PEMERIKSAAN

HITUNG LEKOSIT

Pendahuluan
Infeksi
obat

stress

LEKOSIT

inflamasi

Lain-lain

shock

Perubahan
hormonal
2

PEMERIKSAAN
HITUNG LEKOSIT

Otomatik

Manual

Kamar hitung
(hemositometer)

Hapusan
darah

Impedans

optikal

Penghitungan Manual
dengan Kamar Penghitung
(Hemocytometer)
Prinsip
Darah

EDTA diencerkan dengan

pengencer yang sesuai
Darah yang telah diencerkan
disuspensikan ke dalam kamar hitung
lekosit
Lekosit dihitung dari pengkalian dengan
faktor dilusi dan dilaporkan sebagai
jumlah sel per mikroliter (L) darah
4

Alat dan bahan

1. Kamar Penghitung
(Improved Neubauer)

2. Pipet thoma
lekosit

3. Larutan pengencer turk

berisi gentian violet, asam
asetat
(CH3COOH) 3% dan
0.1 N HCl
4. Mikroskop
5

1 mm
0.1
mm

1 mm
Volume : 0.1mm3

Prosedur
1. Siapkan alatalat
2. Ambil darah kapiler/darah EDTA
dengan pipet thoma sampai tanda
0,5.

3. Hisap larutan Turk

hingga tanda 11.

Dilution factor (DF) =

20

4. Campur baik-2
dengan mengocok di
bagian perut
pipet thoma.

5. Buang 4-5 tetes larutan

pengencer untuk
membuang 0,5 ml cairan
pelarut yang tidak
mengandung darah.

6. Masukkan larutan darah kedalam kamar

penghitung melalui tepi gelas-penutup
sampai tepat mengisi daerah
penghitungan.

6. Biarkan kamar penghitung

beberapa saat agar sel-sel
darah mengendap pada dasar
area-penghitungan dengan
meletakkannya pada petri dish
berisi tissue basah.
7.

Lihat kamar-hitung dibawah mikroskop, baca

dengan perbesaran obyektif 10x dan hitung
lekosit pada 4 kotak lekosit.

10

Distibusi sel-sel dalam kamar

penghitung harus merata.

11

12

Penghitungan
WBC = sel yang terhitung x faktor dilusi
volume yang dihitung (mm3)
Sel yang terhitung= A
Faktor dilusi= 20 x
Volume yang dihitung= 4x0.1 = 0.4 mm3
Maka jumlah sel / mm3 darah :
Lekosit = A x 20 = 50 A/mm3
0,4
13

Faktor-faktor yang dapat

mempengaruhi hitung lekosit

Pra analitik
- teknik sampling darah
- obat-obatan
- penggunaan antikoagulan

Analitik
- Sel-sel yang dihitung relatif sedikit.
- Debu dan kotoran yang dapat mengganggu
pemeriksaan.
- Distribusi lekosit di kamar hitung yang kurang merata.
- Adanya NRBC yang menyebabkan tingginya hasil
hitung lekosit

Pasca analitik
-pelaporan hasil
14

Hitung Lekosit dengan Hapusan Darah

Tepi
Hanya

dapat memperkirakan jumlah lekosit

secara kasar.
Dapat digunakan untuk mengkoreksi hitung
lekosit bila dicurigai adanya NRBC yang
terbaca sebagai lekosit.
hitung lekosit =
100

x jumlah lekosit

terhitung
100 + jumlah NRBC per 100 lekosit

Penghitungan

lekosit tergantung dari jenis

mikroskop yg digunakan (FN-nya)
15

Untuk memperkirakan jumlah sel :(obyektif 10x)

Untuk FN-18 :
leko/mm3 = rata-rata lekosit/lp x 300
normal : bila didapatkan 15-35
leko/lp
Untuk FN-22 :
leko/mm3 = rata-rata lekosit/lp x 200
normal : bila didapatkan
22-55 lekosit / lp

16

Perbandingan Penghitungan Lekosit cara manual

dan mesin hitung
Manual

Mesin hitung sel darah

Vol. Sampel darah minimal

> 20 ml

50 l

Vol. Darah yang diencerkan

20-50 ml

6 l

Pengenceran

20 x(Thoma)

500 x

Vol. Campuran yang dianalisis(V)

0,4 ml

500 l(KX-21)

Obyek yang dihitung

Inti sel

Semua partikel

50N

Leko N/ : 6,5 %

1-3 %

Kalkulasi

(P)

(N)
NxP

(KX-21)

V
CV

Tinggi Palsu

: 15 %

Normoblas (+)

Normoblas/ Eri tak lisis

Agregat trombosit
Bekuan fibrin
Cryofibrinogen
Cryoglobulin.
17

Metode Otomatik

18

Contoh Alat Hematology

Analyzer
Metode
Contoh Alat
Impedans

Light scatter

Coulter (DC)
Sysmex NE-8000
(DC&RF)
Cell-Dyn 3200

Light Scatter &

Absorbsi

Sysmex XE 2100
Advia 2120

19

Metode Resistensi
Elektronik/
Impedans/Tahanan Listrik
prinsip : larutan sel darah dialirkan
melalui apertura yg punya 2 elektroda
pada kedua sisinya, sehingga sel dlm
larutan yg bersifat konduktor akan
memberikan pulsa resistensi saat me
lalui apertura tsb.
Jumlah pulsa = jumlah sel yg lewat apertura ;
Tinggi pulsa = volume sel .

20

Sampel darah diencerkan dengan

larutan elektrolit. Untuk lekosit
digunakan reagen pelisis
mengerutkan membran & sitoplasma sel
inti yang diselubungi sitoplasma dlm
jumlah minimal & membran sel

21

Suspensi sel-sel dialirkan melalui

suatu celah (apertura) ke tabung yang
vakum.

