METODE

EKSTRAKSI DNA

Unit Riset Biomedik RSUP NTB

 Ekstraksi DNA

Tujuan:

•Membuang protein

•Memilih DNA atau RNA

•Isolasi spesifik tipe DNA

(atau RNA)
Beberapa macam metode:

•differential solubility :
perbedaan kelarutan molekul

•‘adsorption’ methods:
sifat melekat/menempel

•density gradient centrifugation:

berdasarkan berat
jenis/kepadatan molekul
Jenis DNA:

• Keseluruhan : genomic (chromosomal)

• organellar (satellite)

• plasmid (extra-chromosomal)

• phage/viral (ds atau ss)

• complementary (mRNA)
Komponen tambahan yang umum:

•denaturing cell lysis (SDS, alkali,

boiling, chaotropic)

• enzyme treatments
-protease
-RNase (DNase-free)
-DNase (RNase-free)
 Berbagai jenis spesimen?
Darah Puntung rokok
Sperma Kuku
Saliva Permen karet
Urine Feces
Rambut (dengan akar) Tulang
Gigi Jaringan
Hal penting yang berpengaruh
pada saat ekstraksi DNA?
1. DNA yang didapat harus maksimal
2. Singkirkan inhibitors/penghambat
3. Singkirkan atau hambat nucleases
4. Kualitas DNA harus maksimal
5. Double strand vs. Single strand
(RFLP or PCR)
Seberapa banyak DNA dapat
diperoleh?
• Sel diploid mengandung
sekitar 6 pg DNA
• Sperma mengandung sekitar
3 pg DNA
• Rata-rata leukosit orang
dewasa adalah 5 - 10 X 106
sel per ml darah. Maka
secara teoritis per ul darah
mengandung 30 - 60 ng DNA
• Setiap reaksi PCR membutuhkan sekitar
1 ng DNA (single atau double stranded).
• 1 ng DNA setara dengan 1/20 ul darah,
atau 350 sel sperma.
• Banyak kit komersial mempunyai
sensitivitas hingga di bawah 1 ng DNA
(100-250 pg).
 Metode apa yang paling sering
digunakan?
• Organic (Phenol-Chloroform) Extraction
• Non-Organic (Proteinase K and Salting out)
• Chelex (Ion Exchange Resin) Extraction
• FTA Paper (Collection, Storage, and
Isolation)
• Silica Based (Silica exchange resin- Qiagen)
 REAGESIA ORGANIK UNTUK
EKSTRAKSI
• Cell Lysis Buffer - Non-ionic detergent,
Garam, Buffer, EDTA berfungsi
melisiskan membran sel darah dan
epitel, tapi tidak merusak membran inti.

• EDTA (Ethylenediaminetetraacetic
disodium salt) berfungsi menghambat
kerja Dnase nucleases.
Secara alami DNA terbungkus rapi
• Proteinase K –
Menyingkirkan protein dengan cara
mencernanya menjadi peptida
Aktifitas proteinase K 10 x lebih kuat
pada protein denaturasi
• Phenol/Chlorform – larutan standar untuk
membuang protein
perbandingan volume 1:1
• Phenol/Chloroform/Isoamyl dengan
perbandingan 25:24:1 alkohol berfungsi
menghindari terjadinya busa
• Ethanol absolut
presipitasi dan pencucian DNA
 Pemekatan DNA
presipitasi ethanol
• Pengendapan DNA optimal sangat
tergantung konsentrasi DNA
• Pemutaran/sentrifus pada 12,000 rpm
selama 15 menit membantu
pengendapan.
 Concentrating DNA
Microcon®100 Centrifugal Filter Unit
Contoh proses pemurnian DNA
Visualisasi hasil isolasi DNA