PERCOBAAN 6

ELEKTROFORESIS

I. TUJUAN
Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui konsentrasi dan kualitas DNA
yang telah diekstraksi

II. TINJUAN PUSTAKA

Elektroforesis DNA adalah proses yang pememisahan atau
pememigrasian fragmen DNA melalui matriks berpori di bawah pengaruh
medan listrik. Elektroforesis dilakukan untuk menentukan keutuhan DNA
total. Prinsip dasar elektroforesis DNA adalah pergerakan molekul bermuatan
atau ion melalui medium semisolid di bawah pengaruh suatu medan listrik
(Sundari & Priadu, 2019). Elektroforesis merupakan proses pemisahan DNA
berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media
pemisah. Kecepatan pergerakan tergantung pada ukuran molekul DNA,
kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk
bermigrasi molekul DNA. Elektroforesis dilakukan menggunakan gel
agarose dalam TBE 1X (Tris-base Boric EDTA). Gel hasil elektroforesis
diwarnai dengan larutan gel red divisualisasikan dengan bantuan UV
transluminator (λ = 320 nm) (Novitasari et. al., 2014).
Elektroforesis DNA adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler
DNA menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
berisi DNA yang akan dipisahkan. Pemisahan menggunakan medan listrik
memiliki prinsip berupa memanfaatkan muatan negatif pada DNA yang
dilewatkan ke medium agarose menggunakan arus listrik yang berlawanan,
sehingga molekul DNA akan bergerak ke arah positif (Yuwono, 2012).
Elektroforesis DNA umum digunakan dalam penentuan konsentrasi maupun
kualitas DNA. Elektroforesis DNA dilakukan dengan cara memisahkan
sampel DNA berdasarkan berat molekul dan struktur fisik molekulnya
(Artati, 2016).

79
III. ALAT
No Nama Alat Spesifikasi/Merek Fungsi

1 Horizontal Miniget System - Untuk pemisahan,

pemurnian, persiapan
sampel berdasarkan
dengan ukurannya

2 Mikropipet - Mengambil dan

memindahkan cairan
dengan volume kecil

3 Vortex mixer - Mencampur sampel

dengan cepat dan
efisien

4 Rak tabung 0,2 mL Tempat untuk

meletakkan tabung

5 UV transilluminator - Memvisualisasikan
DNA setelah
elektroforesis

6 Spindown centrifuge - Memisahkan cairan

dari endapan padat atau
partikel

7 Neraca analitik/timbangan - Untuk menimbang

bahan

8 Erlenmeyer 50 mL Untuk menampung

larutan

9 Gelas ukur 50 mL Untuk mengukur

larutan

80
 10 Microwave - Memanaskan larutan
agarose

IV. BAHAN
No Nama Alat Spesifikasi/Merek Fungsi

1 Agarose - Fase diam dalam

pemisahan fragmen DNA
dan pemadat media
elektroforosis

2 Amplicon - Potongan DNA atau RNA

sebagai replikasi

3 TBE 0,5 X Sebagai buffer

4 DNA Staining florosafe stain Pewarna DNA untuk

memvisualisasikan pita
DNA

5 DNA Ladder 100 kb Geneid Penanda ukuran dan

DNA hasil amplifikasi

6 Loading Dye - Pemberat untuk

memudahkan meletakkan
DNA di dasar sumur

7 Tip Pipet - Untuk mempermudah

pengambilan larutan

V. CARA KERJA

Agarose

● Ditimbang agarose sebanyak 0,4 gram

TBE

81
 ● Dicampurkan agarose dan TBE 5x (20 mL) kedalam
erlenmeyer
● Diberikan plastic seal pada Erlenmeyer berisi
campuran dan diberi lubang sebanyak 6 kali pada
bagian atas erlenmeyer.
● Dipanaskan Erlenmeyer menggunakan microwave
(micro 3) selama 1 menit
● Dituangkan agarosa pada cetakan sebanyak 20 mL

Sisiran

● Diletakkan sisiran pada bagian garis hitam cetakan

TBE
● Ditambahkan TBE 5x hingga tanda batas pada
chamber
● Ditutup chamber dan sesuaikan antara kutub positif
dan negatif
● Dipasang parafilm untuk pencampuran DNA ladder
dan amplicon

Loading dye +
DNA Ladder+
DNA staining

● Dicampurkan loading dye (1 µL) + DNA ladder (4

µL) + DNA staining (1 µL) pada parafilm
Loading dye +
amplikon+ DNA
staining

● Dicampurkan loading dye (1 µL) + amplicon (4 µL)

+ DNA staining (1 µL) pada parafilm
● Didiamkan beberapa menit hingga memadat dan
dilepas sisiran secara perlahan
● Diambil cetakan dan pisahkan dari chamber,
bersihkan bagian bawah cetakan

