Adrian Prasetya

Kelas Dual Degree

LAPORAN PRAKTIKUM
INSTRUMENTASI DAN TEKNIK ANALISIS BIOMOLEKULAR

Penggunaan Flowcytometry (7 Maret 2017)

1. PENDAHULUAN

Flow cytometry adalah metode untuk mengukur dan menganalisa berbagai

karakteristik dari sel secara simultan. Karakteristik sel yang diamati biasanya adalah
ukuran relatif partikel, granularitas atau kompleksitas, dan intensitas fluoresensi
relatif. Partikel atau sel yang menjadi sasaran analisis biasanya telah terlebih dahulu
diikat dengan antibodi berlabel fluorokrom kemudian sel dalam bentuk suspensi
kemudian dialirkan dan dilewatkan pada suatu sinar. Prinsip kerja flowcytometry
terdiri dari tiga sistem utama yaitu fluidics, optik, dan elektronik.
• Sistem fluidics mengangkut partikel di sungai dengan sinar laser untuk dianalisa
• Sistem optik terdiri dari laser untuk menerangi partikel dalam aliran sampel
dan filter optik untuk mengarahkan sinyal cahaya yang dihasilkan untuk detektor
• Sistem elektronik mengubah sinyal cahaya terdeteksi menjadi sinyal elektronik
(Becton,2002).
Fluorokrom merupakan suatu senyawa fluoresein yang dapat berpendar saat
mengalami eksitasi oleh sinar dengan panjang gelombang tertentu. Beberapa
fluorokrom yang sering digunakan dalam flow cytometry, yaitu fluorescein
isothyocyanate (FITC) yang memancarkan sinar hijau-kuning dengan emisi 519 nm,
4,6-Diamidino 2-Phenylinidole (DAPI) dengan emisi  455 nm, propidium iodide (PI)
dengan emisi 617 nm dan phycoeritrin (PE) yang memancarkan sinar merah-orange
dengan emisi 578 nm.
Dalam praktikum ini, sampel yang diukur yaitu limfosit yang didapat dengan
dari isolasi Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) kemudian di staining dengan
cell surface marker yaitu FITC anti-human CD4 dan PE anti-human CD8a yang dibeli
dari BioLEgend untuk flow cytometry.

2. TUJUAN

a. Mengetahui prinsip kerja dari Flowcytometer

b. Dapat menghitung jumlah sel CD4+ dan CD8+ pada sampel yang didapat dengan
metode Flowcytometry

3. METODE

A. ISOLASI PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELL

 Alat:
1. Tabung sentrifus 15 ml
2. Micropipette
3. Swing Centrifugated
4. Vacutainer EDTA/Heparin

 Bahan:
1. Ficoll-Hipaque d=1.077 g/ml
2. Phospat Buffer Saline (PBS)
3. Sampel Darah

 Prosedur Kerja:
1. Semua bahan yang diprlukan dikeluarkan dari lemari pendingin dan dibiarkan sampai
suhu ruang
2. Diambil sampel darah sebanyak 3 cc dengan phlebotomy dan masukkan kedalam
vacutainer EDTA
3. Disiapkan tabung sentrifus 15 ml dan diisi dengan FIcoll-Hipaque d = 1.077 g/ml
(1:1) dengan jumlah sampel darah
4. Sampel darah dalam vacutainer EDTA yang akan diuji, dibolak balik perlahan agar
homogen kemudian dicampur 1:1 dengan PBS. Kemudian diambil dengan
micropipette dan disalutkan secara perlahan pada dinding tabung sentrifus 15 ml
yang sudah diisi ficoll-hipaque d=1.077 g/ml maka akan terbentuk 2 lapisan
5. Kemudian disentrifuge suhu ruang dengan kecepatan 1600 rpm selama 30 menit
6. Setelah disentrifuge, terpisah menjadi 5 lapisan, yaitu plasma, sel PBMC, Ficoll-
Hipaque, granulosit, dan sel darah merah
7. Cincin PBMC yang terbentuk diambil secara perlahan menggunakan micropipette
dan diletakkan dalam botol sentrifus 15 ml yang baru
8. Larutan PBMC kemudian dicuci dengan PBS 10 ml dan disentrifus suhu ruang 1200
rpm selama 10 menit, dilakukan dua kali
9. Supernatan dibuang dan pelet sel yang terbentuk dicuci kembali dengan PBS dan
disentrifus kembali pada suhu ruang 1200 rpm selama 10 menit, dilakukan dua kali
10. Setelah disentrifuge, terbentuk pelet (sel PBMCs) pada dasar botol sentrifus 15 ml.

