ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER

BAKTERI ANTAGONIS TERHADAP Vibrio

parahaemolyticus PATOGEN PADA UDANG
Litopenaeus vannamei DARI PRODUK
PROBIOTIK DAN SEDIMEN MANGROVE DI
REMBANG
(Jurnal Biologi: 6 (1). 2017. Hal: 1-13)
LOLA ALVICHE
1921652008
S2-BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS ANDALAS
LATAR BELAKANG
Bakteri Vibrio Kematian udang Kegagalan Panen
parahaemolyticu secara masif
s

Solusi:
Patogen Pemberian
terhadap probiotik
komoditas udang
-manusia
Tujuan penelitian:
Identifikasi molekuler bakteri antagonis terhadap Vibrio
parahaemolyticus pathogen pada udang Litopenaeus
vannamei dari produk probiotik dan sedimen mangrove
ISOLASI BAKTERI
Isolasi bakteri Isolasi bakteri sedimen
probiotik
Teknik pengenceran mangrove
Sampel sedimen: mangrove
bertingkat 6x Avicennia marina

Teknik pengenceran bertingkat

Sampel dari tiap 6x
pengenceran
Sampel dari tiap pengenceran
ditanam (0,1 ml)
ditanam (0,1 ml) kedalam
kedalam media
media marine agar Inkubasi 24
marine agar
jam, 37°C
Isolat berbeda ditanam di media
Inkubasi 24 jam, marine broth Inkubasi 24 jam,
37°C 37°C
Uji Antagonistik Isolat Bakteri
Probiotik dan Sedimen Mangrove
Metode: Cakram Kirby-Bauer

Kultur cair Vibrio parahaemolyticus dicampurkan kedalam media

marine agar perbandingan 9:1; kondisi aseptis di dalam laminar air
flow

Paper disc diletakkan dibagian tengah  ditetesi kultur isolate

probiotik komersial (super ps) dan sedimen mangrove (masing-
masing 15 μl)

Inkubasi 24 – 72 jam, suhu 37°C

Pengukuran Zona Hambat
Dilakukan menggunakan jangka sorong ketelitian 0,05 nm;
pengulangan 4x

Apabila daerah hambatan ≥ 20 mm  kekuatan/daya antagonistik

sangat kuat; 10 – 20 mm  kuat; 5 – 10 mm  sedang; ≤ 5 mm :
lemah
Pewarnaan Gram
Memberikan pewarna Gram A (kristal violet); B (lugol); C (alcohol);
D (Safranin) secara bertahap

Tahap awal; Aquades diteteskan pada kaca objek + 1 ose biakan

sampel
Difiksasi diatas api bunses  Pemberian pewarna Gram A,B,C,D
secara bergantian

Pengamatan morfologi dengan mikroskop

Merah  Gram negative; Ungu  Gram positif
Ekstraksi DNA Bakteri
Menggunakan QIAamp® DNA Mini Kit

Koloni tunggal sampel diletakkan di suhu ruang; 500µl buffer AL 

dimasukkan kedalam tabung effendorf berisi isolate bakteri 
vortex 30’ s

Inkubasi 5 menit suhu ruang; 200 µl ethanol dingin  sampel 

vortex 30’

Transfer larutan (500-600µl)  tube penampung DNA  sentrifuge

30 menit, 8000 rpm  supernatant + 500µl buffer AW1
Ekstraksi DNA Bakteri
Menggunakan QIAamp® DNA Mini Kit; Koloni tunggal sampel diletakkan di suhu
ruang; 500µl buffer AL  dimasukkan kedalam tabung effendorf berisi isolate
bakteri  vortex 30’ s

Inkubasi 5 menit suhu ruang; 200 µl ethanol dingin  sampel 

vortex 30’

Transfer larutan (500-600µl)  tube penampung DNA  sentrifuge

30 menit, 8000 rpm  supernatant + 500µl buffer AW1 
sentrifuge 1 menit, 8000 rpm  ganti tube  500µl buffer AW2 
sentrifuge 3 menit 14000 rpm  buang supernatant  sentrifuge
1 menit 14000 rpm. Tube filter dipindahkan ke tabung effendorf +
penutup. 100 µl buffer AE ditambahkan  sentrifuge selama 1
menit 8000 rpm
Ekstraksi DNA Bakteri
Primer universal yang digunakan
27 F (5’ –AGAGTTTGATCMTGGCTCAG- 3’)
1492 R (5’ –GGTTACCTTGTTACGACTT- 3’)

Koktail 25 μl : 0,5 μl primer universal 27 F; 0,5 μl primer 1492 R;

4 μl DNA template; 12,5μl My TAQ Hs Red DNA; dan 7,5 μl ddH2O.

