UNIT 5

METODE PEWARNAAN JARINGAN

1.1 Capaian Pembelajaran

1.1.1 Sub-CPMK
Mampu menganalisis metode Pewarnaan jaringan.
1.1.2 Tujuan Pembelajaran (Learning Objective)
Setelah mempelajari materi dan melakukan berbagai aktivitas melalui laman LMS,
mahasiswa dapat:

1. Menjelaskan metode staining dan tujuan pewarnaan dengan benar

2. Membedakan antara pewarnaan non vital, supravital dan vital dengant teliti

3. Mengelompokkan zat warna berdasarkan sifat, asal, kemampuan mewarnai,

komposisi zat warna dengan teliti.

4. Menjelaskan persiapan yang harus dilakukan sebelum pewarnaan dan

pengolahan zat warna dengan teliti

5. Menganalisis beberapa teknik mewarnai jaringan. dengan benar

6. Menjelaskan teknik pewarnaan tulang.

1.2 Materi Pembelajaran

1.2.1 Lingkup Materi
1. Tujuan pewarnaan

2. Pewarnaan non Vital, supravital / Vital

3. Penggolongan Zat warna

4. Pemilihan Jenis zat Warna

5. Hal-hal yang harus dipersiapkan sebelum pewarnaan

6. Pengolahan zat warna

7. Identifikasi Tehnik Pewarnaan Preparat

8. Metode Pewarnaan tulang

 1.2.2 Uraian Materi
1. Tujuan Pewarnaan

Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan yang telah dipotong sehingga
unsur jaringan menjadi kontras dan dapat dikenali / diamati dengan mikroskop. Proses
timbulnya warna terkait dengan terjadinya ikatan antara molekul tertentu yang terdapat pada
daerah dan struktur jaringan yang tertentu. Sinar dengan panjang gelombang tertentu yang
terdapat dalam sinar yang berasal dari cahaya matahari atau lampu mikroskop yang
dipaparkan pada sajian yang telah diwarnai akan diabsorpsi (diserap) atau diteruskan. Zat
warna yan terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu
sehingga jaringan tersebut akan tampak berwarna. Rasuane Noor, 2014; M Aulia Yusuf,
2013).

Adapun Tujuan dari tahapan pewarnaan dalam mikroteknik, ialah :

a. Supaya unsur-unsur dalam jaringan tampak jelas, dan dapat dibedakan bagian-
bagiannya di bawah mikroskop

b. mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan terutama sel-selnya,

sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.

c. Pewarnaan bertujuan mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan

sehingga mempermudah dan mempercepat identifikasi sel serta komponen-
komponen seluler.

Pewarnaan merupakan proses yang penting, Tanpa pewarnaan, sel dan jaringan
tumbuhan akan transparan sehingga sulit untuk diamati. Pewarnaan adalah proses pemberian
warna pada jaringan sehingga unsur jaringan menjadi kontras dan dapat diamati dengan
mudah menggunakan mikroskop. Proses timbulnya warna pada jaringan yang diwarnai terkait
dengan terjadinya ikatan molekul antara zat warna dengan jaringan tertentu. Zat warna yang
terikat pada jaringan akan menyerap sinar dengan panjang gelombang tertentu sehingga
jaringan akan tampak berwarna. Setiap bagian dari sel mempunyai sifat-sifat yang khusus,
sehingga afinitas bagian-bagian tersebut terhadap zat warna juga berbeda-beda. Zat warna juga
mempunyai kemampuan khusus dalam mewarnai jaringan, sesuai dengan sifat-sifatnya. Dua
macam zat warna yang mempunyai sifat sama dapat memberikan kemampuan yang berbeda
dalam mewarnai suatu jaringan sehingga sangat perlu mengenali sifat-sifat zat warna. Saat ini,
pewarna sintetik lebih sering digunakan daripada pewarna alami. (admin bio, 2018).

2. Pewarnaan Non Vital, Supravital / Vital

 Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi.
Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling lazim digunakan, terutama untuk pekerjaan
rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.

Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam
keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna
maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang
hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan
lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES,
karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna.

Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan. Perwarnaan sel
yang masih hidup dan tidak difiksasi, oleh karena itu disebut pewarnaan supravital. Dalam
arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang
mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati. Ditinjau dari berbagai segi,
maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut
ini adalah pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut.

3. Penggolongan Zat Warna

1. Berdasarkan sifatnya, meliputi:

a. Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna

dengan radikal basa yang tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan
lain sebagainya

b. Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan
radikal asam yang tidak berwarna.

2. Berdasarkan asalnya, meliputi:

a. Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari
tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang
berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin campechianum)

b. Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik.
Contoh: basic fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin.

3. Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:

a. Zat warna substantife Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan
 secara langsung. Contoh janus green B, Neutral red.

b. Zat warna ajektif ,Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu
mewarnai jaringan, harus menggunakan bantuan mordan. Contoh
hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut diberikan pula
kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan.

4. Berdasarkan jumlah/komposisi zat warna yang digunakan, meliputi:

a. Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat

warna, contohnya untuk melihat polysacharida sulphate ester serta
hyaluronic, maka digunakan zat warna tunggal gentian violet.

b. Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat

warna, contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin

c. Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna,
contohnya formula Marllory triple staining yang menggunakan zat-zat
warna acid fuchsin, aniline blue serta orange G.

d. Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali

untuk tujuan khusus.

5. Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:

a. Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safranin

b. Pewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan,

aniline blue, asam phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.