B. STAINING DENGAN SEL SURFACE MARKER UNTUK FLOW CYTOMETRY

 Alat:  Bahan:
1. Tabung sentrifus 1,5 ml 1. Antibodi sel surface marker
2. Sentrifuge dingin 2. Larutan sel staining buffer (2%FBS
3. Micropipet dalam PBS)
4. Kuvet fcm

 Cara Kerja:
1. Pelet sel dicuci dengan sel staining buffer (2% Fetal Bovine Serum (FBS) dalam
PBS) satu kali
2. Kemudian disentrifus pada kecepatan 2500 rpm, 3 menit, suhu 4 derajat
3. Supernatan dibuang dan pelet sel yang terbentuk siap untuk distaining dengan
antibodi sel surface marker (yang telah diencerkan dengan sel staining buffer
dengan perbandingan tertentu)
4. Antibodi yang telah diencerkan kemudian diambil sebayak 50 µl dandicampurkan
dengan pelet sel dan dihomogenkan
 5. Pelet sel yang telah diberi antibodi diinkubasi selama 20 menit dalam gelap di suhu
ruang
6. Setelah inkubasi ditambahkan sel staining buffer sesuai dengan kebutuhan, dan
dihomogenkan kembali
7. Kemudian dipindahkan ke kuvet baca dan siap untuk dibaca dengan flowcytometer

4. HASIL

Dari pemeriksaan flowcytometry sampel PBMC, jumlah Limfosit T berdasarkan

pada grafik scatter (gambar 2) adalah sebanyak 79,14%.

Gambar 2. Grafik Pencar

(Scatter) Pada Sampel PBMC

Kemudian dilakukan gating pada kumpulan sel limfosit, untuk identifikasi CD4
dan CD8. Pada grafik scatter (gambar 3) sumbu X menunjukkan penanda
permukaan CD4, sedangkan pada sumbu Y menunjukkan penanda permukaan CD8
sehingga terbagi menjadi empat kuadran, yaitu kuadran kiri atas (Upper Left / UL),
kanan atas (Upper Right / UR), kiri bawah (Lower Left / LL), serta kanan bawah
(Lower Right / LR). Sel yang hanya memiliki CD4 tanpa CD8 ditunjukkan pada
persentase kuadran kanan bawah (LR), untuk sel yang hanya memiliki CD8 tanpa
CD4 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL). Sedangkan sel yang
memiliki marker CD4 dan CD8 ditunjukkan pada kuadran kanan atas (UR). Sehingga
Sel T CD4+ yang di-marker dengan FITC anti-human CD4 diidentifikasi sebanyak
23,96%, dan sel T CD8+ yang di-marker dengan PE anti-human CD8a diidentifikasi
sebanyak 23,98%.
 Gambar 3. Tabel Persebaran Relatif populasi sel limfosit T

