LAPORAN PRAKTIKUM

INSTRUMENTATION & BIOMOLECULAR TECHNIQUE

ANALISIS PRESENTASE CD3, CD4, DAN CD45 DENGAN
FLOWCYTOMETRI

OLEH:
ANDRI SETIAWAN

NIM: 176070100011002

PROGRAM MAGISTER ILMU BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2018
 BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Dasar Teori

Flowcytometry merupakan suatu teknologi yang secara simultan memeriksa dan

menganalisa berbagai karakter fisik dari partikel tunggal, biasanya sel, dimana sel
tersebut berada dalam bentuk cairan yang dialirkan melalui pancaran cahaya.
Karakteristik sel yang diperiksa meliputi ukuran relatif, granularitas relatif atau
kompleksitas internal, dan intensitas fluoresense relatif (Bioscience, 2000). Pada saat
sampel diperiksa, cahaya disebarkan oleh sel, tingkat cahaya yang disebarkan
memberikan informasi mengenai karakteristik sel. Fluoresensi juga dapat dihasilkan
dari absorbs dan re-emisi cahaya oleh zat kimia yang secara alami ada di dalam sel
(autofluorescene) atau telah ditambahkan ke dalam sampel sebelum analisi dilakukan
(Bioscience, 2000).

Karakteristik ini diperiksa menggunakan sebuah optic sebagai system kopling

elektronik yang mencatat bagaimana sel dinaburkan (scatters) cahaya laser dan
memancarkan fluoresense. Flowcytometry terdiri dari tiga system utama yaitu cairan,
optic dan elektronik. Cairan berfungsi sebagai system transport sel melalui aliran yang
diberi sinar laser untuk diperiksa. System optic terdiri dari laser untuk menerangi sel
pada aliran sampel dan filter optic untuk mengarahkan hasil sinyal cahaya pada
detector. System elektronik mengubah sinyal cahaya yang terdeteksi menjadi sinyal
elektronik yang dapat diproses oleh computer (Bioscience, 2000).

Salah satu hal mendasar pada prinsip kerja flowcytometry adalah kemampuan
untuk memeriksa partikel atau sel tunggal. Ketika cairan sampel diinjeksi melalui
flowcytometry, partikel akan tersebar acak pada ruangan 3 dimensi. Sampel harus
berada dalam aliran yang hanya mengandung paartikel tunggal sehingga dapat
diperiksa oleh system deteksi mesin. Proses ini diatur oleh system fluiditas. System
fluiditas terdiri dari saluran pusat (central channel/core) dimana sampel diinjeksikan,
dan diselubungi oleh membrane luar yang terdiri dari cairan dengan aliran yang deras.
Ketika cairan membrane mengalir akan menghasilkan efek tarikan massif pada ruang
tegah yang sempit. Hai ini akan merubah kecepatan aliran tengah dimana aliran
depannya akan membentuk setengah lingkaran dengan kecepatan terbesar di tengah
dan kecepatan nol pada dinding. Efek ini manghasilkan deretan tunggal partikel yang
disebut focus hidrodinamik (Rahman, 2006).

Setelah proses hidrodinamik, masing-masing partikel akan melalui satu atau lebih
pancaran cahaya. Cahaya atau emisi fluorescence (jika partikel dilabel dengan
fluorokrom) memberikan informasi tentang partikel. Sumber cahaya yang digunakan
adalah laser atau arc lamp. Laser menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang
tertentu. Cahaya yang dipancarkan lurus ke depan ditangkap oleh lensa yang disebut
dengan forward scatter channel (FSC). Intensitas FSC dianggap sama dengan ukuran
partikel dan dapat digunakan untuk membedakan debris sel dan sel yang hidup.
Cahaya dengan sudut 90 dari garis eksitasi disebut side scatter. Side scatter channel
(SSC) memberikan informasi tentang isi granul di dalam partikel. FSC dan SSC
bersifat unik untuk tiap partikel dan kombinasi keduanya bisa digunakan untuk
membedakan tipe sel dan heterogenitas sampel. Pemeriksaan fluorescence dengan
panjang gelombang berbeda memberikan data kualitatif dan kuantitatif pada reseptor
permukaan sel atau molekul intrasel seperti DNA dan sitokin yang dilabel fluorokrom.
Flowcytometer menggunakan saluran fluorescence yang terpisah untuk mendeteksi
emisi cahaya. Spesifitas deteksi dikontrol oleh filter optic yang menghambat panjang
gelombang tertentu dan meneruskan lainnya. Hambatan cahay ini dilakukan melalui
absorbsi (Rahman, 2006).

