BIOINFORMATIKA 2020

Dosen : Dr. Djong Hon Tjong

MAYTHESYA OKTAVIONI
1921652012

S2 BIOTEKNOLOGI PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS ANDALAS
Latar Belakang
Vaksin belum
tersedia.
Obat:
Pentostam
Glucantime
Amphoterici
nB
Miltefosine
Paromomyci
Leishmaniasis Genus Leishmania n
Pentamidine

• Pengembangan obat baru yang

spesifik dan targetted dengan
pemanfaatan biologi molekuler.
• Pengembangan metode untuk
mengetahui spesifikasi dan lokalisasi
obat pada sel target diawali dengan
konstruksi plasmid rekombinan.
Metode Persiapan Konstruksi in- Uji ekspresi
parasit silico dan in- mCherry
Penelitian Leishmania vitro plasmid dengan
major pXG-mCherry mikroskop
promastigotes fluorescence
dan tikus
BALB/c betina.

Penghitungan Uji Leishmanicidal Uji lokalisasi Analisis statistik

korelasi antara protein
intensitas mCherry
fluorescence rekombinan
dengan jumlah
parasit
ksi in-silico dan in-vitro plasmid pXG-mC
Konstruksi pXG-mCherry12 (N-terminal )
primer forward CH01 (NotI dan XbaI ): g aGC GGC CGC
gaT CTA GAc atg gtg agc aag ggc ga
primer reverse CH02 (BamHI): c tGG ATC Cct cga gct tta
ctt gta cag ctc gtc cat
Konstruksi pXG-mCherry34 (C-terminal)
primer forward CH03 (NotI): a tGC GGC CGC tcg agt ctt
gta cag ctc gtc cat gc
primer reverse CH04 (BamHI dan XbaI): g GGA TCC TCT
AGA GCc atg gtg agc aag ggc gag ga

Konstruksi plasmid secara in-silico didesain

menggunakan software ApE v2.0.48.

Sekuen mCherry diisolasi dari pTREX-mCherry dengan amplifikasi

PCR.
Hasil PCR diligasi ke pCR2.1-TOPO (ThermoFisher Scientific-USA)
kemudian ditansformasi ke E. coli DH5.
Seleksi
Gentransforman dilakukandari
mCherry diekstraksi dengan seleksi
plasmid antibiotik
rekombinan kemudian direstriksi
Kanamycin dan PCR koloni.
untuk selanjutnya diligasikan ke plasmid pXG.
Plasmid pXG-mCherry12, pXG-mCherry34, dan pXG-HYG ditransfeksi ke
parasit L. major fase log dengan elektroforasi.
Koloni parasit transfektan diseleksi dan ditumbuhkan pada media M199 =
hygromycin B.
– A plasmid Editor v2.0.36
Menu bar
Tools bar

Work space
– A plasmid Editor v2.0.36
1. Sekuen plasmid di-paste pada work space.
Kemudian pilih ‘save’ dan tulis nama plasmid.

2. Pilihan bentuk plasmid

dari ‘linear’ diganti
menjadi ‘circular’ untuk
membuat peta plasmid
sirkular.
– A plasmid Editor v2.0.36
3. Klik ‘Graphic Map’ untuk
melihat peta plasmid

4. Akan mucul peta

plasmid dilengkapi nama
dan ukuran plasmid.
– A plasmid Editor v2.0.36
5. Highlight sekuen promotor dan terminator (sesuai peta
plasmid pada website resmi plasmidnya).
Tekan Ctrl+F, lalu paste sekuen promotoR.
6. Blok sekuen tersebut, lalu pilih
‘Features’, kemudian ‘New Features’.

7. Ganti tulisan ‘New Features’ dengan

nama sekuens. New features diganti T7
Promotor. Orientasi sekuen juga
disesuaikan dengan peta plasmid.

8. Hal yang sama dilakukan untuk T7

Terminator.
– A plasmid Editor v2.0.36
9. Lokasi T7 Promotor dan T7 Terminator
pada peta plasmid pET28a+
– A plasmid Editor v2.0.36

10. Pilih ‘Enzyme Selection Dialog’ untuk

melihat jenis enzim restriksi yang ada
pada sekuen plasmid.

