ROLE HBA1C DAN PENGARUH HB VARIANT DALAM

PENEGAKAN DIAGNOSIS DIABETES MELITUS

RONI ROSYANA
PT DIASTIKA BIOTEKINDO
30 NOVEMBER 2018
OVERVIEW

• Penggunakan HbA1C oleh para Klinisi

• Metode Pemeriksaan HbA1C
• Efek Hemoglobinopati terhadap pemeriksaan HbA1c
Deaths attributable to diabetes by age (20-79 years)

International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas, 8th edn. Brussels, Belgium: International Diabetes Federation,
2017. http://www.diabetesatlas.org
Negara Dengan Kasus DM Tertinggi Di Dunia Tahun 1980 vs 2014

Source: Lancet, 2016

5
 Diabetes Melitus
= Kumpulan gejala klinik akibat hiperglikemia oleh karena :
n gangguan sekresi insulin sel β pancreas,
n gangguan kerja insulin

Komplikasi mikrovaskular : Komplikasi makrovaskular

n Retinopati n penyakit arteri koroner
n Neuropati n vaskular perifer
n Nefropati n serebrovaskular.

Tujuan terapeutik  normalisasi kadar glukosa

Tes HbA1c
(kontrol glukosa darah jangka panjang
yang akurat dan obyektif)
 HBA1C
• Hemoglobin Adult 1c (HbA1c)
= hemoglobin terglikosilasi
= glicosilated hemoglobin
= glicohemoglobin (GHB)
• Terbentuk dari proses glikosilasi antara
glukosa dengan N-terminal valin dan rantai
lysin dari rantai α dan β hemoglobin A (HbA).
• Orang normal: HbA1c: 3-6% HbA-nya
terglikosilasi
• DM :  2-3 kali lipat tergantung derajat
hiperglikemia
• HbA1 terdiri dari 3 varian :
- HbA1a
- HbA1b
- HbA1c (Persentase terbesar dari HbA1
total dalam eritrosit & bereaksi dgn glukosa)
 HbA1c
Dibentuk secara non
enzimatis melalui 2 tahap
reaksi :
• Tahap pertama cepat,
reversibel, tergantung pada
konsentrasi glukosa dan
menghasilkan produk aldimin
yang labil atau schiff base
(Labile HbA1c)

•Tahap kedua : aldimin perlahan-lahan mengalami penyusunan kembali dan

dikonversi menjadi ketoamin yang stabil → hemoglobin terglikasi
www.chem.arizona.edu
Singapore Med J 2010; 51(8) : 617
Kriteria Diabetes (perkeni 2015)
Glukosa plasma sewaktu > 200 mg/dl

 Glukosa plasma puasa > 126 mg/dl

Kadar glukosa plasma 2 jam pada TTGO > 200 mg/dl

A1c > 6,5% : tes harus dilakukan di laboratorium yang menggunakan metode
bersertifikasi NGSP dan terstandarisasi pemeriksaan DCCT …new!!!
(Perkeni 2015)
 Kriteria Prediabetes & Diabetes
Keterangan HbA1c (%) Glukosa darah puasa Glukosa plasma 2 jam
(mg/dL) setelah TTGO (mg/dl)
Diabetes >6,5 > 126 mg/dL > 200 mg/dL
Prediabetes 5,7-6,4 100-125 140-199
Normal <5,7 <100 <140

Konsensus DM tipe-2 2015

 Penggunaan HBA1C oleh para klinisi

1. Memprediksi perkembangan komplikasi diabetes

2. HbA1c untuk diagnosis diabetes
3. Pemeriksaan Gold Standar dalam memantau kendali glukosa darah
4. Digunakan sebagai target pengobatan diabetes dalam manajemen Diabetes
5. Panduan penyesuaian untuk terapi
 Macrovascular Microvascular
Brain
Cerebrovascular disease Eye
• Transient ischemic attack
• Cerebrovascular accident Retinopathy
• Cognitive impairment Cataracts
Glaucoma