4. Pemilihan Jenis Zat Warna

Pemilihan jenis zat warna didasarkan pada objek spesifik jaringan yang akan diamati,
yaitu :

1. Dinding sel

Pewarna yang biasa digunakan untuk mewarnai dinding sel adalah Toluidine blue.
Selain itu, terdapat sejumlah metode yang cepat dan sederhana yang digunakan untuk
mewarnai komponen-komponen dinding sel seperti Ruthenium red untuk mewarnai
pektin, Calcoflour untuk mewarnai selulosa, Phloroglucinol atau safranin untuk
mewarnai lignin, dan Aniline blue, Recorcinol blue atau Astra-blue untuk mewarnai
 kalose. Safranin adalah zat warna yang mengandung basa kuat, memberikan warna
merah pada preparat. Beberapa kelemahan safranin adalah harganya yang mahal, mudah
rusak, dan sulit dalam penyimpanan.

2. Karbohidrat dan butir amilum

Karbohidrat total dapat diwarnai pada potongan jaringan menggunakan teknik

pewarnaan PAS (periodic acid Schiff’s). Metode klasik untuk mewarnai karbohidrat
adalah menggunakan iodin/ potassium iodin.

3. Viabilitas sel

Terdapat beberapa metode perwarnaan untuk melihat viabilitas sel, akan tetapi
yang paling sering digunakan adalah dua jenis fluorokrom yaitu fluorescein diacetate
(FDA) dan propidium iodine. Kedua jenis pewarna tersebut digunakan untuk
mendeteksi sel hidup atau sel mati pada jaringan maupun pada suspensi sel. Sel yang
hidup akan terlihat berwarna hijau atau biru.

4. Mikroorganisme pada jaringan tumbuhan

Pewarna yang biasa digunakan untuk melihat mikroorganisme pada jaringan

tumbuhan adalah methyl blue atau thionin.

5. Asam nukleat

DNA pada nukleus, mitokondria, dan kloroplas dapat diwarnai menggunakan

pewarna DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole).

6. Lipid

Pewarna yang digunakan untuk mewarnai lipid adalah Sudan IV atau Sudan hitam.
Selain itu, pewarna Nile blue juga sering digunakan untuk mewarnai asam lemak seperti
fosfolipid. Pewarna tersebut bekerja dengan baik pada jaringan segar.

Pewarnaan pada hewan seperti pewarnaan inti, pewarnaan membran sel, bagian-bagian
sitoplasma, pewarnaan sabut syaraf, dll.

5. Hal-Hal Yang Harus Dipersiapkan Sebelum Pewarnaan

Sebelum melakukan pewarnaan serangkaian persiapan yang harus dilakukan adalah

sebagai berikut
 1. Peralatan gelas harus dibersihkan dulu dan dibilas dengan akuades

2. Timbang zat warna dengan cermat dan tepat

3. Larutkan zat warna dalam pelarut yang benar dengan memperhatikan urutan

pencampurannya, misalnya hematoksilin selalu harus dilarutkan dalam alkohol

dulu sebelum ditambahkan bahan lain.

4. Aduk zat warna dengan baik agar seluruh partikel zat warna terlarut dengan baik

a. Tuangkan larutan zat warna ke dalam wadah yang sesuai untuk proses
pewarnaan dengan menyaringnya menggunakan kertas saring

b. Siapkan juga larutan-larutan lain yang diperlukan untuk proses

pewarnaan dan tuangkan dalam wadah yang sesuai

c. Atur urutan larutan-larutan tersebut sesuai dengan prosedur proses

pewarnaan

d. Zat warna beralkohol harus ditutup rapat untuk mencegah penguapan

alkohol yang akan menyebabkan presipitasi (pengendapan) zat warna
(Handari Suntoro, 1983; Rasuane noor, 2014)

Pelarut yang umum dipakai dalam proses pewarnaan adalah air dengan derajat
keasaman yang netral (pH 7). Disamping itu juga dapat digunakan cairan pelarut lainnya
seperti etilalkohol (etanol) dengan derajat konsentrasi yang bervariasi. Bila tidak ada
keterangan dalam proses pelarutan yang menggunakan alkohol berarti konsnetrasi alkohol
yang digunakan adalah alkohol absolut dengan konsentrasi 99.9%.

6. Pengolahan Zat Warna

Pulasan Hematoxilin-Eosin

Pulasan (pewarna) yang sering digunakan secara rutin adalah pewarnaan yang dapat
digunakan untuk memulas inti dan sitoplasma serta jaringan penyambungnya yaitu pulasan
hematoksilin-eosin (HE). Pada pulasan HE digunakan 2 macam zat warna yaitu hematoksilin
yang berfungsi untuk memulas nti sel dan memberikan warna biru (basofilik) serta eosin
yang merupakan counterstaining hematoksilin, digunakan untuk memulas sitoplasma sel dan
jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda.

Hematoksilin merupakan zat warna alami yang pertama kali dipakai tahun 1863.
Hematoksilin akan mengikat inti sel secara lemah, kecuali bila ditambahkan senyawaan
lainnya seperti alumunium, besi, krom dan tembaga. Senyawaan hematoksilin yang dipakai
adalah bentuk oksidasinya yaitu hematein. Proses oksidasi senyawaan hematoksilin ini
dikenal sebagai Ripening dan dapat dipercepat prosesnya dengan menambahkan senyawaan
yang bertindak sebagai oksidator seperti merkuri oksida, hidrogen peroksida, potassium
permanganat dan sodium iodat.

Selama proses oksidasi berlangsung kemampuan hematoksilin utuk mewarnai inti sel
akan terus berlangsung dan akan berkurang bila proses oksidasi telah selesai. Untuk
memperpanjang proses ini larutan hematoksilin dapat disimpan dalam wadah tertutup dan
disimpan dalam ruangan gelap. Dalam kondisi terpapar oleh cahaya sebaiknya larutan
diganti sekurangnya seminggu sekali. Jenis hematoksilin yangsering dipakai adalah mayer,
delafied, Erlich, Bullard dan Bohmer, sedangkan counterstaining yang dipakai adalah eosin,
safranin, dan phloxine.

