Kepada Yth. : dr.Hj.Darmawaty ER, Sp.

PK(K) TUTOR HEMATOLOGI

Rencana baca : Rabu 5 Februari 2020 (08.00)
Tempat : RSP Gedung A, Lantai 4

TES IMMATURE RETICULOCYTE FRACTION (IRF)

DENGAN METODE FLOW CYTOMETRY
Ullifannuri Rachmi, Darwati Muhadi, Mansyur Arif
Departemen Ilmu Patologi Klinik FK UNHAS RSUP DR Wahidin Sudirohusodo

I. PENDAHULUAN
Retikulosit merupakan eritrosit muda yang tidak berinti dan berasal dari
proses pematangan normoblas di sumsum tulang. Retikulosit termasuk salah satu
tahapan dalam eritropoiesis. Tahapan eritropoiesis dimulai dengan rubiblas
(proerythroblast) kemudian diikuti prorubisit (basophilic erythroblast), rubrisit
(polychromatophilic erythroblast), metarubisit (orthochromatic erythroblast),
retikulosit (polychromatophilic erythrocyte) dan eritrosit. Pematangan eritrosit
memerlukan sekitar 5-7 hari mulai dari rubiblas sampai menjadi eritrosit
matang.1,2,3
Retikulosit mempunyai organela basofilik yang terdiri dari RNA dan
protoforpirin. Retikulosit yang belum matang memiliki benang-benang atau
retikulum di dalamnya. Sisa RNA tadi akan menghilang dalam 1-2 hari pertama
setelah berada diluar sumsum tulang, kemudian eritrosit yang belum matang
kemudian menjadi eritrosit yang matur atau matang. Eritrosit yang beredar sebagai
retikulosit sekitar 1-2%. Jumlah tersebut menunjukkan aktivitas sumsum tulang
yang normal apabila hemoglobin (Hb) normal. Eritropoiesis inefektif dicurigai bila
hitung retikulosit normal atau sedikit meningkat tetapi terdapat hyperplasia eritroid
pada sumsum tulang. Eritropoiesis inefektif terjadi pada beberapa penyakit seperti
anemia pernisiosa, thalassemia, dan anemia sideroblastik.1,2,4
Eritropoiesis yang efektif dapat dimonitor melalui pengukuran retikulosit.
Pengukuran retikulosit yang akurat merupakan kunci awal untuk klasifikasi
anemia. Retikulosit dapat diidentifikasi dengan pengecatan BCB (Brilliant Cresyl
Blue) dan Methylene Blue yang menggambarkan adanya presipitasi dari RNA

1
ribosom. Hasil pewarnaan ini dapat dihitung secara manual. Jumlah RNA yang
terdapat dalam retikulosit dapat diukur secara otomatis dengan metode flow
cytometry.4,5
Analisa retikulosit dengan flow cytometry di lakukan dengan mencampur
darah EDTA dengan zat warna fluoresens, diinkubasi pada ruang gelap dalam
suhu ruang selama beberapa detik. Zat warna fluoresens masuk melalui membran
sel, mewarnai RNA retikulosit dan DNA/RNA sel berinti sehingga menimbulkan
fluoresensi setelah penyinaran laser. Berdasarkan derajat fluoresensi, dibagi
menjadi tiga yakni, Low Fraction Reticulocyte (LFR), Middle Fraction
Reticulocyte (MFR), High Fraction Reticulocyte (HFR). Distribusi ini berkaitan
dengan proses maturasi. Immature Reticulocyte Fraction (IRF) merupakan
penjumlahan dari fraksi HFR dan MFR. IRF merupakan menggambarkan proporsi
retikulosit muda yang mengandung RNA paling tinggi. Persentase IRF dapat
meningkat dalam beberapa jam, dibandingkan nilai retikulosit yang meningkat 2-
3 hari.5,6
Pemeriksaan IRF memiliki fungsi antara lain ; sebagai parameter indikator
kesembuhan sumsum tulang pada pasien leukemia akut yang telah mendapat
kemoterapi, sebagai parameter keberhasilan pasien post operasi transplantasi
sumsum tulang, IRF juga sebagai indikator awal respons terapi eritropoietin pada
pasien anemia dengan gagal ginjal kronis, AIDS, dan keganasan. Pemeriksaan IRF
dengan hitung retikulosit dapat memantau respon terapi pasien anemia yang
mendapat vitamin besi, folat, vitamin B12. Pemeriksaan IRF dapat membantu
penegakkan diagnosis anemia aplastik. Persentase IRF 0% menunjukkan kondisi
pansitopenia disebabkan oleh anemia aplastik.5,6,7,8,9
Parameter IRF dapat diperiksa bersamaan dengan parameter hematologi lain
seperti hitung retikulosit dengan alat hematologi otomatis sehingga hasil dapat
diperoleh lebih mudah dan lebih cepat.1,4
Tutor ini akan membahas tes IRF dengan metode flow cytometry
menggunakan alat Sysmex XN-1000.