Heart
Coronary artery disease
• Coronary syndrome
• Myocardial infarction
• Congestive heart
failure
Kidney
Nephropathy
• Microalbuminuria
• Gross albuminuria
• Kidney failure

Extremities
Nerves
Peripheral vascular Neuropathy
disease • Peripheral
• Ulceration • Autonomic
• Gangrene
• Amputation
OVERVIEW

• Penggunakan HbA1C oleh para Klinisi

• Metode Pemeriksaan HbA1C
• Efek Hemoglobinopati terhadap pemeriksaan HbA1c
 Prinsip Dasar Metode Pemeriksaan HbA1c

Metode berdasarkan perbedaan muatan

(ion exchange HPLC, Gel Electroforesis, Isoelectric focusing)

Metode berdasarkan perbedaan struktur

(Affinity Chromatography)
Metode berdasarkan reaktivitas kimia

(Immunoturbidimetry, latex agglutination)

semua bertujuan untuk MEMISAHKAN

hemoglobin terglikasi dengan non glikasi

14
 %HbA1c
Glycated Hb
%HbA1c  X 100
Glycated Hb  Non Glycated Hb
Glycated Hb Non Glycated Hb
HbA1a
HbA1b
HbF
LA1c
A1c
P3
P4
A0
HbC
Variant Window
 HbA1c Examination
HPLC– ION EXCHANGE

RBC lisat disuntikkan melalui

kolom bermuatan negatif.

Molekul hemoglobin bermuatan

positif bergerak lebih lambat
karena interaksi dalam resin

resine HbA1c memiliki muatan negatif lebih

banyak dibandingkan dengan HbA0 ,HbA1c
dielusi lebih dulu dibandingkan dengan
HbA0

Molekul hemoglobin bergerak

keluar dari kolom, diproses
oleh detektor sinyal menjadi
kromatogram.
 Normal Chromatogram

A1c and A0 peaks are

correctly identified

LA1c/CHb-1 = LA1c < 4% Straight Baseline

LA1c/CHb-2 = CHB < 3.5%
Hb F < 10%

Total area within 1-5

million. No variant/unknown
peaks after A0

%A1c 3.8%-18.5%
 HbA1c Examination

HPLC– Boronic Affinity

RBC lisat disuntikkan ke dalam kolom yang
mengandung m-aminophenyl boronic acid yang
terikat pada resin, dengan pH 8

Hemoglobin terglikasi berikatan dengan resin,

sementara hemoglobin tidak terglikasi akan
melewati kolom

Asam Buffer akan memutuskan ikatan

hemoglobin terglikasi dalam kolom.

Molekul hemoglobin keluar dari

kolom, diproses oleh detektor sinyal
menjadi kromatogram
The Capillarys® system

Sistem Capillarys®
menggunakan prinsip
elektroforesis kapiler
dalam larutan bebas,
molekul bermuatan
dipisahkan oleh mobilitas Positives charges This interaction leads to electro-
elektroforetik mereka from buffer solution osmotic flow (EOF) from the anode
to the cathode
dalam buffer alkali
dengan pH tertentu. Negatives charges
from capillary wall
Electro-osmotic flow carries all
proteins towards the cathodic side

Pemisahan terjadi sesuai dengan pH elektrolit dan aliran elektro-osmotik, dari katoda ke
anoda.Hemoglobin dipisahkan dalam 4 menit, menurut titik isoelektrik, oleh
migrasi dalam medan listrik dalam fase cair. Deteksi langsung dari
hemoglobin dibuat pada panjang gelombang absorbansi 415 nm pada ujung katodik
mereka
Immunoassay Method
Metode pemeriksaan
umum untuk HbA1c
Antibodi mengenali struktur
asam amino glikat pada terminal
N rantai β globin.
melalui asam amino ke 10 dari
rantai β globin Varian
hemoglobin lainnya itu
mengalami mutasi pada ke-4 melalui amino ke
10 Asam dapat mengganggu pemeriksaan
HbA1c Examination
ENZIMATIC

RBC lisat menjadi sasaran proses proteolitik (A)

