MODUL PRAKTIKUM BIOINFORMATIKA (BIK309)

SEMESTER GENAP 2023/2024

ACARA 7
MENGENAL SITUS WEB NCBI

I. TUJUAN
Melakukan langkah-langkah desain vektor plasmid untuk ekspresi protein rekombinan di
Escherichia coli yang terdiri dari:
1. Mengunduh sekuens gen yang akan diekspresikan di E. coli dari GenBank
2. Memilih plasmid/vektor ekspresi yang akan digunakan
3. Memilih sisi pemotongan enzim restriksi yang akan digunakan
4. Mendesain primer untuk kloning gen yang akan diekspresikan di E. coli

II. KOMPETENSI
1. Mampu emngunduh sekuens gen yang akan diekspresikan di E. coli dari GenBank
2. Mampu memilih plasmid/vektor ekspresi yang akan digunakan berdasarkan berbagai
parameter
3. Mampu memilih sisi pemotongan enzim restriksi yang akan digunakan untuk
konstruksi gen protein rekombinan ke plasmid
4. Mampu mendesain primer untuk kloning gen yang akan diekspresikan di E. coli

III. DASAR TEORI

Protein Rekombinan adalah protein yang diekspresikan oleh suatu gen
rekombinan. Gen atau DNA rekombinan sendiri adalah gabungan dari 2 fragmen DNA
yang berbeda. Dalam konteks protein rekombinan, gen rekombinan adalah gabungan
dari gen protein yang akan diekspresikan dan DNA baik kromosom maupun plasmid
dari inang di mana protein tersebut akan diekspresikan. Protein rekombinan
memungkinkan produksi protein secara massal dalam kondisi tekontrol sehingga
menguntungkan secara ekonomis. Salah satu contoh protein rekombinan yang paling
terkenal adalah insulin yang diproduksi dengan menggabungkan gen penyandi insulin
dari sel pankreas manusia dan plasmid dari Escherichia coli kemudian DNA plasmid
rekombinan tersebut ditransformasikan ke dalam sel E. coli dan gen penyandi insulin
dapat diekspresikan di dalam sel E. coli untuk menghasilkan insulin (Gambar 1).
Produksi insulin di E. coli lebih menguntungkan karena sel E. coli mampu
menghasilkan insulin secara cepat, di media yang ekonomis apabila dibandingkan

1
dengan memproduksi insulin di kultur sel pankreas manusia.

Gambar 1. Langkah-langkah produksi protein rekombinan (Insulin) di E. coli

Analisis bioinformatika merupakan salah satu bagian penting dalam produksi

protein rekombinan terutama di desain plasmid/vektor ekspresi untuk protein
rekombinan (Gambar 2). Langkah pertama dari desain plasmid untuk ekspresi protein
rekombinan adalah pemilihan plasmid berdasarkan parameter-parameter seperti
banyaknya jumlah salinan plasmid dan jenis promoter yang menentukan tingkat
ekspresi gen serta gen resistensi antibiotik yang digunakan untuk seleksi E. coli yang
memiliki plasmid rekombinan. Langkah berikutnya adalah penentuan enzim restriksi
yang digunakan untuk penyisipan gen protein rekombinan ke plasmid. Sisi
pemotongan enzim restriksi tersebut kemudian menajdi komponen dari plasmid yang
didesain untuk kloning atau perbanyakan gen protein rekombinan menggunakan
metode Polymerase Chain Reaction (PCR).

2
 Gambar 2. Peta suatu plasmid/vektor ekspresi (pET-3a)

Gambar 3. Skema kerja konstruksi plasmid untuk ekspresi protein rekombinan di E. coli

3
IV. ALAT
1. PC/Laptop/HP dengan koneksi internet dan memiliki browser internet (Google
Chrome, Mozilla Firefox, Microsoft Edge, Opera, Safari, dll.)
2. Situs web GenBank NCBI
3. Situs web Genscript (Vector Selector)
4. Situs web RestrictionMapper
5. Situs web Oligoperfect

V. CARA KERJA
1. Memilih vektor plasmid yang akan digunakan
a. Di browser internet Anda, akses Vector Selector dari Genscript:
https://www.genscript.com/expression-vector-selection-guide.html

b. Pilih vektor ekspresi untuk Host: Bacteria; Promoter: T7; Antibiotik:

Ampicillin; Copy Number: Low

Gambar 3. Halaman pencarian vektor di Vector Selector

c. Pilih pET-16B
d. Lakukan pengambilan tangkapan layar (screenshoot) dari peta plasmid
pET-16B (hasil 1)

2. Mengunduh sekuens gen dari protein rekombinan

a. Akses situs web GenBank di browser Anda
b. Akses gen alcohol dehydrogenase Arabidopsis thaliana (M12196.1)
c. Unduh sekuens gen tersebut dalam format fasta

4
3. Menentukan enzim restriksi yang akan digunakan
a. Akses situs web GenBank di browser Anda RestrictionMapper:
https://www.restrictionmapper.org/
b. Di parameter “Conformation” pilih “Linear”; di “Include” pilih semua
enzim restriksi yang dapat digunakan di pET-16B dengan klik nama enzim
sembari menahan tombol “Shift” di keyboard; di “Sequence Info” copy -
paste sekuens gen alcohol dehydrogenase
c. Klik “Map Sites”
d. Lakukan pengambilan tangkapan layar (screenshoot) dari hasil analisis peta
restriksi (Hasil 2)

4. Desain primer untuk gen protein rekombinan

a. Akses situs web OligoPerfect di browser Anda
https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/oligonucleotides-
primers-probes-genes/custom-dna-oligos/oligo-design-
tools/oligoperfect.html (Buat akun terlebih dahulu)
b. Klik “New Project” kemudian “Cloning”

Gambar 4. Halaman muka OligoPerfect

c. Masukkan sekuens gen Alcohol dehydrogenase

5
 Gambar 5. Tempat memasukkan sekuens

d. Di “included region” masukkan “1-1140” (panjang gen Alcohol

Dehydrogenase)
e. Klik “Show Parameter” dan pilih: # of primer return = 10; klik "Pick primer
anyway"; Primer size "Max" = 30; "Restriction Enzyme Site" = masukkan
enzim restriksi yang telah dipilih, kemudian klik "Apply".
f. Klik tanda centang hijau
g. Centang pasangan primer yang dipilih lalu pilih “Add to Review”
h. Klik “Review” di bagian kiri atas layar, dan analisisnya sekuens primer
yang dipilih.

VI. HASIL KERJA

Tangkapan Layar 1
Tangkapan Layar 2
Pasangan primer yang dipilih dan
parameter-parameternya

Tugas: Desain primer untuk kloning gen GrpE dari Bacillus cereus (NZ_CP017060.1) ke
vektor pET (parameter vektor sama dengan pET-21a) dan tampilkan hasil kerja seperti di
atas.

VII. DISKUSI
1. Apa saja komponen dari pET16B yang memungkinkan ekspresi protein
rekombinan di E. coli?
2. Apa akibatnya jika NcoI digunakan sebagai enzim restriksi dalam konstruksi
gen alcohol dehydrogenase di pET-16B
3. Analisislah posisi sisi pengenalan enzim restriksi di primer forward dan reverse
yang diperoleh!