PEMERIKSAAN HBSAG

Disusun oleh:
Septia Rahmawati P07134217033
Shabilla Sukma Maulidina P07134217034
Tiyastuti P07134217035
Wina Syahrial Winarzat P07134217036
Yana Vania Faradila P07134217037
 DASAR TEORI
Hepatitis B adalah infeksi hati yang disebabkan oleh virus
hepatitis B (HBV). Virus hepatitis B merupakan virus DNA yang termasuk
dalam famili Hepadnaviridae. Virus hepatitis B dapat menyebabkan
peradangan hati akut atau kronis, yang pada sebagian kecil kasus
dapat berlanjut menjadi sirosis hati atau kanker hati.
 LANJUTAN...
HBsAg merupakan salah satu jenis antigen yang terdapat pada
bagian pembungkus dari virus Hepatitis B yang dapat dideteksi pada
cairan tubuh yang terinfeksi. Anti-HBs adalah pertanda adanya antibodi
terhadap virus hepatitis B pada seseorang. Antibodi yang terbentuk bisa
disebabkan infeksi virus hepatitis B atau berasal dari vaksinasi hepatitis
B. Pada hepatitis B akut, anti-HBs muncul beberapa minggu setelah
HBsAg menghilang.
LANJUTAN...
Pemeriksaan HBsAg dapat dilakukan dengan berbagai cara,
yaitu:
1. RIA (Radio Immuno Assay)
2. ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
3. RPHA (Reverse Passive Hemagglutination)
4. Imunnochromatografi
 METODE EIA (ENZYME IMMUNO ASSAY)
Prinsip Pemeriksaan:
Antibodi monoklonal, spesifik terhadap 8 subtipe HBsAg, dilekatkan pada
permukaan sumuran mikrotitrasi. Serum tes yang tidak diencerkan ditambahkan diikuti
antibodi Anti-HBsAg terkonjugasi dengan Horseradish Peroxidase (HRP). Jika HBsAg
terdapat pada sampel, akan terikat dengan antibodi pada sumuran dan konjugat
terikat pada antigen viral yang tertangkap. Jika HBsAg tidak ada, tidak terjadi
pengikatan dan material tak terikat akan terbuang.
 LANJUTAN...
Pada substrat tambahan, stabilised 3, 3’, 5, 5’ Tetramethyl Benzidine
(TMB), warna akan berkembang hanya pada sumuran yang terdapat HRP,
mengindikasikan adanya HBsAg. Reaksi dihentikan oleh asam sulfat encer
tambahan dan absorbansi diukur pada 450nm. Hasil dengan nilai OD
lebih dari nilai cut-off dinyatakan positif.
ALAT DAN PEREAKSI
1. Alat
a. Mikropipet: 100µl, 200µl, 1000µl dan 5000µl
b. Tip mikropipet sekali pakai
c. Inkubator suhu 37°C ± 1 °C
d. Kertas absorben
e. Microplate reader yang cukup dengan filer 450nm
f. Graph paper
g. Alat-alat gelas
 LANJUTAN...
2. Pereaksi

a. Kontrol negatif : Serum manusia yang tidak mengandung HBsAg

b. Kontrol positif : Serum manusia yang mengandung HBsAg

c. Buffer pencuci : Tris based containing detergent

d. Reagen konjugat : Anti-HBsAg conjugated to HRP (Horseradish Peroxide)

e. Larutan substrat : 3,3’,5,5’ Trimethyl Benzidine (TMB)