Merilis asam amino, termasuk ujung terminal N

dari asam amino valin rantai beta globin (B)
Asam amino valin berjalan melalui proses
terdiglycated, hasil H2O2, yang bereaksi dan
digunakan dalam reaksi chromagenic digunakan
untuk menghitung HbA 1c (warna) (c)

Warna yang terbentuk sama dengan jumlah HbA1c

 3 Metode HbA1c yang Paling Umum Digunakan
Pemeriksaan Prinsip Kelemahan Keuntungan
Kromatografi Titik isoelektrik Adanya interferensi variabel Dapat memeriksa
p e r t u k a r a n HbA1c lebih rendah dari hemoglobinopati, HbF, dan kromatogram Hb varian
ion (HPLC) dan lebih cepat carbamylated Hb ; namun assay Tingkat presisi tinggi
bermigrasi pertukaran ion saat ini dapat
dibandingkan mengkoreksi interferensi HbF &
komponen Hb lainnya carbamylated Hb

A f f i n i t a s Glukosa terikat pd Bukan hanya mengukur glikasi Interferensi minimal

boronat asam valin pada N-terminal rantai β, berasal dari
m-aminofenil boronat tetapi juga glikasi rantai β pada hemoglobinopati, HbF,
bagian lain dan glikasi rantai α dan carbamylated HbF
Immunoassay Antibodi berikatan Dipengaruhi oleh gangguan Tidak dipengaruhi oleh
dengan glukosa dan hemoglobinopati dengan asam HbE, HbD maupun
antara asam amino 4 amino lengkap pada sisi yang carbamylated Hb. Relatif
dan 10 N-terminal berikatan ; beberapa gangguan lebih mudah
rantai β berasal dari HbF diimplementasikan pada
berbagai format yang
berbeda
(WHO/NMH/CHP/CPM/11.1)
 DCCT
Pada DM tipe 1 : Tingkat
pengendalian glikemik
(diukur sebagai HbA1c)
berkorelasi erat
terhadap perkembangan
risiko komplikasi diabetes
kronik

Hasil uji DCCT menetapkan target suatu sasaran terapi

diabetes yaitu HbA1c <7%.
Diabetes, 44:968-983, 1995
Randie R. Little, 2011
 UKPDS
• Adanya penurunan risiko komplikasi diabetes dengan kontrol
glukosa darah yang intensif pada pasien diabetes tipe 2

Randie R. Little, 2011

UKPDS Group. Lancet 1998; 352:837-53
 HbA1c- from Chaos to Order
• Studi sebelumnya menunjukkan bahwa metode yang berbeda dapat
memberikan hasil yang ekuivalen jika dikalibrasi dengan suatu referensi
• Latar Belakang : Analisis HbA1c yang masih belum seragam sehingga
menyulitkan penafsiran terutama bila diperiksa di laboratorium yang
berbeda dengan metode yang berbeda PERLU STANDARISASI
• Upaya Standarisasi telah dilakukan di Amerika Serikat oleh NGSP & di
Eropa oleh IFCC
Tujuan : Untuk menstandarisasi hasil pemeriksaan hemoglobin
terglikasi sehingga hasil laboratorium klinik dapat “disamakan”
dengan hasil yang dilaporkan oleh DCCT dan UKPDS , yang
dilaporkan memiliki keterkaitan dengan rata-rata glukosa darah
dan risiko komplikasi vaskular

(http://www.ngsp.org/docs/IFCCstd.pdf)
HbA1c Recommended for Diagnosis.
 HbA1c Recommended for Diagnosis.

The ADA Clinical Practice Recommendations now

recommend using HbA1c to diagnose diabetes using a
NGSP-certified method and a cut off of HbA1c ≥6.5%. POC
assay methods are not recommended for diagnosis

http://www.ngsp.org/ADA.asp
 HbA1c - HPLC

• HPLC: Metode pemeriksaan yang digunakan pada

banyak clinical trials utama sehingga metode HPLC di
gunakan sebagai reference dalam pemeriksaan HbA1c.