Ketika cahaya menumbuk fotodetektor, maka dihasilkan arus listrik kecil

(beberapa microampere). Voltase yang dihasilkan proporsional dengan jumlah
amplitudo cahaya foton yang diterima detektor. Lalu dilakukan amplifiksai voltase
melalui logaritmik amplifier dan melalui “analog to digital convertors” (ADCs)
menjadi sinyal elektrik yang cukup besar (5-10v) untuk diplotkan pada grafik.
Aplikasi utama dari flowcytometry adalah pemisahan sel berdasarkan subtype atau
ekspresi epitope. Proses ini disebut sebagai cell sorting. Aliran cairan sel akan dialiri
listrik dan keluar dari mulut pipa system cairan sesuai dengan kriteria sel yang telah
ditentukan. Mulut pipa digetarkan degan frekuensi tinggi untuk mempertahankan
konsistensi ukuran droplet sel. Kemudian droplet sel akan melalui dareah elektrostatik
kuat dan dipisahkan ke kiri atau kanan berdasarkan muatannya (Rahman, 2006).

Data flowcytometry disimpan dalam bentuk format baku, yaitu flowcytometry

standard (FCS) format, yang dikembangkan oleh Society for Analytical Cytology.
Berdasarkan standar FCS, data yang disimpan meliputi diskripsi sampel yang
digunakan, instrumentasi yang digunakan, set data dan hasil analisa data. Sel tunggal
 dianalisa untuk 4 parameter (FSC, SSC, FITC dan PE fluorescence). Sekali data
disimpan, populasi sel ditunjukkan dalam beberapa formt yang berbeda. Parameter
tunggal seperti FSC atau FITC (FL 1) dapat digambarkan sebagai histogram
parameter tunggal, dimana axis horizontal menggambarkan nilai parameter dan axis
vertical menggambarkan hasil jumlah per saluran. Dua parameter dapat digambarkan
secara bersamaan dalam satu plot. Satu parameter digambarkan pada axis x dan
parameter lain pada axis y. data 3 dimensi juga dapat dihasikan dimana axis x dan y
menggambarkan parameter dan axis z menggambarkan hasi jumlah per channel
(Bioscience, 2014).

Oleh karena itu, praktikum ini dilakukan agar praktikan dapat memahami
cara analisis dan prinsip kerja dari Flowcytometri, serta mampu menentukan
jumlah presentase CD3, CD4 serta CD45 pada sempel.

1.2 Tujuan Praktikum

Tujuan dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Memahami prinsip kerja teknik Flowcytometry.
2. Mampu melakukan analisis sel CD3, CD4 dan CD45.
3. Mampu menentukan jumlah presentase CD3, CD4 dan CD45 pada sampel.
 BAB II

METODE PRAKTIKUM

2.1 Pelaksanaan Kegiatan Praktikum

Praktikum Analisis presentase CD3, CD4, dan CD45 dengan
Flowcytometri ini dilaksanakan pada Rabu, 21 Februari 2018, dan bertempat di
Labroratorium Sentral Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

2.2 Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Tabung sentrifus 15 ml
2. Centrifuge
3. Micropipet
4. Ependof 2 ml
5. Kuvet FCM
6. Vacutainer EDTA
7. Ficoll Hipaque
8. Phospat Buffer Salin (PBS)
9. Whole Blood
10.Antibodi sel surface marker (BD Tritest CD3/CD4/CD45)
11.Larutan sel staining buffer

2.3 Prosedur kerja

1. Semua bahan yang diperlukan dikeluarkan dari lemari pendingin dan dibiarkan
sampai suhu ruang.
2. Disiapkan tabung centrifuge 15 ml dan diisi dengan Ficoll Hipafique d = 1,077
g/mL sebanyak 3 mL (1:1) dengan sampel.
3. Sampel darah (Whole Blood) dalam vacutainer EDTA yang akan diuji diambil,
dibolak-balik perlahan agar homogen.
4. Diambil 3 ml whole blood dengan micropipette steril, dan di masukkan ke dalam
tabung centrifuge yang sudah berisi Ficoll Hipafique, (Seluruh darah diletakkan
di atas lapisan Ficoll-Hypaque perlahan) dan di tambahkan PBS sampai 10 ml.
5. Dicentrifuge dengan kecepatan 1600 rpm selama 30 menit dalam suhu ruang.