82
 ● Diletakkan cetakan ke dalam tangka dan posisikan
bagian garis hitam cetakan dengan kutub negatif
Campuran
● Dimasukkan 6 µL campuran ke dalam lubang
cetakan secara berurutan dari DNA ladder hingga
amplicon
● Dipasangkan kabel kutub negative dengan negatif
dan kutub positif dengan positif
● Disambungkan tangki ke power supply dan dirunning
selama 50 menit
● Diletakan agarose di atas lampu UV untuk melihat
panjang bp (base pair)

Hasil
VI. PERHITUNGAN
Perhitungan Panjang Band Amplicon Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis)
Marker Migrasi Log Band 1/Migrasi

100 0,0144 100 69,444

200 0,0219 200 45,662

400 0,0051 400 196,078

500 0,0579 500 17,271

600 0,0041 600 243,902

800 0,0236 800 42,372

900 0,0236 900 42,372

1400 0,1199 1400 8,340

1700 0,0094 1700 106,382

2000 0,3416 2000 2,927

83
Slope (Log Band, 1/Migrasi) = -0,039 Intercept(Log Band, 1/Migrasi) =

111,281

Band Migrasi 1/Migrasi Log Panjang

Band

A 5,14 0,194 -0,039 x 0,194 + 4,711

111,281 = 111,273

B 4,5 0,222 -0,039 x 0,222 + 4,711

111,281 = 111,272

C 3,89 0,257 -0,039 x 0,257 + 4,711

111,281 = 111,270

D 4,38 0,228 -0,039 x 0,228 + 4,711

111,281 = 111,272

E 5,78 0,173 -0,039 x 0,173 + 4,711

111,281 = 111,274

F 3,11 0,321 -0,039 x 0,321 + 4,711

111,281 = 111,268

G 4,67 0,214 -0,039 x 0,214 + 4,711

111,281 = 111,272

H 5,25 0,190 -0,039 x 0,190 + 4,711

111,281 = 111,273

84
Tabel Hasil Pengamatan Amplicon Anggrek Bulan (Phalaenopsis amabilis)
Menggunakan Uv-Vis
Nama Tanaman Hasil Elektroforesis
(Spesies)

Anggrek Bulan
(Phalaenopsis
amabilis)

VII. HASIL DAN PEMBAHASAN

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan
atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Elektroforesis
merupakan suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-
molekul bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul
dalam dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, dan besar muatan dari
molekul (Fuad et al., 2016). Prinsip dasar elektroforesis pergerakan molekul
bermuatan ion negative (DNA) melalui medium agarose di bawah pengaruh medan
listrik yang berlawanan sehingga molekul DNA akan bergerak ke arah positif.
Proses elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk menganalisis fragmen-
fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA
yang telah dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel
agarosa, yaitu suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang diekstraksi dari
rumput laut. Gel agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer. Agar
dapat larut dengan baik, pelarutnya dibantu dengan pemanasan, misalnya
menggunakan oven gelombang mikro (microwave oven). Dalam keadaan panas,
gel akan berupa cairan sehingga mudah dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang

85
biasanya terbuat dari perspex. Sebelum mendingin dan memadat, pada ujung gel
tersebut dibuat lubang-lubang dengan menggunakan lembaran perspex tipis yang
dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang
masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel memadat dan sisirnya diambil
terbentuklah lubang-lubang kecil. Ke dalam lubang-lubang kecil itulah sampel
molekul DNA dimasukkan. Gel agarose yang sudah terbentuk kemudian
dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan trisasetat-
EDTA (TAE) atau tris-borat-EDTA (TBE) (Yuwono, 2008).
Setelah DNA dimasukkan ke dalam lubang sampel, arus listrik dialirkan kutub yang
sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub lainnya
positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul-molekul DNA akan
bergerak kearah kutub positif. Setelah beberapa waktu gel kemudian direndam
dalam larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida akan
menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etidium bromide
dimaksudkan untuk membantu visualisasi karena etidium bromide akan
memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari dengan ultraviolet dari bawah,
maka akan tampak citra berupa pita-pita pada gel . pita-pita tersebut adalah
molekul-molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah dielektroforesi
(Yuwono, 2008).
Pewarnaan DNA mengacu pada proses menggunakan pewarna atau noda
khusus untuk memvisualisasikan dan mengidentifikasi molekul DNA. Ada
beberapa jenis teknik pewarnaan DNA yang biasa digunakan berikut adalah
beberapa metode pewarnaan DNA yang paling umum digunakan pewarnaan
etidium bromida, etidium bromida adalah pewarna fluoresen yang umum
digunakan yang berinterkalasi di antara pasangan basa DNA. Ini memancarkan
fluoresensi merah ketika terikat pada DNA. Pewarnaan etidium bromida umumnya
digunakan dalam elektroforesis gel agarosa untuk memvisualisasikan pita DNA.
Pewarnaan SYBR Green, SYBR Green adalah pewarna fluoresen lain yang umum
digunakan yang berikatan dengan DNA beruntai ganda. Ini memancarkan
fluoresensi hijau ketika terikat pada DNA. Pewarnaan SYBR Green banyak
digunakan untuk visualisasi DNA dalam elektroforesis gel dan reaksi berantai