Beberapa larutan hematoksilin yang digunakan adalah

1. Hematoksilin Erlich

Hematoksilin Erlich adalah hematoksilin yang paling tahan lama, mudah

berdifferensiasi dan warnanya relatif tahan lama. Hematoksilin ini baru bisa digunakan
setelah 1-2 bulan dibuat. Waktu inkubasinya adalah 30 menit dan counterstainingnya
adalah 0.5 -1% larutan eosin dalam air. Formulanya adalah sebagai berikut

 Hematoksilin …………………….. 6 gram

 Alkohol absolut …………………. 300ml

 Akwades ………………………….. 300ml

 Glycerol ……………………………. 300 ml

 Glacial acetic acid ………………. 30 ml

 Potassium alum …………………. berlebihan

Cara pembuatannya adalah sebagai berikut

1. Hematoksilin dilarutkan dalam alcohol

2. 'Sambil digerus dalam mortar secara perlahan-lahan tambahkan bahan lainnya

secara berurutan sambil digerus

3. Akhirnya tambahkan kristal potassium alum (Aluminium potassium sulfate) sambil

 menggoyang-goyang botol hingga terdapat endapan kristal alum di dasar botol.

4. Botol berisi larutan hematoksilin Ehrlich kemudian ditutup secara longgar dengan
gumpalan kapas dan disimpan ditempat terang selama 1-2 bulan sehingga
hematoksilinnya teroksidasi menjadi haematin. Proses ini dikenal sebagai
pematangan

2. Hematoksilin Delafield

Larutan zat warna ini tahan bertahun-tahun dalam penyimpanan, bisa digunakan
3 hari setlah pembuatan, counterstaining dengan menggunakan 0.5-1% larutan eosin
dalam air, waktu inkubasi 15-20 menit. Formula larutan pewarna ini adalah

 Hematoksilin kristal …………………... 6 gr

 Alkohol absolut …………………………. 50 ml

 Ammonium alum ………………………. 55 gr

 Akwades ………………………………….. 600ml

 Glycerol …………………………………… 150ml

Cara pembuiatan larutan hematoksilin Delafield adalah sebagai berikut

1. Larutkan kristal hematoksilin dengan alkohol absolut

2. Larutkan ammonium alum dengan akwades hingga jenuh (saturated)

3. Campurkan kedua larutan tersebut dan diamkan selama 3-5 hari

4. Saring dan tambahkan glycerol

5. Biarkan selama 3 hari dalam botol terpapar cahaya

6. Setelah 3 hari simpan dalam botol tertutup dan lindungi dari cahaya

3. Hematoksilin Mayer

Larutan hematoksilin Mayer merupakan larutan yang dapat disimpan dalam

waktu lama (berbulan-bulan), counterstaining dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu
inkubasinya 10-15 menit. Formulanya adalah
  Hematoksilin kristal ……………………….. 1gr

 Aquades ……………………………………….. 1000ml

 Sodium iodate ……………………………….. 0.2 gr

 Ammonium/potassium alum ……………. 50gr

 Citric acid ……………………………………… 1gr

 Chloral hydrate ……………………………… 50gr

Cara pembuatannya adalah sebagai berikut

1. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam aquades

2. Tambahkan hematoksilin dan campurkan secara baik

3. Kemudian tambahkan sodium iodate, citric acid dan chloralhydrate

4. Campur dan aduk hingga seluruhnya tercampur dengan baik

5. Biarkan semalam dan saring dengan kertas saring besoknya

4. Hematoksilin Harris

Larutan pewarna yang dapat dipakai segera setelah selesai dibuat, counterstaining
dengan 0.5-1% larutan eosin dan waktu inkubasinya adalah 15-20 menit. Formulanya
adalah sebagai berikut

 Kristal hematoksilin …………………………… 5.0 gr

 Alkohol 100% ………………………………….. 50 ml

 Ammonium/potassium alum ……………….. 100 gr

 Distilled water …………………………………… 1000 ml

 Merkuri oksida …………………………………… 2.5 gr

Cara pembuatannya adalah sebagai berikut

1. Larutkan hematoksilin di dalam alcohol

2. Larutkan ammonium/potassium alum di dalam distilled water dan panaskan

3. Hentikan pemanasan dan campur kedua larutan tersebut

 4. Panaskan dengan cepat sambil di aduk

5. Hentikan pemanasan dan campurkan merkuri oksida kedalamnya perlahan-lahan

6. Panaskan kembali hingga larutan bewarna purple gelap

7. Hentikan pemanasan dan tempatkan wadah berisi larutan tersebut di dalam wadah
berisi air dingin hingga laurtan hematoksilin menjadi dingin

8. Larutan siap untuk digunakan segera setelah dinginkan

9. Tambahkan 2-4ml asam asetat glasial per 100ml Larutan untuk meningkankan
ketajaman warna inti

10. Saring sebelum digunakan

Larutan Counterstaining

Beberapa pulasan yang dipakai sebagai counterstaining larutan hematoksilin adalah

eosin, safranin dan phloxine.

1. Larutan Eosin

Larutan eosin yang digunakan terdiri atas larutan stok (Stock solution) dan larutan
kerja (working solution). Adapun kedua larutan ini adalah sebagai berikut 1% Stock
Alkohol-Eosin.