6. Setelah dicentrifuge akan terpisah menjadi 5 lapisan, yaitu plasma, sel PBMC,
Ficoll, granulosit dan sel darah merah.

7. Cincin Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) yang terbentuk diambil

secara perlahan menggunakan micropippete steril dan diletakkan dalam tabung
centrifuge 15 mL yang baru.
8. Larutan PBMC dicuci dengan PBS hingga 10 mL dan disentrifuse suhu ruang
dengan kecepatan 1200 rpm selama 10 menit. Pencucian ini dilakukan sebanyak
3 kali
9. Pelet dimasukkan ke dalam tabung ependof dan ditambah antibodi surface marker
10 µl. (CD3, CD4, dan CD45).
10.Diinkubasi 20 menit pada suhu ruang (tempat gelap)
11.Setelah diinkubasi ditambahkan sel staining buffer 300µL
12.Dipindahkan ke kuvet baca dan siap untuk dibaca dengan flowcytometry
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil

A. Grafik Scatter Sampel PBMC

Keterangan: Gate (terdapat lingkaran) pada scatter di atas menunjukkan sel T

Lymphocytes

B. Grafik Gate Presentase CD3

Quad Events % % Quad Events % %

Gates Total Gates Total
UL 9 0.09 0.01 UL 0 0.00 0.00
UR 2088 20.40 2.35 UR 3715 20.40 2.35
LL 6505 63.56 7.33 LL 0 0.00 0.00
LR 1632 15.95 1.84 LR 6519 63.70 7.34
Keterangan: Lymphocyte-gated CD4 Keterangan: Lymphocyte-gated CD3
(PE) vs CD3 (FITC) Dot Plot (FITC) Dot Plot
C. Grafik Gate Presentase CD4

Quad Events % % Quad Events % %

Gates Total Gates Total
UL 10 0.10 0.01 UL 0 0.00 0.00
UR 2092 20.44 2.36 UR 2090 20.42 2.35
LL 4015 39.23 4.52 LL 0 0.00 0.00
LR 4117 40.23 4.64 LR 8144 79.58 9.17
Keterangan: Lymphocyte-gated CD4 Keterangan: Lymphocyte-gated CD4
(PE) vs CD45 (PerCP) Dot Plot (PE) Dot Plot