f. Stop Solution : H2SO4 0,2 M

 CARA KERJA
Preparasi Reagen
1. Semua reagen harus berada pada suhu ruang (20°C-25°C) dan campur
perlahan sebelum digunakan. Jangan sampai berbuih.
2. Prosedur pencucian sangat penting terhadap hasil tes ini. Pencucian
yang tidak cukup akan menghasilkan ketelitian yang buruk dan
kesalahan kenaikan pembacaan absorbansi.
 LANJUTAN...
3. Buffer Pencuci:
Encerkan konsentrat Buffer Pencuci (Reagen 5) dengan perbandingan 1
bagian Buffer pencuci : 9 bagian air destilat (akuades). Untuk setiap 8
breakable strip, siapkan 25ml Buffer Pencuci encer dengan menambahkan
2,5ml konsentrat Buffer Pencuci dan 22,5 air destilat. Siapkan Buffer Pencuci
yang segar sebelum setiap assay berjalan. Buffer Pencuci ekstra diberikan
untuk memungkinkan priming mesin pencuci otomatis.
 LANJUTAN...
PROSEDUR PENGUJIAN :
1. Reagen dan sampel dalam keadaan suhu kamar (2-25°C)
2. Bagikan 100µl serum uji dan Serum Kontrol Negatif (Reagen 2) ke dalam
sumuran yang sesuai. Bagikan 50µl Serum Kontrol Positif (Reagen 4) ke
dalam sumuran yang sesuai. Masing-masing dibuat duplikasi. Goyangkan
perlahan selama 5 detik.
3. Inkubasi selama 60 menit pada suhu 37°C.
4. Buffer pencuci diencerkan dengan aquadest 1:9
 LANJUTAN...
5. Buang isi sumuran dan cuci lima kali @25µl dengan rendaman 60 detik
selama setiap siklus. Buang kelebihan cairan dengan mengetuk plate
terbalik pada kertas penyerap.
6. Bagikan 100µl Konjugasi Anti-HBsAg HRP (Reagen 6) ke dalam masing-
masing sumuran dan kocok perlahan untuk 5 detik.
7. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37°C.
8. Buang isi sumuran dan cuci lima kali menggunakan Buffer (langkah 5)
LANJUTAN...
9. Bagikan 100µl Larutan Substrat (Reagen 7) ke dalam masing-
masing sumuran. Goyang perlahan selama 5 detik.
10. Inkubasi dalam suasana gelap selama 30 menit pada suhu
37°C.
11. Bagikan 100µl dari Stop Solution (Reagen 8) ke masing-masing
sumuran.
12. Baca OD menggunakan pembaca EIA dengan filter 450nm.
 LANJUTAN..
PEMBACAAN HASIL

Pembaca pelat harus diatur pada panjang gelombang 450nm, atau

pada 450nm dengan filter referensi 630, dan blank di udara. Tentukan
absorbansi masing-masing spesimen dan kontrol.
 PERHITUNGAN
Untuk setiap pengujian dan Kontrol Serum, tentukan Optical Density
(OD) yang diperoleh di sumuranan.

Tingkat potong (Cut-off) = OD Rata-rata dari Kontrol Negatif (Reagen 2) +

0,10

Validasi Uji:
OD dari Kontrol Positif (Reagen 4) harus melebihi 0,300
OD dari Kontrol Negatif (Reagen 2) harus lebih rendah dari 0,15
 INTERPRETASI HASIL
Hasil Negatif: Hasil negatif harus memiliki OD kurang dari cut-off.

Namun, hasil dengan OD hingga 10% lebih rendah dari nilai cut-off
harus dianggap samar-samar. Sampel-sampel ini harus diuji lagi dan jika hasil
yang sama diperoleh, pengujian lain harus dilakukan setelah 1-2 minggu.
Kemungkinan penyebab untuk hasil samar-samar ini dapat berupa sampel yang
terkontaminasi, reaksi non-spesifik atau sampel dengan kadar HBsAg di bawah
nilai cut-off dari uji.
 LANJUTAN...
Hasil Positif: Hasil positif harus memiliki OD sama atau lebih tinggi dari nilai
cut-off.

Hasil positif harus diuji lagi dengan PATHOZYME HBsAg dan jika sampel
terus positif, tes konfirmasi netralisasi harus dilakukan pada sampel tersebut.

Jika tingkat kontrol atau sampel yang diketahui pengguna tidak memberikan hasil
yang diharapkan, hasil pengujian harus dianggap tidak valid.