5. PEMBAHASAN

Setiap sel yang melewati berkas sinar laser akan menyebabkan sinar
laser terpencar (scattered) ke dua arah, yaitu forward scatter (FSC) yang pararel
dengan arah sinar dan side scatter (SSC) yang arahnya tegak lurus pada arah sinar
laser. Besarnya FSC (sumbu X) berbanding lurus dengan atau menggambarkan
volume atau ukuran sel sehingga semakin ke kanan titik pada sumbu X, maka
semakin besar ukuran sel sedangkan SSC (sumbu Y) menunjukkan kompleksitas
atau granularitas dari sel sehingga semakin ke atas titik pada sumbu Y, maka
semakin tinggi kompleksitas atau granulitas sel yang diperiksa.
Berdasarkan ukuran dan tingkat granularitasnya, sel makrofag memiliki sel
yang paling besar dan memiliki banyak granul,kemudian sel monosit lalu limfosit..
Untuk ukuran yang lebih kecil lagi dan tidak bergranul atau kompleksitasnya rendah
merupakan sel yang telah mati atau debris – debris (Lewandowski, 2006). Untuk
identifikasi CD4 dan CD8 dilakukan gating pada Limfosit. Dari data tersebut dapat
diketahui bahwa terdapat 79,14% sel limfosit dari 10.000 event yang direkam pada
alat flowcytometry. Dari gate tersebut kita dapat menganalisa banyaknya sel yang
memiliki permukaan CD4 dan atau CD8.
Pembagian kuadran pada Grafik pencar (scatter) populasi sel limfosit T
(Gambar 3) dilakukan berdasarkan tingginya intensitas warna dari pewarna antibodi
yang digunakan. sehingga dapat dimaknai bahwa kuadran LL menunjukkan sel
Limfosit yang CD4- dan CD8-. Kemudian pada kuadran LR ditunjukkan sel Limfosit
CD4+ danCD8-, serta pada kuadran UL ditunjukkan sebaran sel Limfosit CD8 + dan
CD4-. Untuk sel yang memiliki CD8+dan CD4+ ditunjukkan pada persentase kuadran
kanan atas (UR). Sehingga Sel T CD4+ yang di-marker dengan FITC anti-human
CD4 diidentifikasi sebanyak 23,96% dan sel T CD8+ yang di-marker dengan PE anti-
human CD8a diidentifikasi sebanyak 23,98%.

Flow cytometry dapat digunakan untuk analisis data berupa kualitatif dan
kuantitatif namun hanya dalam bentuk persentase atau relatif saja, untuk
mendapatkan data mengenai jumlah absolut dari sel limfosit yang diperiksa perlu
dilakukan differential count sel limfosit CD4+ dan/atau CD8
 6. KESIMPULAN

1. Prinsip kerja pemeriksaan flowcytometry adalah mengukur ukuran sel, granulitas sel,
dan mengenali warna fluoresence tertentu (antibodi monoklonal yang berlabel
fluorokrom) berdasarkan kemampuan hamburan dan intensitas cahaya yang molekul
yang dialirkan dalam sebuah tabung melewati seberkas cahaya, untuk karakterisasi
dan menentukan perbedaan jenis sel dalam populasi heterogen, serta menganalisis
ukuran dan volume sel.

2. Jumlah Limfosit T dalam praktikum ini adalah sebanyak 79,14%. Sel T CD4+
diidentifikasi sebanyak 23,96 %, dan sel T CD8+ diidentifikasi sebanyak 23,98 %.

DAFTAR PUSTAKA

1. Abcam. 2010. Direct Flow cytometry Protocol

2. Becton. 2002. Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide
3. Brown, Michael., Wittwer, Carl. 2000. Flow Cytometry: Principles and Clinical
Applications in Hematology
4. Lewandowski, Krzysztof and Andrzej Hellmann. Atlas of Limfopoiesis.Poland :
Gdansk. 2006
5. Mandal, Ananya. Flow Cytometry Principles. Available from : http://www.news-
medical.net/life-sciences/Flow-Cytometry-Principles.aspx ( diakses 12 Maret 2017)
6. Givan, A.L., 2013. Flow cytometry: first principles. John Wiley & Sons.