 Eosin Y, water soluble ………………………. 1.0 gr

 Distilled water ………………………………….. 20 ml

Larutkan dan tambahkan

 Alkohol 95% …………………………………….. 80 ml

Working Eosin Solution

 Eosin stock solution …………………………… 1 bagian

 Alkohol 80% …………………………………….. 3 bagian

Dibuat sesaat sebelum digunakan dan tambahkan asam asetat glasial 0.5ml untuk
setiap 100 ml larutan dan aduk dengan baik

2. Larutan Phloxine
 Laurtan phloxine terdiri atas larutan stock eosin, stock phloxine, working solution
dan larutan Safran. Larutan-larutan tersebut adalah sebagai berikut

Stock Eosin

 Eosin Y water soluble …………………………… 1 gram

 Distilled water ……………………………………… 100ml

Stock Phloxine

 Phloxine B …………………………………………….. 1.5 gr

 Distilled water ………………………………………... 100ml

Working Solution

 Stock Eosin …………………………………………….. 100ml

 Stock Phloxine …………………………………………. 10ml

 Alkohol 95% ……………………………………………. 780ml

 Asam asetat glasial ………………………………….. 4ml

2% Alkohol Safran

 Safran du Gatinais ……………………………………. 2 gram

 Alkohol 100% ………………………………………….. 100ml

Pulasan Mayer Hematoxilin-Eosin

Pulasan ini banyak dipakai dengan beberapa pertimbangan

1. Differensiasi warna sangat jelas

2. Mewarnai inti sel dengan baik dan jelas dengan background yang tidak
bewarna

3. Hasil konsisten

4. Prosedurnya sederhana

5. Dapat mewarnai preparat yang difiksasi dengan fiksasi apapun juga

Prosedur yang dipakai adalah sebagai berikut

 a. Deparafinisasi dengan xylol (2x2 min)

b. Hidrasi dengan serial Alkohol 100% (2x2 min) – 95% (2min) – 90% (2 min) –
80% (2 min) - 70% (2min) – Distilled water (3min)

c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayers selama 15 min

d. Cuci dalam air mengalir selama 15-20menit

e. Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi di air mengalir
selama beberapa menit. Bila sudah cukup warnanya lanjutkan ke langkah
selanjutnya

f. Counterstaining dalam larutan Eosin working solution selama 15 detik hingga

2 menit tergantung pada umur eosin dan kedalaman warna yang diinginkan

g. Dehidrasi dalam serial alkohol dengan gradasi meningkat perlahan mulai 70%
hingga 100% masing-masing 2 menit.

h. Jernihkan dan dealkoholisasi dalam xylol 2x2min

i. Tutup dengan balsem kanada

Hasil/ Interpretasi adalah

 Inti sel bewarna biru

 Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada

komponen tertentu

Pewarnaan Hematoxilin Harris-Eosin

Protokol pulasan hematoksilin Harris –eosin adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dalam xylol

b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-90%-
80%-70%

c. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Harris selama 15 min

d. Bilas dalam air mengalir dalam waktu yang singkat

e. Celup dalam campuran asam-alkohol secara cepat 3-10 celup cek differensiasi warna
di bawah mikroskop
 f. Bilas dalam air mengalir secara singkat

g. Celup sebanyak 3-5 kali dalam larutan ammonium atau lithium karbonat hingga
potongan bewarna biru cerah

h. Cuci dalam air mengalir selama 10-20 menit Bila pencucian tidak maksimal jaringan
sulit terwarna oleh Eosin

i. Inkubasi dalam eosin selama 15 detik hingga 2 menit

j. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara perlahan,

masing-masing selama 2 menit

k. Inkubasi dalam xylol 2x2menit

l. Tutup dengan kaca penutup

Hasil/Interpretasi hasil pulasan

 Inti sel bewarna biru

 Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada

komponen tertentu

Pewarnaan Hematoxilin Mayer-Phloxyne-Safran

Prosedur pewarnaan adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dalam xylol

b. Hidrasi dalam larutan alkohol dengan gradasi yang menurun dari 100%-95%-
90%-80%-70%

c. Inkubasi dalam larutan asam pikrat jenuh selama 5 menit

d. Cuci dalam air mengalir hingga seluruh asam pikrat hilang

e. Inkubasi dalam larutan hematoksilin Mayer selama 15 menit

f. Basuh dengan air mengalir selama 20 menit

g. Warnai dalam larutan 1.5% larutan Phyloxine B selama 2 menit

h. Basuh dengan air selama 5 menit

 i. Cuci dengan alkohol absolut 3 kali

j. Warnai dalam 2% larutan alkohol Safran selama 5 menit

k. Cuci dengan alkohol absolut 2 kali

l. Inkubasi dalam xylol 2 kali masing-masing selama 2 menit

m. Rekatkan dengan objek glass menggunakan Balsam Kanada

Hasil/interpretasi

 Inti bewarna biru

 Sel darah merah bewarna vermillion pink

 Tulang bewarna kuning

 Tulang rawan bewarna hijau kekuningan

 Otot bewarna merah

 Serat kolagen bewarna kuning

Pulasan Giemsa

Pulasan Giemsa digunakan untuk

a. Pewarnaan darah

b. Pewarnaan sumsum tulang

c. Pewarnaan Riketsia

d. Pewarnaan bakteri Helicobacter pylori

Pulasan ini menggunakan fiksasi buffer formalin, metoda blok parafin dengan ketebalan
potongan 4-7 mikron. Larutan yang dipakai adalah

Yenner stock solution

Yenner bubuk ………………………… 1 gram

Methyl alkohol ……………………….. 400ml

Yenner working solution

 Yenner stok …………………………… 25ml

Air suling ………………………………. 25 ml

Giemsa solution (Stock Solution)

