LAPORAN PRAKTIKUM

PENGANTAR TEKNIK BIOLOGI MOLEKULER

DETEKSI VIRUS HEPATITIS B DALAM SERUM DARAH DENGAN

TEKNIK PCR

ADAM SAPTA JAZARI

201209

DIPLOMA III TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

AKADEMI ANALIS KESEHATAN MANGGALA YOGYAKARTA

TAHUN 2021
 DETEKSI VIRUS HEPATITIS B DALAM SERUM DARAH DENGAN

TEKNIK PCR

Hari, Tanggal : Rabu, 17 November 2021

I. TUJUAN

Mampu mendeteksi adanya virus hepatitis B dalam serum darah.

II. DASAR TEORI

Hepatitis B merupakan penyakit inflamasi dan nekrosis dari sel-sel

hati yang disebabkan oleh virus hepatitis B. Virus hepatitis B merupakan

jenis virus DNA untai ganda, famili hepadnavirus dengan ukuran sekitar 42

nm yang terdiri dari 7 nm lapisan luar yang tipis dan 27 nnm inti di

dalamnya. (Ahn SH, 2011)

Virus ini memiliki tiga antigen spesifik, yaitu antigen surface,

envelope, dan core. Hepatitis B surface antigen (HBsAg) merupakan

kompleks antigen yang ditemukan pada permukaan HBV. Adanya antigen

ini menunjukkan adanya infeksi akut atau karier kronis yaitu lebih dari 6

bulan. Hepatitis B envelope antigen (HbeAg) merupakan antigen yang lebih

dekat hubungannya dengan nukleokapsida HBV. Antigen ini bersirkulasi

sebagai protein yang larut di serum. Antigen ini timbul bersamaan setelah

HBsAg, dan hilang beberapa minggu sebelum HBsAg hilang. Antigen ini

ditemukan pada infeksi akut dan pada beberapa karier kronis. Hepatitis core

antigen (HbcAg) merupakan antigen spesifik yang berhubungan dengan 27

nm inti pada HBV. Antigen ini tidak terdeteksi secara rutin dalam serum

penderita infeksi HBV karena hanya berada di hepatosit. (Hardjoeno, 2014)

III. ALAT DAN BAHAN

Alat :

1. PCR Cup 200 µl

2. Tip Putih

3. Mikropipet (ukuran 0,5 – 10 µl)

4. Casting Chamber

5. Mesin PCR

6. Elektroforesis

7. UV- Transluminator

8. Shaker/Rotator

Bahan :

1. Sampel DNA

2. Pasangan Primer

3. DNA loading dye

4. PCR Master Mix

5. Gene ruller (Marker) 1 kb ladder

6. Aqua DM

7. Buffer TBE 0,5 x

8. Gel Agarose.
IV. PROSEDUR

1. Masukkan 7,5 µl master mix ke dalam masing-masing tabung

2. Masukkan 1 µl primer P1 pada masing-masing tabung

3. Tambahkan 1 µl primer P2 pada masing-masing tabung

4. Tambahkan 3 µl DNA template atau DNA sampel

5. Tambahkan 2,5 µl Aqua DM yang sudah disterilisasi

6. Running di alat PCR

7. Hidupkan alat PCR, kemudian masukkan sampel ke dalam getting

blok

8. Atur program PCR dengan Denaturasi pada 95ºC selama 2 menit,

Anneling pada 55ºC selama 2 menit, Extention pada 70ºC selama 2

menit, tekan running dan start program

9. Tunggu sampai proses PCR selesai dengan 35 siklus dengan waktu

sekitar 4 jam

10. Setelah proses PCR selesai, ambil reaksi PCR dari dalam blok,

kemudian diamati pada elektroforesis

11. Siapkan gel agarose konsentrasi 1% (dibuat dengan cara menimbang

agarose serbuk 0,5 gram dan dilarutkan dalam 50 ml TBE 0,5x

12. Letakkan gel agarose ke dalam bejana elektroforesis

13. Tambahkan buffer TBE 0,5x sampai gel terendam

14. Siapkan sampel, tambahkan loading dye dengan perbandingan 1 : 1

atau sama dengan 6 µl loading dye : 6 µl sampel

15. Pipet 6 µl loading dye, kemudian letakkan di paragel menjadi 5

bagian (sampel yang digunakan ada 5)

16. Ambil sampel No. 1, atur mikropipet menjadi volume lebih besar,

kemudian campur/resuspend dengan loading dye. Setelah itu

masukkan ke dalam sumuran (No.3)

17. Lakukan prosedur yang sama untuk sampel no 2, 3, 4, dan 5

18. Masukkan DNA marker (One Kibby Leader) ke dalam garis atau

lubang nomor 1 dan lubang yang terakhir

19. Tutup alat elektroforesis, kemudian nyalakan alat dan atur waktu

selama 30 menit dengan Volt 100, kemudian running

20. Setelah 30 menit buka penutup alat, apabila warna belum tampak

jelas lakukan staining dengan Etidium bromide

21. Ambil gel agarose dari bejana elektroforesis, kemudian masukkan

dalam wadah yang berisi larutan Etidium bromide secara hati-hati

22. Letakkan wadah yang berisi gel agarose pada waterbath/shaker

selama 10 menit

23. Setelah 10 menit, ambil gel yang sudah diwarnai, kemudian

pindahkan di UV-Transluminator untuk melihat hasil PCR.

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil pembacaan pada alat UV- Transluminator

No. Sampel Hasil Gambar

1. Sampel 1 Negatif

2. Sampel 2 Positif (+)

3. Sampel 3 Positif (+)

4. Sampel 4 Positif (+)

5. Sampel 5 Positif (+)

Hasil Positif : Sampel no 2, 3, 4, 5.

Ditandai dengan adanya pita pada

ukuran 286 bp.

Hasil Negatif : Sampel No. 1 tidak

terdapat pita.

B. Pembahasan

Berdasarkan praktikum yang sudah dilakukan yaitu mendeteksi

adanya virus hepatitis B dengan teknik PCR menggunakan pasangan

primer II (P1 dan P2) dan menggunakan 5 sampel serum. Dari 5 sampel

tersebut 4 diantaranya menunjukkan hasil HbsAg positif yang terdapat

pada lajur 4, 5, 6, dan 7 atau pada sampel nomor 2, 3, 4, dan 5 seperti

yang terlihat pada gambar diatas. Hasil positif tersebut ditandai dengan

adanya pita DNA berukuran 286 bp. Sedangkan untuk hasil HbsAg

negatif terdapat pada sampel nomor 1, dimana dalam hasil tersebut tidak

menunjukkan adanya pita DNA.

VI. KESIMPULAN

Dari praktikum kali ini mahasiswa mampu melakukan deteksi virus

hepatitis B dengan menggunakan teknik PCR. Berdasarkan pemeriksaan

pada 5 sampel serum darah didapatkan hasil HbsAg postif pada sampel

nomor 2, 3, 4, dan 5 dengan pita DNA berukuran 286 bp, dan didapatkan

hasil negatif pada sampel nomor 1.

VII. REFERENSI

Ahn SH, Lee JM. (2011). Quantification of HBsAg: Basic virology for clinical

practive.World J Gastroenterol. 17(3):283-89.

Hardjoeno, UL. (2014). Kapita selekta hepatitis virus dan enterpretasi hasil

laboratorium. Makasar: Cahaya dinan rucitra. :Hlm 5-14.

Yogyakarta, 17 November 2021

Pembimbing Praktikan

Barinta Widaryanti, M.Biotech Adam Sapta Jazari