Elektroforesis: gel agarose 1% + gelred. 4 μl produk PCR  well,

running 40 menit, 100 volt, diamati dengan lampu uv
transluminator.
Analisa Sekuen
Program MEGA 6.0; Urutan nukleotida disejajarkan dengan sekuen yang
diduga terdapat dalam gen bank

BLAST; Analisis sekuen dengan kesamaan urutan

Menentukan kesamaan pasangan basa dengan isolate referensi

yang terdapat pada gen bank
Hasil dan Pembahasan
Isolasi Bakteri Probiotik dan Sedimen mangrove
Pengenceran bertingkat: 10-1 s.d. 10-6  ditanam pada media marine agar 
inkubasi 37°C selama 24 jam  terlihat koloni bakteri tumbuh pada media
Morfolologi Isolat Bakteri Probiotik Super PS
Isolat Warna Bentuk Tepian Elevasi
IP 1 Kuning Bulat Rata Cembung
IP 2 Putih gading Bulat Rata Cembung
IP 3 Tepi putih, Bulat Rata Cembung
tengah kuning
IP 4 Putih gading Tak beraturan Rata Datar
IP 5 Transparan Tak beraturan Bergerigi Cembung
IP 6 Putih Bulat Bergerigi Cembung
IP 7 Putih Gading Bulat Bergerigi Cembung
Hasil dan Pembahasan
Morfologi Isolat Bakteri Sedimen

Isolat Warna Bentuk Tepian Elevasi

IS 1 Putih gading Bulat Rata Cembung
IS 2 Transparan Tak beraturan Rata Datar
IS 3 Transparan Bulat Rata Datar
IS 4 Putih Tak beraturan Rata Cembung
IS 5 Kuning Bulat Rata Cembung
IS 6 Orange muda Bulat Rata Cembung
IS 7 Transparan garis Bulat Rata Cembung
IS 8 Tranparan center keruh Bulat Rata Cembung
IS 9 Tepi keruh center Bulat Rata Cembung
transparan
IS 10 Kuning pekat Bulat Rata Cembung
IS 11 Putih gading Tak beraturan Bergerigi Cembung
Hasil dan Pembahasan

Uji antagonistik isolat IP 7 Uji antagonistik isolat IP 7 Daya hambat Isolat terpilih IP
terhadap V. parahaemolyticus terhadap V. parahaemolyticus 7 terhadap V.
24 jam masa inkubasi 48 jam masa inkubasi parahaemolyticus, 10,84 mm.
Hasil dan Pembahasan

Morfologi isolat IP 7 secara mikroskopis Morfologi V. parahaemolyticus secara mikroskopis

perbesaran 1000x dengan pewarnaan Gram perbesaran 1000x
Hasil dan Pembahasan
Hasil ekstraksi DNA
menunjukkan nilai kemurnian
2,06 dan konsentrasi 228,3

Hasil amplifikasi gen 16S

rRNA, Isolat IP 7 memiliki
panjang DNA sekitar 1.500
bp
Hasil dan Pembahasan

Hasil analisis sekunesing DNA isolat IP 7 dengan menggunakan BLAST

diperoleh hasil bahwa isolat ini memiliki homologi atau tingkat kemiripan
sebesar 92% dengan spesies Lysinibacillus cresolivorans strain SC03 yang
memiliki max score 287, total score 287, query cover 51%, dan e-value 3e-77
KESIMPULAN

• Diperoleh 7 isolat bakteri yang berasal dari produk probiotik dan 11

isolat bakteri dari sedimen mangrove.
• Terdapat satu isolat bakteri terpilih berasal dari hasil isolasi produk
probiotik yaitu isolat IP 7 yang mampu menghambat pertumbuhan
Vibrio parahaemolyticus dengan ratarata diameter zona hambat
sebesar 10,84 mm.
• Hasil identifikasi menggunakan sekuen gen 16S rRNA menunjukkan
bahwa isolat IP 7 memiliki indeks kemiripan sebesar 92% dengan
Lysinibacillus cresolivorans
TERIMA KASIH