Giemsa bubuk ……………………………. 1 gram

Glyserin …………………………………….. 66 ml

Methyl alkohol …………………………… 66 ml

Campurkan glyserin dengan bubuk Giemsa, masukkan dalam oven 60 C selama 2 jam

Tambahkan 66 ml methyl alcohol. Giemsa working solution, Campurkan Giemsa stok 50

tetes dengan air suling 50ml, Setiap kali harus dengan larutan segar

Larutan Asam asetat glasial 1%

Asam asetat glasial (cuka) …………………… 1ml

Air suling …………………………………………… 100ml

Prosedur pulasan adalah sebagai berikut

a. Deparafinisasi dengan xylol 3 kali selama 2-3 menit

b. Alkoholisasi dengan larutan alkohol yang konsentrasinya menurun secara bertahap :

Absolut … 95% …… 90% ….. 80% …… 70%

c. Hidrasi dengan air suling

d. Inkubasi dalam methyl alkohol 2 kali masing-masing selama 3 menit

e. Inkubasi dalam Yenner working solution selama 6 menit

f. Inkubasi dalam Giemsa working solution selama 45 menit

g. Inkubasi dalam asetat glasial 1% sampai inti menjadi jelas

h. Cuci dengan air suling

i. Dehidrasi dalam alkohol dengan konsentrasi yang meningkat secara bertahap 70%,
80%, 90%, 95%, absolut

j. Dealkoholisasi dengan xylol 2x masing-masing selama 2-3 menit

k. Tutup dengan kaca penutup yang diberi etelan

Hasil/Interpretasi: Bakteri helicobacter dan Riketsia akan bewarna biru

Pewarnaan Fite Faraco

Fite Faraco adalah metoda pulasan khusus untuk mendeteksi bakteri tahan asam (BTA)
seperti tuberkulosis dan lepra. Fiksasi yag digunakan adalah buffer formalin 10%, metoda
blok parafin dengan ukuran 4-7 mikron. Larutan yang digunakan adalah

Larutan Carbol Fuchsin

Phenol …………………………….. 2.5ml

Alkohol absolut ………………… 5 ml

Basic Fuchsin …………………… 0.5 gram

Air suling ad……………………… 50 ml

Larutan Methylen Blue

Methylen blue …………………… 0.5 gram

Asam asetat glasial ……………. 0.5 ml

Air suling ………………………….. 100 ml

Larutan alkohol asam 1%

Alkohol 70% …………………………… 99ml

Asam chlorida (HCl) ………………… 1 ml

Prosedur pulasan adalah sebagai berikut

 Deparafinisasi dengan Campuran minyak kacang dan xylol (1:2) dilakukan 2 kali
masing-masing selama 12 menit

 Alirkan dan hapus sisa minyak

 Basuh dibawah air mengalir selama 5 menit

 Warnai dengan Carbol Fuchsin 20-30 menit

 Cuci dengan air mengalir

 Cuci dengan alkohol asam 1% selama 1 menit hingga jaringan bewarna merah
jambu
  Cuci dengan air mengalir

 Warnai dengan Methylen Blue hingga jaringan bewarna biru muda

 Bilas dengan air kran

 Keringkan dengan kertas penghisap dan biarkan hingga kering betul

 Inkubasi dalam xylol 2 kali selama 1-2 menit

 Tutup dengan kaca penutup yang diberi Kanada balsem/etelan

Hasil/ Interpretasi hasil: Bakteri tahan asam (BTA) akan memberikan warna merah

Pewarnaan Malloy Azan (M-A)

Teknik pewarnaan:

Irisan jaringan berturut-turut dimasukkan ke dalam:

a. Xylol 1, 2, 3, masing-masing 3 menit

b. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

c. Alkohol 95 % 1, 2 masing-masing 3 menit

d. Aquades

e. Lugol iodin 5 - 10 menit

f. Aquades

g. Sodium Thlosulfat 5% selama 5 menit

h. Aquades 10 -20 menit

i. Acid fuchsin 1- 5 menit

j. Anilin blue orange G 30 - 60 menit

k. Alkohol 95% 1, 2 masing-masing 3 menit

l. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

m. Mounting dengan enthelen/ canada balsem

Hasil:
 Serabut jaringan ikat : biru

Serabut otot : merah

Inti : merah

Sitoplasma : merah pucat

Pewarnaan Verhoef Van Gieson (VVG)

Prosedur pewarnaan VVG adalah sebagai berikut:

1. Irisan jaringan berturut-turut dimasukkan ke dalam:

2. Xylol 1, 2, 3, masing-masing 3 menit

3. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

4. Alkohol 95 % 1, 2 masing-masing 3 menit

5. Alkohol 70% 3 menit

6. Aquades

7. Verhoef 15 menit

8. Aquades

9. FeCl3 beberapa celup hingga jaringan elastik tampak gelap dari jaringan sekitarnya.

10. Sodium Thiosulfat selama 1 menit

11. Aquades

12. Van Glison's 3 menit

13. Alkohol 95% 1, 2 masing-masing 3 menit

14. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

15. Mounting dengan enthelen/ canada balsam

Hasil:

Serabut elastik : hitam

Inti : kuning pucat

Kolagen : kuning pucat

Jaringan sekitar : kuning pucat
Pewarnaan Impregnasi Perak

Prosedur pewarnaan impregnasi perak adalah sebagai berikut:

1. Irisan jaringan block parafin berturut-turut dimasukkan ke dalam:

2. Xylol 1, 2, 3, masing-masing 3 menit

3. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

4. Alkohol 95 % 1, 2 masing-masing 3 menit

5. Periodic acid 15 menit

6. Aquades

7. Silver nitrat 2% 30 menit

8. Amoniacal silver 15 - 30 menit

9. Aquades 2 kali

10. Formalin 30% 3 menit

11. Aquades

12. Gold Cloride 0,2% satu kali celup

13. Aquades

14. Sadium Thlosulfat 3 - 5 menit

15. Nuclear fast red 3 - 5 menit

16. Cuci aquades

17. Alkohol 95% 1, 2 masing-masing 3 menit

18. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

19. Xylol 1, 2 masing-masing 3 menit

20. Mounting dengan enthelen/ canada balsem

Hasil:

Serabut-serabut reticuler: hitam, serabut-serabut kolagen: kuning sampai coklat.