2
II. TUJUAN
Tes ini bertujuan mengukur kadar IRF dengan metode flow cytometry
menggunakan alat Sysmex XN-1000.
III. METODE
A. PRA ANALITIK 10
1. Persiapan pasien :
Tidak ada persiapan khusus.
2. Persiapan sampel :
Darah yang digunakan adalah darah dengan antikoagulan ethylene
diamin tetraacetic (EDTA). Pemeriksaan dilakukan maksimal 4 jam
setelah pengambilan sampel.
3. Alat dan Bahan :
Alat :
a. Automated Hematology analyzer Sysmex XN-1000 (gambar 2)

Gambar 1. Sysmex XN-1000

(Sumber : https://www.sysmex.com/us/en/Company/News/Spring2013/Pages/XN-Series.aspx)

3
Bahan :
a. Whole blood dalam tabung EDTA
b. Reagen Fluorocell RET (Polymethine dye 0,03%) dan cellpack
DFL (Tricine Buffer 0,17%) (Gambar 3)

Gambar 2. Reagen Flourocell RET dan Cellpack DFL

(Sumber : https://www.sysmex.com/us/en/Brochures/XN-Series%20 Automated
%20Hematology%20Analyzers_MKT-10-1176.pdf)

B. ANALITIK 6,10
1. PRINSIP TES
Metode pemeriksaan pada tes ini adalah metode flow cytometry.
Flow cytometry merupakan suatu metode untuk menganalisa sel dan
partikel secara simultan berdasarkan hamburan sinar saat sel tersebut
mengalir melewati sinar laser. Sampel darah EDTA sebanyak 5 µl di
dalam alat akan diencerkan dengan tricine buffer sebanyak 1 ml,
kemudian darah masuk ke dalan “reaction chamber”. Pada saat yang
bersamaan 20 µl fluorocell RET ditambahkan ke dalam darah yang
telah diencerkan tersebut hingga terbentuk pengenceran 1 : 204.
Setelah diinkubasi 27 detik darah yang telah diencerkan akan diwarnai
dengan pewarna spesifik yaitu polymethine yang mewarnai RNA yang
terkandung di dalam retikulosit. Sebanyak 3,3 µl darah yang telah
terwarnai akan dikirimkan ke optical detector block untuk dianalisis

4
secara fluorosensi oleh laser semi-konduktor. Retikulosit yang telah
terwarnai berjalan pada aperture yang disinari laser dan menghasilkan
fluorosensi yang ditangkap oleh suatu fotodioda. Berkas sinar yang
ditangkap dibagi menjadi 3, yaitu forward scattered light, side
scattered light dan lateral fluorescence light (Gambar 3).

Gambar 3. Prinsip Flow cytometry

(Sumber : https://www.sysmex-europe.com/academy/library/educational-articles-
seed/seed-the-importance-of-reticulocyte-detection-24914.html)

Forward scattered light akan memberi informasi tentang ukuran

sel sedangkan side scattered light akan memberikan informasi tentang
struktur-struktur intrasel misalnya granula-granula sel, bentuk inti sel
dan karakteristik lainnya. Side fluorescence light memberikan
informasi tentang kandungan RNA sehingga dapat menentukan
maturitas sel. Ketiga berkas sinar ditangkap fotodioda, kemudian akan
diplot dalam suatu scattergram.
Retikulosit berdasarkan intensitas fluoresensnya dibagi menjadi
tiga kategori stadium maturasi, yaitu : LFR (low-fluorescence
reticulocytes)/ retikulosit matur, MFR (medium-fluorescence
reticulocytes)/ retikulosit semi matur, HFR (high-fluorescence
reticulocytes)/ retikulosit imatur (Gambar 4). Nilai IRF diperoleh dari