• Metode HPLC digunakan oleh DCCT untuk menganalisa

lebih dari 75,000 sample selama 8 tahun studi diabetes.
Sampai saat ini lebih dari 1 juta sample manusia telah
dianalisa dengan menggunakan metode ini dalam
penelitian lanjutan.
HbA1c by HPLC in Clinical Trials
OVERVIEW

• Penggunakan HbA1C oleh para Klinisi

• Metode Pemeriksaan HbA1C
• Efek Hemoglobinopati terhadap pemeriksaan HbA1c
 BACKGROUND
• idak terpengaruh oleh diet
Analisis yang stabil
Variasi harian minimal, terutama dalam kondisi stres

• Hemoglobinopathy

• Anemia
Hemoglobinopati
Penyakit dengan peningkatan eritrosit berbalik

Prevalens of Haemoglobin variant in Indonesia is 2 % in 2010

Kementerian Kesehatan RI. Pusat data dan informasi kementerian kesehatan RI : Situasi dan analisis diabetes. Jakarta: Kementerian Kesehatan RI; 2014.
American Diabetes Association. Classification and diagnosis of diabetes. In: Standards of medical care in diabetes. Diabetes care; 2016. page S13–22
Fucharoen S, Weatherall DJ. The hemoglobin E thalassemias. Cold Spring Harb Lab Press 2012;:a011734.
Hemoglobinopathy
kelainan pada sintesis hemoglobin atau variasi struktur
hemoglobin yang menyebabkan fungsi eritrosit menjadi tidak
normal dan berumur pendek

Penurunan atau hilangnya rantai globin

kuantitatif yang ditandai dengan penurunan
Thalassemia sintesis satu atau lebih rantai globin

Hemoglobin
Kelainan struktural dari rantai globin
Variant
 BACKGROUND

Hemoglobinopati dapat mempengaruhi pemeriksaan A1c oleh

Perubahan beban molekuler hemoglobin karena

substitusi asam amino

Salah Tinggi / Rendah

Co-elusi dengan puncak HbA1c

MISS
Asam amino berubah di situs glikasi INTERPRETATION
High Hb F
 Hemoglobin Variants
Hemoglobin (Hb)

HbF (22) HbA (2ß2) HbA2 (2δ2)

(< 1.0%) ( > 90%) (< 2.5%)

HbA0 HbA1
(96%) (6%)

HbA1a HbA1b HbA1c

(0.4%) Glycation with an unknown Glycation with D-Glucose

HbA1a1 HbA1a2
Glycation with Fructos-1,6-Diphosphate Glycation with Glucose-6-phosphate

Fluckiger, R. “Glycated Hemoglobins – Review.” J Chromatog 428:279-292(1998)

 BACKGROUND

Most
Effect by
Ion ExchangeChromatography haemoglobinopathy
Immunoassay
How Far Haemoglobinopathy could effect A1c
examination by
ion exchange HPLC methode
 Conditions causing inappropriately
high or low A1c
Inappropriately Low A1c Inappropriately High A1c Variable Effect on A1c

• Hemolysis • Iron deficiency • Fetal hemoglobin

• Certain hemoglobinopathies • Vitamin B12 deficiency • Methemoglobin
• Recent blood transfusion • Alcoholism • Certain
• Acute blood loss • Uremia hemoglobinopathies
• Hypertriglyceridemia • Hyperbilirubinemia
• Drugs • Drugs
• Chronic liver disease

Indian Journal of Endocrinology and Metabolism

2012 Jul-Aug;16(4): 528-531
PMC3401751
 Drug causing inappropriately low or
high A1c
Postulated Mechanism
• Increased erythrocyte
destruction
• Altered hemoglobin
• Altered glycation
• Interference with assay
Falsely Low A1c Falsely High A1c
• Dapsone
• Ribavirin
• Antiretrovirals
• Trimethoprim
Sulfamethoxazole
• Hydroxyurea
• Vitamin C
• Vitamin E
• Aspirin (small doses)
• Aspirin (large doses)
• Chronic opiate use

Indian Journal of Endocrinology and Metabolism

2012 Jul-Aug;16(4): 528-531
PMC3401751
Terimakasih