Pewarnaan Periodeic Acid Schiff

Prosedur pewarnaan periodic acid Schiff adalah sebagai berikut:

1. Irisan jaringan berturut-turut dimasukkan ke dalam:

2. Xylol 1, 2, masing-masing 1 menit

3. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 1 menit

4. Alkohol 95 % 1, 2 masing-masing 1 menit

5. Aquades

6. Periodic acid 5 menit

7. Schiff selama 15 menit

8. Sulfuric acid 1, 2, 3 masing-masing 2 menit

9. Aquades 5 - 10 menit

10. Harris hematoxylin 1 menit

11. Aquades

12. Alkohol 95% 1, 2 masing-masing 3 menit

13. Alkohol absolut 1, 2 masing-masing 3 menit

14. Xylol 1, 2 masing-masing 3 menit

15. Mounting dengan enthelen/ canada balsem

Hasil:

Inti biru, Glicogen, mucin, retikulum, basemen membran: magenta

7. Identifikasi Tehnik Pewarnaan Preparat
Pewarnaan Periodic Acid Schiff

A B
Gambar 5.1 Contoh Pewarnaan Periodic Acid
Keterngan:
A. Tampak multiple budding sel (→) pada perbessaran 450x
B. Tampak multiple budding sel (→) pada perbessaran 1000x

Pewarnaan Gomori Methenamine Silver

Gambar 5.2 Contoh Pewarnaan Gomori Methenamine Silver

Pewarnaan GMS-HE

A B
Gambar 5.3 Contoh Pewarnaan GMS-HE
Keterangan:
A. Tampak multiple budding sel (→) pada pembesaran 1000x.
B. Tampak multiple budding sel yang mempunyai bentukan khas seperti kemudi
kapal
Pewarnaan Haematoxilyn Eosin

A B
Gambar 5.4 Contoh Pewarnaan Haematoxilin Eosin
Keterangan:
A. Tampak adanya bentukan sclerotic bodies yang berwarna coklat (→), pada
pembesaran 450x
B. Tampak adanya bentukan sclerotic bodies yang berwarna coklat (→), pada
pembesaran 1000x.

Pewarnaan KOH

Gambar 5.5 Contoh Pewarnaan KOH

Pewarnaan Alcian Blue – PAS

A B
Gambar 5.6 Contoh Pewarnaan Alcian Blue – PAS
Keterangan:
A. Gambar perbesaran 450x
B. Gambar perbesaran 1000x
Pewarnaan Mayer’s Mucicarmine

A B
Gambar 5.7 Contoh Pewarnaan Mayer’s Mucicarmine
Keterangan:
A. Perbesaran 450x
B. Perbesaran 1000x

Pewarnaan Giemsa

Gambar 5.8 Contoh Pewarnaan Giemsa dengan perbesaran 1000x

Pewarnaan Toluidine Blue

A B
Gambar 5.9 Contoh Pewarnaan Toluidine Blue
Keterangan:
A. Perbesaran 450x
B. Perbesaran 1000x
Pewarnaan Gram Twort

A B
Gambar 5.10 Contoh Pewarnaan Gram Twort
Keterangan:
A. Perbesaran 1000x
B. Perbesaran 450x

Pewarnaan Gram Pewarnaan NADH

Gambar 5.11 Contoh Pewarnaan Gram

Gambar 5.12 Contoh Pewarnaan NADH

Pewarnaan Alkaline Phosphatase

Gambar 5.13 Contoh Pewarnaan Alkaline Phosphatase

Pewarnaan Safranin

A B
Gambar 5.14 Contoh Pewarnaan Safranin
(A: Batang sirih melintang, B: akar Rhoe discolor)

Pewarnaan Van Giessen Pewarnaan Azocarmien

Gambar 5.15 Contoh Pewarnaan Van

Giessen Gambar 5.16 Contoh Pewarnaan
Azocarmien

Pewarnaan Cresyl Violet Pewarnaan Nissl

Gambar 5.17 Contoh Pewarnaan Cresyl

Violet Gambar 5.18 Contoh Pewarnaan Nissl
Pewarnaan Wright

Gambar 5.19 Contoh Pewarnaan Wright

Pewarnaan Methylene Blue

A B
Gambar 5.20 Contoh Pewarnaan Methylene Blue
(A: Sel Yeast, B: Clostridium tetani)

Pewarnaan Masson’s Trichrome

Gambar 5.21 Contoh Pewarnaan Masson’s Trichrome

 Pewarnaan Osmic Acid or Osmium Tetroxide (OSO4)

Gambar 5.22 Contoh Pewarnaan OSO4

8. Metode Pewarnaan Tulang

Alizarin Red merupakan suatu metode untuk mengetahui pembentukan tulang

pada embrio atau untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio. Pewarnaan
Alizarin Red kita gunakan untuk mengetahui pembentukan tulang pada embrio atau
untuk mendeteksi proses kalsifikasi pada tulang embrio yang terjadi pada tulang
keras. Tulang yang diwarnai oleh Alizarin red akan berwarna merah tua, yang
menandakan bahwa tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna merah tua
terbentuk karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang.
Proses kalsifikasi pada embrio ayam dapat diamati ketika mulai umur inkubasi 9
hari. Selain metode pewarnaan alizarin red juga terdapat metode Alician Blue yang
digunakan pada tulang rawan (Jessop, 1988).