22

Dapat

terjadi coincidence error :

lebih dari 1 sel melewati apertura
bersamaan.

Coincidence

error dikurangi dengan

- mengurangi ukuran apertura
- mengurangi konsentrasi sel

Metode

lain untuk mengurangi

coincidence error yaitu hydrodynamic
focusing system,
sel digerakkan dalam satu garis aliran
sel
tersebut satu persatu masuk apertura.
23

Metode Optikal

Light Scatter
Light Scatter & Absorbsi
- fluoresensi
- sitokimia

24

Sinar

laser dipencarkan ke berbagai arah

karena sel menghalangi jalannya sinar.
Sinar-sinar yang dipencarkan ditangkap
photodetector & dianalisis dikonversikan

26

Pengukuran scatter light 4 sudut

(multi angle polarized scatter
separation/MAPPS)
The Optical detectors mengukur pancaran
sinar ke 4 sudut:
Size 0: 1 to 3
Complexity 10: 3 to 10
Lobularity 90: 60 to 120 vertically
polarized after scattering.
Granularity 90D (Depolarized): : 60 to
120. horizontal polarization during
scattering.
27

28

29

Prinsip Reaksi

30

Channel Basofil (WBC/BASO

Scattergram)

Sumbu

X : intensitas lateral scatter light

Sumbu Y : intensitas forward scatter light
Memisahkan basofil dari lekosit lainnya
Menggunakan reagen pelisis (Stromatolyser FB)
31

Terima Kasih

32

33

Scattergram leukosit

34

Memisahkan Lekosit dari

NRBC
Sulit

untuk membedakan NRBC dari lekosit

NRBC

mempengaruhi perhitungan lekosit

Untuk

mengatasi masalah tersebut

digunakan pewarnaan polymethine &
suatu diluent bersifat asam-hipoosmotk
yang mengandung surface active agent
(STROMATOLYSER NR)
35

Memisahkan Lekosit dari

NRBC

STROMATOLYZER NR mempengaruhi
membran lipid terbentuk lubang
pada
sel NRBC meningkatkan
permiabilitas
pewarnaan

Kurang

mewarnai asam nukleat,

organel
& inti
36

Memisahkan Lekosit dari

NRBC

37

Scattergram NRBC

Sumbu

X : intensitas lateral fluorecent light

Sumbu Y : intensitas forward scatter light
38

PERBANDINGAN HITUNG JENIS LEKOSIT

SECARA MANUAL DAN OTOMATIK

CARA
MANUAL

OTOMATIK

KEUNTUNGAN

KERUGIAN

Dapat

memakan waktu
melihat
kurang realibilitas
morfologi
sel-sel dgn lebih jelas tergantung
Dapat membedakan 6 kemampupopulasi
an pemeriksa

belum bisa mengLebih cepat &

ekonomis
gambarkan
jumlah sampel besar, morfologi
realibilitas dan
sel
perlu konfirmasi
akurasi
lebih tinggi
manual
digunakan sebagai
belum bisa mengskrining
gambarkan stab &
segmen netrofil

39

Scatergram metode
impedans

40

Sheath

fluid berfungsi :
- mencegah flow cell terlapisi
oleh bahan
yang akan membelokkan sinar,
- membuat aliran yang laminar,
- membuat hydrodinamic
focusing

41

42

43

44

DISADVANTAGES OF MANUAL
CELL
COUNTING:
Cell identification errors in manual
counting:
mostly associated with
distinguishing lymphocytes from
monocytes,
bands from segmented forms and
abnormal cells (variant
lymphocytes from blasts)
lymphocytes overestimated,
monocytes underestimated
Slide cell distribution error:
increased cell concentration along
edges and in the feather edge, also
bigger cells found there i.e.
monocytes, eosinophils, and
neutrophils
Statistical sampling error

45

ADVANTAGES OF AUTOMATED
CELL
COUNTERS
Objective (no inter-observer
variability)
No slide distribution error
Eliminate statistical variations
associated with
manual count based on high number
of cells counted
Many parameters not available
from a manual count,
e.g. MCV, RDW
More efficient and cost effective
than manual method:
Some cell counters can process
120-150 samples
per hour
CAP assumes 11 minutes for a
manual cell count
46

Impedansi elektrik

47

Electronic Resistance
(Impedance)

Cell counting and sizing is based on

the detection and measurement of
changes in electrical
impedance (resistance) produced by
a particle as it passes through a
small aperture
Particles such as blood cells are
nonconductive but
are suspended in an electrically
conductive diluent

AB
X Technologi
es

Interfering substances
Cold

Agglutinins
Cryoglobulins
Lipemia
Platelet Clumps
RBC fragments
NRBCs

Interferences Cont.

All Parameters:

Clotted specimen. Inspect every specimen

for clots

Unusual RBC abnormalities that resist

lysing
malarial parasites
giant platelets, platelet clumps, NRBCs
fragmented white cells, agglutinated white
cells,
lyse-resistant red cells,
cryoglobulin, some extremely elevate
proteins,
unlysed particles greater than 35 fL in size

WBC:

Light scattering
Cells

counted as passed through focused beam of

light( LASER)
Sum of diffraction(bending around corners),
refraction (bending due to change in speed) and
reflection (light rays turned back by obstruction).
Multi angle polarized scatter separation (M.A.P.S.S)

0 : indicator of cell size

10 : indicator of cell structure and
complexity
90 polarized: indicates nuclear lobularity
90 depolarized: differentiate eosinophils