D. Grafik Gate Presentase CD45

Quad Events % % Quad Events % %

Gates Total Gates Total
UL 2491 24.34 2.81 UL 0 0.00 0.00
UR 3700 36.15 4.17 UR 6202 60.60 6.98
LL 4028 39.36 4.54 LL 4028 39.36 4.54
LR 15 0.15 0.02 LR 4032 39.40 4.54
Keterangan: Lymphocyte-gated CD45 Keterangan: Lymphocyte-gated CD45
(PerCP) vs CD3 (FITC) Dot Plot (PerCP) Dot Plot
3.2 Pembahasan
Pada grafik scatter sample PBMC, sumbu x menunjukkan ukuran sel,
sedangkan sumbu y menunjukkan kompleksitas dari sel. Pada sumbu x,
semakin ke kanan, maka ukuran sel semakin besar. Sedangkan pada sumbu y,
semakin ke atas maka kompleksitas sel semakin tinggi, yang dapat pula
diartikan bahwa semakin ke atas maka semakin tinggi granularitas sel tersebut.
Pada tabel gate persentase Lymphocyte-gated CD3 (FITC) Dot Plot dapat
diketahui bahwa sel limfosit T memiliki presentase CD3 sebanyak 20.42%
dari 2.35% dari keseluruhan sel PBMC dan 79.58% dari 9.17% dari
keseluruhan sel PBMC. Dan pada tabel Lymphocyte-gated CD4 (PE) vs CD3
(FITC) Dot Plot Sel yang memiliki marker CD3 tanpa CD4 ditunjukkan pada
persentase kuadran kanan bawah (LR: 15.95%), untuk sel yang memiliki
marker CD4 tanpa CD3 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL:
0.09%). Sedangkan sel yang memiliki marker CD3 dan CD4 ditunjukkan pada
kuadran kanan atas (UR: 20.49%).
Pada tabel gate persentase Lymphocyte-gated CD4 (PE) Dot Plot dapat
diketahui bahwa sel limfosit T memiliki presentase CD4 sebanyak 20.42%
dari 2.35% dari keseluruhan sel PBMC dan 79.58% dari 9.17% dari
keseluruhan sel PBMC. Pada Lymphocyte-gated CD4 (PE) vs CD3 (FITC)
kuadran UP-Left (UL:15%). Dan pada tabel Lymphocyte-gated CD4 (PE) vs
CD45 (PerCP) Dot Plot Sel yang memiliki marker CD45 tanpa CD4
ditunjukkan pada persentase kuadran kanan bawah (LR: 40.23%), untuk sel
yang memiliki marker CD4 tanpa CD45 ditunjukkan pada persentase kuadran
kiri atas (UL: 10%). Sedangkan sel yang memiliki marker CD45 dan CD4
ditunjukkan pada kuadran kanan atas (UR: 20.44%).
Pada tabel gate persentase Lymphocyte-gated CD45 (PerCP) Dot Plot
dapat diketahui bahwa sel limfosit T memiliki presentase CD45 sebanyak
60.60% dari 6.98% dari keseluruhan sel PBMC dan 39.40% dari 4.54% dari
keseluruhan sel PBMC. Dan pada tabel Lymphocyte-gated CD45 (PerCP) vs
CD3 (FITC) Dot Plot Sel yang memiliki marker CD3 tanpa CD45 ditunjukkan
pada persentase kuadran kanan bawah (LR: 0.15%), untuk sel yang memiliki
marker CD45 tanpa CD3 ditunjukkan pada persentase kuadran kiri atas (UL:
24.34%). Sedangkan sel yang memiliki marker CD3 dan CD45 ditunjukkan
pada kuadran kanan atas (UR: 36.15%).
Pemeriksaan pemeriksaan flowcytometry hanya bisa didapatkan
presentase saja, untuk jumlah absolut dari sel yang diperiksa diperlukan
pemeriksaan differential count atau penghitungan sel PBMC menggunakan
kamar hitung.
 BAB IV

KESIMPULAN

4.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa:
1. Prinsip kerja pemeriksaan flowcytometry pada praktikum ini adalah
mengukur sel PBMC yang memiliki molekul CD3, CD4 dan CD45 di
permukaan sel yang telah diikat dengan antibodi monoklonal yang berlabel
fluorokrom tertentu. Kemudian sel dilewatkan celah sempit, dan ditembak
sinar laser.
2. Dari tabel persentase dapat diketahui bahwa CD3 (FITC) memiliki
presentas sebanyak 20.42% dari 2.35% dari keseluruhan sel PBMC dan
79.58% dari 9.17% dari keseluruhan sel PBMC. Pada CD4 (PE) memiliki
presentas sebanyak 20.42% dari 2.35% dari keseluruhan sel PBMC dan
79.58% dari 9.17% dari keseluruhan sel PBM. Pada CD45 (PerCP)
memiliki presentas sebanyak 60.60% dari 6.98% dari keseluruhan sel
PBMC dan 39.40% dari 4.54% dari keseluruhan sel PBMC.
 DAFTAR PUSTAKA

BD Biosciences. 2000. Introduction of Flow Cytometry: A Learning Guide. San

Jose, CA. Diakses 26 Februari 2018.
BD Biosciences. 2014. BD Tritest™ CD3/CD4/CD45. A Learning Guide. San
Jose, CA. Diakses 26 Februari 2018
Rahman, Misha. 2006. Introduction to Flow Cytometry. AbD Serotec. Diakses 26
Februari 2018.