Pewarnaan alizarin red ini digunakan untuk mendeteksi proses klasifikasi pada
tulang embrio. Tulang yang diwarnai menggunakan alizarin red akan berwarna
merah tua apabila tulang tersebut telah mengalami kalsifikasi. Warna ini muncul
karena zat warna yang diberikan terikat oleh kalsium pada matriks tulang (Jasin,
1989). Teknik pewarnaan pada tulang dengan zat warna alizarin red. Bagian dalam
modifikasi akan berwarna merah. Bagian tersebut seperti: tulang dahi (frontal),
tulang rahang, radius ulna, tulang ujung jari, scapula, tulang rusuk, femur, tibia, serta
fibula (Sukra, 2000).

Alat dan bahan yang digunakan adalah cawan petri, baki, 8 botol sampel, kertas
label, spuit injeksi tanpa jarum, pipet tetes, fetus mencit (Mus musculus), larutan
alkohol 96%, akuades, KOH 1%, KOH 2%, larutan pewarna AR, NaCl fisiologis,
larutan penjernih A (gliserin 20 bagian + KOH 4% 3 bagian + akuades 77 bagian),
larutan penjernih B (gliserin 50 bagian + KOH 4% 3 bagian + akuades 47 bagian),
dan larutan penjernih C (gliserin 75 bagian + akuades 25 bagian).

Cara Kerja:

1. Fetus mencit diletakkan di cawan petri.

2. Bagian amnion fetus dibuang.

3. Fetus mencit dibersihkan dengan cara dimasukkan ke NaCl fisiologis selama

10 menit.

4. Fetus mencit dimasukkan ke akuades selama 10 menit untuk membilas.

5. Fetus mencit dimasukkan ke dalam larutan alkohol 96% dan direndam

selama 12 jam.

6. Larutan diganti dengan akuades dan direndam selama 10 menit.

7. Larutan diganti dengan KOH 1% dan direndam selama 3 jam.

8. Larutan diganti dengan pewarna AR dan direndam selama 4 jam.

9. Larutan diganti dengan KOH 2% dan direndam selama 30 menit.

10. Larutan diganti dengan larutan penjernih A, B dan C dan direndam masing-
masing selama 1 jam.

11. Bagian yang terwarnai diamati dan didokumentasikan tiap tahapannya.

Gambar 5.23 Fetus Mencit dalam KOH 1% (Ariana, 2013).

 Gambar 5.24 Embrio muscus dengan Pewarnaan Alizarian Red (Ariana, 2018).

Menurut Huffman et al (2007), tulang merupakan jaringan vaskuler unik yang

mengalami mineralisasi sebagai bagian dari proses perkembangannya. Mineral pada
tulang memiliki peran penting terhadap fungsi tulang belakang, termasuk
menyokong struktural, penyimpanan reversibel kalsium dan fosfor, dan tempat
menyimpan kandungan logam dan karbon.
Kualitas preparat skeleton dipengaruhi oleh komposisi bahan, tahapan
pelaksanaan protokol, dan skill laboratorium praktikan. Gambar 1 menunjukkan hasil
akhir dari eksperimentasi skeleton. karena zat warna yang diberikan terikat oleh
kalsium pada matriks tulang. (Soeminto, 2002).

1.3 Kegiatan Pembelajaran (KB)

Unit 5 ini mempelajari metode pewarnaan jaringan yang teridi dari 2 KB
1.3.1 Kegiatan Pembelajaran 1
Pada Unit 5 KB 1 ini mahasiswa mempelajari Tujuan pewarnaan,
Pewarnaan Vital, supravital dan Vital, Penggolongan Zat warna , Pemilihan Jenis zat
Warna.
1.3.1.1 Koneksi
Pada Unit sebelumnya saudara sudah mempelajari metode paraffin.Tahapan-tahapan
yang dilakukan sebelumnya sangat penting utuk menentukan langkah selanjutnya Jelaskan
tahapan penting/pokok yang dilakukan pada pembuatan preparat dengan metode paeafin.
Setelah menemukan tahapan penting pada metode paraffin. Temukan kembali tahapan
spesifik khusus pada metode paraffin.
 Proses pewarnaan jaringan merupakan bagian yang sangat penting agar preparat
dapat diamati elemen-elemen selulernya. Pewarnaan jaringan tergantung pada bahan
jaringan yang akan diwarna, sehingga jaringan yang berbeda membutuhkan teknik
pewarnaan yang berbeda.

1.3.1.2 Tugas
Setelah membaca modul unit 5, dan melihat tayangan video melalui link Metode
pewarnaan jaringan dan membaca ppt. dan membaca ppt. Kerjakan latihan soal di bawah ini
secara mandiri.

1. Apa yang saudara ketahui tentang metode pewarnaan jaringan

2. Carilah sebuah artikel/literatur yang menggambarkan jaringan dengan

pewarnaan tertentu. (vital, non vital dan supravital) Tulis kembali hasil ulasan
saudara dan Unggah hasil pekerjaan sebagai Produk Unit 4 KB 1_Individu

1.3.1.3 Diskusi
Sebelum kegiatan diskusi dimulai, dimohon mahasiswa mencari pasangan sendiri-
sendiri, jika jumlah anggota kelas ganjil maka diperkenankan diskusi bertiga. Tuliskan
pasangan saudara di forum kelas agar diketahui yang lain. Pastikan bahwa tidak ada satupun
dari saudara yang tidak mendapatkan pasangan. Jika semua mahasiswa sudah memperoleh
pasangan. Selanjutnya bekerjalah berpasangan terkait hal-hal berikut:

Diskusikan tentang pewarnaan vital, non vital dan supravital. bersama pasangan.
Kritisi pekerjaan teman, Diskusikan pula tentang penggolongan dan pemilihan zat warna.
Berikan saran perbaikan untuk pekerjaan teman, kemudian diperbaiki sama-sama. Setelah
direvisi, Unggah pekerjaan kelompok saudara sebagai Produk Unit 5 KB 1_Kelompok.