86
polimerase kuantitatif (qPCR). Pewarnaan DAPI, 4',6-diamidino-2-phenylindole
(DAPI) adalah pewarna fluoresen yang berikatan dengan alur minor DNA. Ini
memancarkan fluoresensi biru ketika terikat pada DNA. Pewarnaan DAPI
umumnya digunakan untuk memvisualisasikan DNA dalam mikroskop fluoresensi
dan pewarnaan nuklir dalam sel tetap. Pewarnaan Hoechst, Pewarna Hoechst adalah
pewarna fluoresen yang berikatan dengan alur minor DNA. Memancarkan
fluoresensi biru ketika terikat pada DNA. Pewarnaan Hoechst umumnya digunakan
untuk visualisasi DNA dalam mikroskop fluoresensi dan analisis siklus sel.
Pewarnaan propidium iodida, propidium iodida adalah pewarna fluoresen yang
berikatan dengan DNA melalui interkalasi. Ini memancarkan fluoresensi merah
ketika terikat pada DNA. Pewarnaan propidium iodida digunakan untuk
menentukan konten DNA dan analisis siklus sel dalam flow cytometry. Pewarnaan
Acridine Orange, Acridine orange adalah pewarna fluoresen yang dapat mengikat
DNA beruntai ganda dan beruntai tunggal. Ini memancarkan fluoresensi hijau
ketika terikat pada DNA beruntai ganda dan fluoresensi merah ketika terikat pada
DNA beruntai tunggal. Pewarnaan oranye Acridine digunakan untuk visualisasi
DNA dalam mikroskop fluoresensi dan uji viabilitas sel. Ini hanyalah beberapa
contoh dari banyak teknik pewarnaan DNA yang tersedia. Pilihan metode
pewarnaan tergantung pada aplikasi spesifik dan persyaratan eksperimental. Setiap
metode pewarnaan memiliki kelebihan dan keterbatasan, dan peneliti sering
memilih teknik yang paling sesuai berdasarkan tujuan penggunaan dan peralatan
yang tersedia (Buckingham, 2019).
Elektroforesis terdiri dari beberapa komponen utama dalam
penggunaannya, yang pertama adalah larutan elektrolit yang bertindak sebagai
pembawa komponen. Biasanya sebagai larutan penyangga yang pH-nya bergantung
pada sifat-sifat senyawa yang akan di disosiasi. Selanjutnya material pemisahan
mengalami proses pemisahan. Media pemisahan ini berupa kertas (selulosa asetat,
selulosa nitrat), gel kanji, gel poliakrilamida, busa poliuretan atau agar. Selain itu
yang terpenting adalah elektroda yang berperan sebagai penghubung arus listrik
yang diarahkan ke media separasi, dan baterai atau arus listrik sebagai sumber
energi (source) pada alat (Widyanto et al., 2021).

87
 Proses pemisahan dengan elektroforesis sangat dipengaruhi oleh teknik
pengerjaan dalam pengoperasian alat tersebut. Disamping itu, ada beberapa faktor
penentu lainnya yang dapat mempengaruhi proses pemisahan yaitu sampel, ukuran
molekul DNA, konsentrasi gel agarosa, voltase, keberadaan pewarna DNA, dan
komposisi buffer elektroforesis. Sampel yang akan dipisahkan sangat
memungkinkan memberi pengaruh laju perpindahan ditinjau dari muatan, ukuran,
dan bentuk molekul. Larutan buffer berfungsi untuk mempertahankan pH di dalam
medium pemisah, dan berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses
pergerakan aliran listrik. Larutan buffer harus memiliki interaksi dengan molekul
yang dipisahkan, dan pH yang digunakan menjadi perhatian sehingga kumpulan
molekul dapat dipisahkan satu sama lain tetapi tidak mengalami perubahan struktur.
Larutan buffer harus dipilih dengan cermat karena keterkaitan ion buffer dalam
berinteraksi dengan senyawa yang diteliti, pH dipilih berdasarkan jenis campuran
yang akan dipisahkan (Harahap, 2018).
Sumber suatu listik yang stabil sangat diperlukan untuk menghasilkan aliran
listrik dengan tegangan yang konstan. