentuan
Tidak stabil
Kriteria

 Karakter penanda harus berbeda di


antara 2 induk
 Karakter penanda harus diturunkan
secara nyata kepada turunannya
 Harus merupakan karakter kualitatif dan
bukan kuantitatif
macam
B. PENANDA BIOKIMIA
 Menggunakan isozim (enzim yang
aktivitas / substratnya sama, tetapi
mempunyai bentuk molekul yang
berbeda)
 Isozim X1, X2 dst dikendalikan oleh gen
yang linkage dengan gen dari karakter
yang diamati
 Isozim adalah bentuk molekuler enzim
yang berbeda, tetapi mempunyai fungsi
yang sama,
 Isozim dibentuk oleh gen-gen yang
terdapat pada lokus yang berbeda, atau
pada lokus yang sama namun alel
berbeda
 Isozim merupakan produk langsung dari
gen, sedangkan gen tidak dipengaruhi
lingkungan.
 Oleh karena itu isozim dapat merupakan
penanda keragaman tanaman yang cukup
meyakinkan
 Perbedaan struktur protein diakibatkan
oleh jenis dan urutan asam amino
penyusunnya, dan hal ini ditentukan oleh
jenis dan susunan basa nitrogen dalam
DNA
 Perbedaan susunan basa nitrogen
dianggap sebagai sifat biokimia yang
meyakinkan untuk membedakan
organisme karena susunan basa nitrogen
dalam DNA secara kualitatif tidak
dipengaruhi oleh lingkungan
 Karena perbedaan DNA dalam suatu
organisme dapat dipelajari melalui perbedaan
struktur protein atau enzim maka isozim
merupakan penanda keragaman tanaman
yang terpercaya
 Setiap pita isozim biasanya :

a. diatur oleh gen tunggal


b. bersifat kodominan dalam pewarisannya,
 Pemisahan molekuler isozim didasarkan
atas perbedaan ukuran, bentuk atau struktur
sekunder, berat molekul dan muatan
listriknya
 Pemisahan tersebut dapat dilakukan dengan
teknik elektroforesis, yaitu proses
pemisahan molekul protein pada bidang
atau medium yang dialiri arus listrik,
sehingga molekul protein akan bergerak
melalui gel, kertas atau selulosa sebagai
akibat adanya perbedaan gradien listrik
 Metode ini akan memisahkan polipeptida
yang berbeda dari setiap protein (enzim) ke
dalam pola pita yang dapat dilihat melalui
pewarnaan
 Kecepatan gerak / mengalir pada gel
bergantung pada BM
 Perbedaan kecepatan gerak mengakibatkan
pola pita yang berbeda atau
POLIMORFISME
JENIS ISOZIM
 Jenis isozim yang dapat dipakai untuk
penanda genetik cukup banyak
jumlahnya.
 Pada populasi kelapa, enzim PER
(peroksidase), EST (esterase) dan GOT
(glutamat oksaloasetat transferase)
menunjukkan pola pita yang beragam
 Pola pita PER, EST dan ACP (acid
phosphatase) menunjukkan keragaman
pada 12 kultivar salak di Madura
 Pada beberapa klon tebu terdapat
keragaman pola pita PER, GOT dan
ENP (endopeptidase); pola pita ENP
kemungkinan dapat menjadi ciri klon
tebu yang tahan kekeringan
kekurangan dan
kelebihan
kelebihan kekurangan
Mempunyai keragaman yang lebih Lebih sulit dan lebih mahal
besar dibanding penanda morfologi dibanding penanda morfologi

Lebih stabil dibanding penanda Dihasilkan oleh gen indusibel


morfologi

Dihasilkan oleh organ tertentu


proses analisis isozim

 Pembuatan gel poliacrylamide


 Ekstraksi enzim dari organ spesifik
 Pemusingan
 Pengambilan supernatan
 proses elektroforesis
 Pewarnaan gel
 Fiksasi gel
 Pengeringan gel
pembuatan gel
 Polyacrylamide gel terdiri dari dua bagian :
a. running gel yang terletak di bagian bawah
b. spacer gel yang terletak di bagian atas
 polyacrylamide gel lebih kuat jika dibandingkan
dengan gel pati atau agarose,
 Tetapi proses pembuatan polyacrylamide gel lebih
berbahaya karena menggunakan monomer
acrylamide yang sangat beracun (neurotoxin)
 Sample comb (sisir) yang dapat mencetak 20 sumur
dipasang di dalam spacer gel.
ekstraksi enzim
 Ekstraksi enzim dilakukan dengan
menggerus organ menggunakan
mortar dan pestle yang telah
didinginkan, kemudian ditambah
dengan ekstraks buffer sebanyak 1
ml
pemusingan dan pengambilan
supernatan
 Hasil penggerusan dimasukkan ke dalam
tabung ependorf
 dipusingkan di dalam refrigerated centrifuge
dengan kecepatan 15.000 rpm, pada suhu
0 °C selama 20 menit.
 Supernatant yang dihasilkan dihisap
dengan syringe dan disimpan dalam freezer
 Sampel yang telah siap dianalisis
bersama-sama menggunakan teknik
elektroforesis.
elektroforesis
 Supernatant dari sampel dimasukkan ke
dalam sumur gel
 Larutan running buffer dituangkan ke
bagian dalam bak elektroforesis di antara
plat kaca yang berhadapan sampai bagian
kaca yang bertakik terendam.
 Penutup bak elektroforesis dipasang dan
power supply 100 mA dihidupkan.
 Proses ini dihentikan bila bromophenol blue
bermigrasi sampai kurang lebih 0,5 cm dari
dasar running gel.
pewarnaan gel
 Larutan pewarna bersifat spesifik untuk
setiap jenis isozim
 Pewarnaan ini dilakukan dengan
menuangkan larutan pewarna spesifik di
atas polyacrylamide gel yang telah dilepas
dari plat kaca
fiksasi
 Setelah pita-pita terbentuk dengan jelas,
larutan pewarna segera dibuang,
 dibilas dengan aquadestilata,
 gel direndam dalam larutan fiksasi. Larutan
fiksasi juga spesifik tergantung pada jenis
isozim
 Gel yang telah difiksasi ditutup supaya
larutan fiksasi tidak menguap dan kemudian
disimpan dalam lemari pendingin selama ±
24 jam.
pengeringan gel
 bertujuan agar gel dapat disimpan.
 dilakukan dengan meletakkan gel diantara
2 (dua) lembar kertas kaca yang telah
dibasahi dengan air yang dibentangkan di
atas lempeng kaca.
 Gelembung air di atas gel dihilangkan
dengan bantuan penyapu gelembung
sampai bersih.
 Kertas kaca dijepitkan pada lempeng kaca
dengan menggunakan klip penjepit
secukupnya agar kertas kaca tidak
mengkerut dan kemudian ditiriskan selama
± 24 jam pada suhu kamar.
pengamatan
 Pengamatan dilakukan pada seluruh nomor
tanaman.
 Dilakukan interpretasi pita-pita isozim menjadi
alel dan lokus
 Berdasarkan hal tsb. dapat dihitung
parameter-parameter berikut:
1. Variasi pola pita isozim pada setiap kultivar
2. Jumlah lokus dan alel setiap macam isozim
pada setiap individu
3. Frekuensi alel.
C. PENANDA DNA / DNA
MARKER
 Merupakan sekuens DNA yang terletak
berdekatan dengan gen penyandi
karakter tertentu
 Pada pindah silang selalu bersama-
sama, sering tidak berasosiasi dengan
karakter yang ditandai
aplikasi marka DNA
 Mengukur perbedaan / jarak genetik
 Mengukur hubungan kekerabatan
 Menganalisis pola pewarisan sifat
 Menganalisis pola aliran gen dalam
populasi
 Seleksi karakter
 fingerprinting suatu individu organisme
kelebihan dan
kekurangan
kelebihan kekurangan
Peluang mendapatkan sekuens sulit dilakukan
ini lebih besar dari pada isozim
dan morfologi

Dapat diamati pada semua organ Mahal


dan semua umur
Sangat stabil
Keragaman sangat besar
 RFLP : Restriction Fragmen Length
Polymorphism
 RAPD : Random Amplified Polymorphic
DNA
 AFLP : Amplified Fragmen Length
Polymorphsm
 SSR : Simple Sequence Repeat
TUJUAN
 Menemukan polimorfisme dalam
sekuens / fragmen DNA yang terpaut
dekat dengan suatu gen yang
mengendalikan suatu sifat
 Polimorfisme terjadi karena adanya
variasi urutan dan atau jumlah
nukleotida DNA akibat mutasi, delesi,
insersi
RAPD RFLP AFLP
dasar Amplifikasi/ PCR Hibridisasi asam Amplifikasi PCR
nukleat
band Hasil amplifikasi Hasil hibridisasi Hasil amplifikasi
DNA DNA + probe DNA

Yang dibutuhkan Primer, d-NTP Probe, enzim Primer, d-NTP


restriksi
Prinsip Amplifikasi DNA Restriksi Restriski
dengan primer endonuklease endonuklease,
random primer selektif,
adaptor

Tipe polimorfisme Perubahan basa Perubahan basa Perubahan


N basa
Sifat dominan Kodominan Umumnya
dominan
proses
RAPD RFLP AFLP
Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA

PCR Restriksi dengan Restriksi dengan enzim


enzim
Gel elektroforesis Gel elektroforesisi Penambahan adapter
pada fragmen ds dan
nukleotida selektif
Visualisasi produk Southern transfer PCR
amplifikasi
Hibridisasi dengan Gel elektroforesis
probe
Gel elektroforesis Visualisasi produk
amplifikasi
Visualisasi produk
amplifikasi
PRIMER / PELACAK
1. Primer random (10 nt
DNA yang mempunyai sekuens-sekuens
yang sama dengan primer dengan
arah/orientasi yang berlawanan dan jarak 2
sekuens tersebut < 3 kb dapat diamplifikasi
ACGCTCACAC -----------------CACACTCGCA
3kb
TGCGAGTGTG ----------------GTGTGAGCGT
 Sekuensi primer bersifat acak, tidak
harus dengan urutan tertentu
 Ratio GC/AT lebih dari 50%
 Semakin pendek primer yang
digunakan, semakin banyak ukuran
potongan DNA hasil amplifikasi PCR
2. primer spesifik
• Primer yang komplemen dengan
sekuens pengapit mikrosatelit
• Dalam genom terdapat mikrosatelit /
sekuens berulang, yi unit ulangan dari 2-
3 basa N, diulang sampai beberapa
puluh kali, tersebar di seluruh genom
dan diapit oleh nukleotida tertentu
• P1 ---CACACACACACA ----- P2
MARKA MOLEKULER
Dominan kodominan
Hasil Ada pita , atau Ada pita – pita dengan
Tidak ada pita pola yang beda
Ada pita Jika ada sekuens pada Sejumlah sekuens
2 posisi yang dapat dikenali oleh 1
berlawanan arah, primer/enzim spesifik,
dikenali oleh primer sehingga panjang
produk amplifiaksi beda,
pita beda

Tidak ada pita Karena mutasi, sekuens


yang semula dikenali
primer berubah, menjadi
tidak dikenali
kodominan

P1 (AA) P2 (aa) F1 X1 X2 X3
dominan

P1 (AA) P2 (aa) F1 (Aa) X1 X2 X3


RAPD, marka DNA berbasis
PCR
 Paling murah (tidak memerlukan enzim
restriksi, adapter dll
 Paling mudah
 Memerlukan DNA relatif sedikit (5 – 25 ng)
 Derajad polimorfisme tinggi
 Menggunakan primer random
prosedur RAPD
 ISOLASIDNA
 DENATURASI DAN AMPLIFIKASI DNA
DENGAN PCR
 GEL ELEKTROFORESIS
 VISUALISASI PRODUK AMPLIFIKASI
1. isolasi DNA
 Memecah dinding sel menggunakan dry-ice atau nitrogen
cair dengan blender / cawan porselin.
 Merusak membran sel menggunakan detergen (CTAB :
cetyl trimetyl amonium bromide, atau SDS : sodium dodecyl
sulfat)
 DNA dicampur dengan larutan bufer, dan dilindungi dari
aktivitas nuklease endogen dengan menambahkan EDTA
(etylen diamine tetraacetic acid)
 Campuran tersebut diemulsikan dengan kloroform / fenol
agar protein terdenaturasi dan terpisah dari DNA
2. AMPLIFIKASI
dengan PCR
 polymerase chain reaction
 Menggunakan primer (fragmen DNA ) yang telah
diketahui sekuensnya
 Primer menempel pada utas tunggal DNA pada
bagian yang komplementer
 Secara statistik setiap 1 juta bp dapat ditemukan
sekuens yang komplementer dengan primer
 Banyaknya basa di antara dua tempat
menempelnya primer menentukan diamplifikasi
tidaknya suatu DNA : 5000 bp
PCR
 Memperbanyak fragmen DNA tanpa
melibatkan MH
 Dilakukan dalam sejumlah siklus
 Dalam setiap siklus terjadi :

1. Denaturasi DNA
2. Annealing (penempelan) primer pada
setiap utas benang DNA
3. Extension (pemanjangan) DNA baru di
sebelah primer
 Produk DNA dari siklus pertama menjadi
cetakan baru sehingga pada siklus
kedua terdapat 4 cetakan
 Dst terjadi dengan deret ukur