BIOLOGI MOLEKULER (Pertemuan

VI)

ISOLASI DNA

Rudina Azimata R., S.Si., M.Biomed

 PENDAHULUAN
• Pada tahun 1995  para ilmuwan menyelesaikan
keseluruhan sekuen genom satu organisme yaitu
bakteri haemophilus influenzae.
• Pada tahun 2007  para peneliti telah mampu
menyelesaikan sekuen genom ratusan organisme
prokariot dan puluhan organisme eukariot
termasuk sejumlah tiga milyard pasang basa pada
genom manusia.
 PENDAHULUAN
• Capaian ini mendorong majunya teknologi DNA
yaitu suatu metode untuk memanipulasi DNA yang
berakar dari penelitian di tahun 1970an.
• Keberhasilan yang merupakan kunci adalah
penemuan tentang teknik membuat rekombinasi
DNA yaitu pembuatan molekul DNA yang berasal
dari segmen DNA dengan sumber yang berbeda
(dua spesies yang berbeda).
 ISOLASI DNA
• Tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA
• DNA dapat ditemukan di kromosom inti maupun
organel  mitokondria dan kloroplas.
• Ekstrak DNA didapatkan dengan memecahkan
dinding sel dan membran inti, dilanjutkan dengan
pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang
lain.
• DNA tetap dijaga agar tidak rusak
• DNA didapatkan dalam bentuk rantai panjang
APLIKASI TEKNOLOGI
DNA

• Definisi kloning
• Prinsip dasar kloning
• Proses terjadinya kloning
• Contoh aplikasi teknologi DNA
• Dalam rekayasa genetika  DNA dan RNA
• DNA (Deoxyribonucleic Acid) : penyimpan informasi
genetika
• Informasi  melambangkan suatu keteraturan,
kebalikan dari entropi yaitu ketidakteraturan atau
acak
• Komputer penyimpan, pengolah dan penarikan
informasi, bahasa komputer: unit informasi bit
(binary digit)
• Jumlah dan jenis informasi yg terdapat di dalam sel
manusia masih melampaui sel pembuatan program
oleh komputer
• DNA : molekul yang sangat panjang terdiri dari
ribuan deoksinukleotida (4 jenis) yang
bergabung dalam suatu urutan yg bersifat khas
bagi setiap organisme
• Sel eukariotik memiliki DNA yang lebih besar
dibandingkan dgn prokariotik, DNA ini
membentuk kromosom dalam nukleus yang
dikelilingi membran
• Virus terdapat RNA atau DNA
• RNA dalam sel : RNA ribosom (r RNA), RNA
pemindah (t RNA) dan RNA data (m RNA)
 EKSTRAKSI dan
PURIFIKASI DNA
 EKSTRAKSI DNA

Why we do
it
 Faktor-faktor yang mempengaruhi
ekstraksi DNA
• Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria
maupun organel lain dengan cara
diekstraksi/dilisiskan  dihomogenasi dengan
penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA rusak.
• Proses pemisahan DNA dari komponen sel yang
lain, termasuk debris sel  disentrifugasi
• Untuk menghindari kontaminan, jaringan dijaga
tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi.
• Presipitasi DNA (lanjutan ekstraksi) dengan etanol
absolut atau isopropanol
• Semua bahan akan larut dalam etanol dingin selain
DNA.
• Saat sentrifugasi, DNA mengendap dan terpisah
dari bahan lain
• Pada sampel darah, presipitasi dengan cara Salting-
Out  Isolasi DNA organ dan darah
 DENATURASI DAN
RENATURASI DNA
• Faktor-faktor yang mempengaruhi proses
denaturasi dan renaturasi molekul DNA:
1.Suhu
2.Derajat keasaman (pH) yang ekstrem
3.Konsentrasi isoelektrolit
4.Perbandingan kandungan antara basa nukleotida
GC terhadap AT
What do we need DNA for?