5
 jumlah MFR dengan HFR. IRF juga di sebut sebagai Reticulocytes
Maturation Index.
IRF=MFR+ HFR

Gambar 4. Skema Scattergram Maturasi Retikulosit

(Sumber : https://www.sysmex-europe.com/academy/library/educational-
articles-seed/seed-the-importance-of-reticulocyte-detection-24914.html )

2. CARA KERJA10
a. Saat alat dinyalakan akan muncul layar menu utama (Gambar 5).

Gambar 5. Menu Utama Sysmex XN-1000

(Sumber : Dokumentasi pribadi)

6
b. Quality control dikerjakan dengan memasukkan tabung kontrol ke
dalam rak sampel dan dijalankan secara otomatis.
c. Tekan pilihan Worklist.
d. Tekan pilihan Regist. Pada layar muncul seperti pada Gambar 6.

Gambar 6. Layar Registration Order

(Sumber : Dokumentasi pribadi)

e. Scan barcode saat posisi kursor pada Sample No.

f. Tekan pilihan Discrete untuk memilih jenis tes yang diinginkan.
Pilih CBC+DIFF+RET.
g. Masukkan nomor rekam medik pasien pada kolom Patient ID.
Nama, tanggal lahir, ruang perawatan, jenis kelamin akan muncul
secara otomatis apabila alat terhubung dengan system informasi
laboratorium, seperti terlihat pada Gambar 6.
h. Pilih OK apabila data pasien seusai dengan data pada sampel. Layar
akan kembali ke Worklist dan proses pemeriksaan sampel dimulai.
i. Analisis manual dapat dilakukan dengan menekan tombol kedua
(warna abu-abu) pada alat Sysmex XN-1000 dan akan keluar rak
untuk sampel dari dalam alat. Tombol kedua terlihat pada gambar 7.

7
 Gambar 7. Tombol Kedua pada Sysmex XN-1000
(Sumber : Dokumentasi pribadi)

j. Saat tombol pada alat ditekan, panel pada bagian bawah dari
program akan berubah menjadi manual analysis.
k. Tekan pilihan dengan gambar tangan memegang tabung sampel
yang terbuka tutupnya.
l. Hilangkan centang pada Read ID, Scan barcode saat kursor berada
pada Sample No., masukkan nomor rekam medik pada Patient ID,
centang pemeriksaan yang diinginkan (DIFF dan RET) (gambar 8).
Apabila sampel ingin dikerjakan dengan tutup terpasang, hilangkan
centang pada Cap Open.

8
 Gambar 8. Layar Manual Analisa
(Sumber : Dokumentasi pribadi)

m. Tekan tombol pertama (warna biru) pada alat Sysmex XN-1000

seperti terlihat pada gambar 9. Rak sampel untuk pemeriksaan
manual akan masuk kembali ke alat dan proses pemeriksaan
dimulai.

Gambar 9. Tombol Pertama Sysmex XN-1000

(Sumber : Dokumentasi pribadi)

9
 n. Hasil akan keluar dalam waktu 80 detik. Hasil dapat dilihat pada
layar explorer dan dapat dilihat scattergramnya dengan double-
click pada data pasien yang dipilih.
o. Hasil akan dicetak secara otomatis atau dapat dicetak ulang dengan
memilih pilihan Output, kemudian pilihan Report.

C. PASCA ANALITIK
1. NILAI RUJUKAN11
Nilai rujukan IRF : 1.6 – 10.5%
2. INTERPRETASI 8,9,11
IRF merupakan penanda awal dan sensitif yang menunjukkan
aktivitas eritropoiesis.. Persentase IRF meningkat setelah beberapa
jam, dibandingkan nilai retikulosit yang meningkat 2-3 hari. Apabila
nilai IRF tidak meningkat selama terapi pemberian eritropoietin atau
vitamin pada pasien anemia defisiensi maka hal ini mengindikasikan
respon terapi yang buruk.
Nilai IRF bersamaan dengan hitung retikulosit dapat
memberikan gambaran kondisi klinis pasien yang sesuai (Tabel 2.1).