11. Pilih jenis enzim restriksi yang ingin

dilihat lokasinya dan akan digunakan
dalam penelitian. Kemudian pilih
‘Highlight’.
– A plasmid Editor v2.0.36
12. Klik ‘Graphic Map’ untuk melihat peta
plasmid yang telah dilengkapi dengan info
lokasi beberapa enzim restriksi.
13. Pilih 2 jenis situs enzim restriksi
yang akan digunakan sebagai situs
penyisipan gen target. BamHI dan SacI
dipilih.
– A plasmid Editor v2.0.36
Peta plasmid pET28a+ dengan lokasi enzim
BamHI dan SacI

14. Pilih ‘Digest’ untuk melihat pola

restriksi kedua enzim.
– A plasmid Editor v2.0.36

15. Blok sequence antara titik restriksi

BamHi dan SacI, lalu tekan ‘Delete/
Backspace’ pada keyboard.

16. Paste sekuen gen target yang akan

disisipkan.
– A plasmid Editor v2.0.36
17. Blok sekuens gen target target, kemudian
pilih ‘Features’ lalu ‘New Features’.
Ganti sesuai nama gen target dan pilih warna
untuk sekuensnya.
18. Pilih ‘Graphic Map’ untuk melihat
lokalisasi dan orientasi gen target pada
plasmid.
Orientasi gen target terbalik, perlu di-
reverse complement.
– A plasmid Editor v2.0.36
19. Pilih ‘Features’ lalu ‘Edit Features’

20. Klik nama gen target.

21. Klik edit.

22. Klik ‘Rev-Com’ kemudian klik ‘OK’.

– A plasmid Editor v2.0.36
23. Klik ‘Save As’ lalu ganti nama file dengan
nama plasmid dan gen target.
Kemudian klik ‘Graphic Map’.
Konstruksi plasmid pET28a+
dengan gen Rep.
Hasil Penelitian
Konstruksi pXG-mCherry12 (N-
terminal) Variasi enzim
restriksi pada MCS
memungkinkan
variasi jenis gen
target yang bisa
disisipkan.

Konstruksi pXG-mCherry34 (C-

terminal)
Hasil Penelitian
Ekspresi protein rekombinan dari
pXG-mCherry12
Pertumbuhan sel parasit mutan
dan WT
tidak berbeda signifikan.
mCherry pada sel parasit mutan
bisa dieskpresikan, artinya vektor
konstruksi bisa digunakan untuk
skreening dan pengujian obat
potensial.
Kurva pertumbuhan
parasit

Baris atas : single parasit dengan

(pembesaran 100x)
Baris bawah : beberapa parasit
(pembesaran 40x)
Hasil Penelitian
Nilai EC50 dari parasit pXG-
mCherry12 terhadap 2 jenis obat

Pengujian parasit
Leishmania terhadap
sensitivitas obat
dengan metode MTT.
Nilai antara sel mutan
dan sel parasit WT
tidak berbeda
signifikan. Artinya sel
mutan meimiliki
tingkat sensitivitas
yang sama dengan
Hasil Penelitian
Makrofag yang ditransfektsi dengan
parasit pXG-mCherry12

Jumlah parasit memiliki nilai yang

berbanding lurus dengan
intensitas fluorescent yang
dihasilkan.

Kurva hubungan jumlah

parasit dengan intensitas
fluorescent

Panah putih
menunjukkan sel parasit
yang berpendar
Hasil Penelitian
Kurva fluorescent mCherry sebagai
alat uji viabilitas sel

Pengujian dengan
metode MTT dan
fluorescent tidak
memiliki perbedaan nilai
yang sifnifikan, artinya
uji fluorimetrik dengan
Profil aktifitas obat Leishmania major novel pXG-mCherry
sangat berguna dalam
proses skreening obat.
Hasil Penelitian
Konstruksi pXG-mCherry34 dengan
LPG1

Konstruksi pXG-
mCherry34-LPG1
berguna untuk
mendeteksi lokalisasi
Lokalisasi pXG-mCherry34 -LPG1 pada
protein target.
badan golgi
Kesimpulan

• Konstruksi plasmid pXG-mCherry merupakan

metode baru yang lebih cepat, mudah, dan lebih
efektif dalam uji in-vitro obat dan treatment baru
untuk Leishmania dan karakteristik biologi
molekuler parasit tersebut.
• Konstruksi gen mCherry ke plasmid pXG dan
penambahan MCS pada penelitian ini merupakan
penelitian pertama yang dilakukan.
• Konstruksi plasmid pXG-mCherry berguna sebagai
alat uji lokalisasi protein.
Terima kasih 