1.3.1.4 Refleksi
Setelah mahasiswa mempelajari modul, mengerjakan tugas dan berdiskusi, Hal-hal
menarik apa yang dapat saudara temukan pada pembelajaran ini. Adakah kendala kendala
yang ditemui dalam metode paraffin. pada tahap yang dipelajari di unit 5 KB 1 ini. Tuliskan
di laman LMS.

1.3.2 Kegiatan Pembelajaran 2

 Pada Unit 5 KB 2 ini mahasiswa mempelajari materi hal-hal yang harus dipersiapkan
sebelum pewarnaan, Pengolahan zat warna, Identifikasi Tehnik Pewarnaan Preparat, Metode
Pewarnaan tulang.
1.3.2.1 Koneksi
Pada Unit 5 KB 1 sebelumnya saudara sudah mempelajari tujuan pewarnaan,
pewarnaan vital, non vital dan supravital, Mempelajari penggolongan pewarna dari berbagai
aspek sangat penting dalam menentukan pemilihan zat warna. Faktor factor apa sajakah yang
harus diperhatikan pada pewarnaan jaringan. Apakah kaitan/ efek sebelumnya dengan proses
selanjutnya pada langkah-langkah metode pewarnaan? Pada Pembelajaran ini akan dipelajari
tahapan lanjutan dan hal-hal yang perlu diperhatikan dalam metode pewarnaan.

1.3.2.2 Tugas
Setelah membaca modul unit 5 materi materi hal-hal yang harus dipersiapkan
sebelum pewarnaan, Pengolahan zat warna, Identifikasi Tehnik Pewarnaan Preparat, Metode
Pewarnaan tulang dan melihat tayangan video melalui link Metode pewarnaan dan membaca
ppt. Kerjakan latihan soal di bawah ini secara mandiri.

1. Hal-hal apa sajakah yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan jaringan?

2. Jelaskan proses Pewarnaan (Staining) pada metode pembuatatan preparat

kenapa eknik ini perlu dilakukan? Carilah beberapa eknik pewarnaan dari
berbagai literature.

Unggah hasil pekerjaan sebagai Produk Unit 5 KB 2_Individu

1.3.2.3 Diskusi
Sebelum kegiatan diskusi dimulai, dimohon mahasiswa mencari pasangan sendiri-
sendiri , jika jumlah anggota kelas ganjil maka diperkenankan diskusi bertiga. Upayakan
bertukar pasangan dari kelompok sebelumnya. Tuliskan pasangan saudara di forum kelas
agar diketahui yang lain. Pastikan bahwa tidak ada satupun dari saudara yang tidak
mendapatkan pasangan. Jika semua mahasiswa sudah meperoleh pasangan. Selanjutnya
bekerjalah berpasangan terkait hal-hal berikut :

Diskusikan tentang berbagai teknik pewarnaan jaringan . dan pewarnaan tulang

bersama pasangan. Kritisi pekerjaan teman, Berikan saran perbaikan untuk pekerjaan
teman,kemudian temukan hal yang harus diperhatikan pada setiap tahapan. Unggah
pekerjaan saudara sebagai Produk Unit 5 KB 2_Kelompok.
1.3.2.4 Refleksi
Setelah mahasiswa mempelajari modul, mengerjakan tugas dan berdiskusi, Hal-hal
apa sajakah yang menarik pada pembelajaran ini. Adakah kendala kendala yang ditemui
dalam pembuatan preparat metode paraffin pada tahap yang dipelajari di KB 2 ini. Tuliskan
di laman LMS.

1.4 Rangkuman

1. Pewarnaan merupakan proses yang penting, Tanpa pewarnaan, sel dan jaringan
tumbuhan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.

2. Pewarnaan adalah proses pemberian warna pada jaringan sehingga unsur jaringan
menjadi kontras dan dapat diamati dengan mudah menggunakan mikroskop.

3. Pewarnaan bertujuan mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan

sehingga mempermudah dan mempercepat identifikasi sel serta komponen-
komponen seluler. sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.

4. Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui

fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling lazim digunakan,
terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, Pewarnaan rutin biasanya menggunaan
HE

5. Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam
keadaan hidup perwarnaan sel yang masih hidup dan tidak difiksasi,disebut
supravital

6. Zat warna dapat dibedakan berdasarkan sifatnya (asam, basa) berdasarkan asalnya
(alami, sintetis), berdasarkan kemampuan menyerap zat warna (substantif dan
ajektif), jumlah/komposisi zat warna (tunggal/ rangkap); berdasarkan strukturnya
(umum, khusus)

7. Pemilihan jenis zat warna didasarkan pada obyek spesifik yang akan diamati seperti
dinding sel, membran sel. Lipid, asam nukeat, pewarnaan inti, sitoplasma, sabut
syaraf dll.

8. Berbagai teknik pewarnaan meliputi Haematoxylin dengan berbagai kombinasinya.

Pewarnaan eosin. Pewarnaan safranin, pewarnaan Giemza, Pewarnaan H-E, M-A,
 VVG, PAS, dlsb

1.5 Penilaian

Setelah menyelesaikan Materi unit 5, selanjutnya kerjakan soal-soal di bawah ini.

Analisislah dan Kembangkan metode pewarnaan jaringan, dengan membaca artikel jurnal
ilmiah mikroteknik metode pewarnaan , Terutama bagian metode pewarnaan dan hasilnya.
Tulislah dalam bentuk makalah atau laporan. Word. Times New Roman 12, Spasi 1.15 A4.
Margin 4433