Tabel 2.1 : Interpretasi Hasil Pemeriksaan IRF dan Hitung Retikulosit

GAMBARAN KLINIS IRF RETIKULOSIT
Anemia Aplastik Menurun Menurun
Respon awal eritropiesis pada Menurun atau
kasus anemia post tidak mengalami Menurun
transplantasi sumsum tulang perubahan
Respon terapi EPO (hormone
Meningkat Meningkat
ertiropoietin)
Anemia hemolitik atau Meningkat Meningkat

10
 perdarahan akut
Anemia Megaloblastik,
Normal/
Myelodisplastic Syndrome, Rendah/Normal
Meningkat
Acute Leukemia
Pemulihan sumsum tulang
post kemoterapi atau anemia
Meningkat Normal/Rendah
megaloblastik yang merespon
terapi

3. SENSITIVITAS DAN SPESIFISITAS7,12

Pemeriksaan IRF dengan metode flow cytometry memiliki sensitivitas
92 % dan spesifisitas 99 %.

11
 DAFTAR PUSTAKA

1. Suega K. Aplikasi Klinis Retikulosit. Jurnal Penyakit Dalam Volume 11 No 3.

Divisi Hematologi-Onkologi Medik Ilmu Penyakit Dalam Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana, 2010.
2. Mohandas N. Structure and Composition of the Erythrocytes. In : Lichtman MA,
Beutler E, Seligsohn U, Kaushanky K, Kipps TO (penyunting). Williams
Hematology 9th Edition. McGraw-Hill Medical. United States of America. 2016.
P : 461-462
3. Prchal J.T, Thiagarajan P., Erythropoiesis. In : Lichtman MA, Beutler E,
Seligsohn U, Kaushanky K, Kipps TO (penyunting). Williams Hematology 9 th
Edition. McGraw-Hill Medical. United States of America. 2016. P : 479.
4. Longo D.L, et al. Anemia and Polycythemia. In : Harrison’s Hematology and
Oncology 3rd Edition. McGraw-Hill Medical. United States of America. 2017. P :
13-15.
5. Lucynski W., et al. Immature Reticulocyte Fraction (IRF) – an universal marker
of hemopoiesis in children with cancer ?. Journal of Advances in Medical
Sciences Vol.51. Department of Pediatric Oncology Medical University of
Bialystok. Poland. 2006. Avalaible from :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17357306. Diakses pada 31 Oktober 2019.
6. Siladjaja C.L. Profil Maturitas Retikulosit pada Orang Dewasa Normal serta
Pembawa Sifat Thalasemia-β atau Hemoglobin E. Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia. Jakarta. 2014.
7. Rauf Shan E., et al. Immature Reticulocyte Fraction and Absolute Neutrophil
Count as Predictor of Hemopoietic Recovery in Patients with Acute
Lymphoblastic Leukemia on Remission Induction Chemotherapy. Research
Article. Department of Hematology, Pakistan. 2016. P:131-134. Avalaible from :
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5100724/. Diakses pada 30
Oktober 2019.

12
8. Plapp F.V. Immature Reticulocyte Fraction. Clinlab navigator Test
Interpretations. Avalaible from : http://www.clinlabnavigator.com/immature-
reticulocyte-fraction.html. 2019. Diakses pada 5 November 2019.
9. Sindhu R, Behera SK, Mishra DP. Role of Immature Reticulocyte Fraction in
Evaluation of Aplastic Anemia in Cases of Pancytopenia. Departement of
Pathology,MCKG medical college. Indian Journal of Basic and Applied Medical
Research. 2016. P:619-624. Avalaible from :
https://pdfs.semanticscholar.org/dc80/f547ca2131a1e9c33c25b7fa4536139e5d06
.pdf. Diakses pada 9 November 2019.
10. Sysmex XN-1000 Instructions for Use. Kobe: Sysmex Corporation; 2014.
11. Koepke et al. The Importance of Reticulocyte Detection. Sysmex Educational
Enhancement and Development. 2016. P:1-8. Available from:
https://www.sysmex-europe.com/academy/library/educational-articles-seed/seed-
the-importance-of-reticulocyte-detection-24914.html. Diakses pada 29 October
2019.
12. Mitrani R., Gollomp K., Michelle P. The Immature Reticulocyte Fraction As Aid
in the Diagnosis and Prognosis of Parvovirus B19 Infection in Sickle Cell
Disease.2018. https://doi/org/10.1182/blood-2018-99-117152. Diakses pada 13
Januari 2020.

13