 Forensik/DNA profiling
 Kloning
 Diagnosis penyakit
 Sekuensing DNA
 Genetically modified organism (GMO)
 Pengujian lingkungan
 Sistematika ekstraksi dan purifikasi DNA

Penumbuhan sel
Panen sel dan lisis

Pemekatan DNA Purifikasi DNA

1. Ekstraksi sel
Butuh reagen LYSIS

• detergen
• Buffer
• enzim protease
• panas

“cell extract”
DETERGEN
Melarutkan lipid pada
membran sel
CTAB
(hexadecyltrimethylam
monium bromide) – sel
tumbuhan
Laurylsarcosine—
bakteri gram negative
DETERGEN

• Soap molecules and grease molecules are made of two

parts:
• Heads, which like water
• Tails, which hate water.
DETERGEN

• Sel mempunyai membran lipid double layer dan

protein.
DETERGEN

• When detergent comes close to the cell, it captures

the lipids and proteins.
Enzim protease—Proteinase K

• Menghilangkan nuclear protein, enzim

• Memecah ikatan peptida
• Bisa ditambahkan atau tidak (optional)

Panas
 Paling sering 40-60ºC

Buffer
 Tris HCl pH 8 untuk menjaga stabilitas DNA
2. Penghilangan protein & RNA

a. Ekstrak sel dicampur dengan fenol, perlahan!

b. Tambahkan Rnase pada lapisan aqueous
3. Pemekatan konsentrasi DNA

70% final conc.

Sentrifugasi

“spooling” Ethanol precipitation

 ANALISIS KUANTITATIF DNA

• Absorbansi/Optical density (OD): c x b x (extinction

coefficient, E).
• Asam nukleat mengabsorbsi sinar UV pada 260 nm

•       1 A260 O.D. unit for dsDNA = 50 µg/ml

•       1 A260 O.D. unit for ssDNA = 33 or 50 µg/ml

•       1 A260 O.D. unit for RNA = 40 µg/ml

Spectrophotometric analysis of DNA
 Double-stranded and single-stranded DNA differ in their
optical absorption at 260 nm

dA
dG nucleotides
dU ssDNA
dC dsDNA

The conjugated -electron systems of The absorbance of double-stranded

the purine & pyrimidine bases absorb DNA (dsDNA) at 260 nm is less than
strongly in the UV. (That’s why UV that of either single-stranded DNA
light is mutagenic and carcinogenic.) (ssDNA) or the free bases. This is
called “hypochromism.”
Kemurnian DNA
• The purity of the DNA is reflected in the OD260:OD
280 ratio and must be between 1.6 and 2.00.
• Decreased 260:280 ratio means that contaminating
protein is still present.
 ANALISIS KUALITATIF
• Metode: Elektroforesis Gel Agarose

buffer     
wells
Anode
Cathode (positive)
(negative)
Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at
least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.
 Agarose

D-galactose 3,6-anhydro
L-galactose

•Sweetened agarose gels have been

eaten in the Far East since the 17th
century.

•Agarose was first used in biology

when Robert Koch* used it as a
*Lina Hesse, technician and illustrator for culture medium for Tuberculosis
a colleague of Koch was the first to bacteria in 1882
suggest agar for use in culturing bacteria

Agarose is a linear polymer extracted

PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER, 2007 from seaweed.
• DNA is negatively charged.
• When placed in an electrical field, DNA will migrate toward the positive
pole (anode).
• An agarose gel is used to slow the movement of DNA and separate by size.

H O2
 

DNA
- +

• Polymerized agarose is porous,

Power allowing for the movement of DNA
Scanning Electron Micrograph of
Agarose Gel (1×1 µm) 
How fast will the DNA migrate?
strength of the electrical field, buffer, density of agarose gel…
Size of the DNA!
*Small DNA move faster than large DNA
…gel electrophoresis separates DNA according to size

DNA

small
large
- +

Within an agarose gel, linear DNA migrate inversely

Power
proportional to the log10 of their molecular weight.
Want to know more?

Just ask!
TO ACCOMPLISH
GREAT THINGS WE
MUST NOT ONLY
ACT BUT ALSO
DREAM NOT ONLY
PLAN, BUT ALSO
BELIEVE.

THE SECRET OF
LIFE IS TO KNOW
WHO YOU ARE
AND WHERE YOU
ARE GOING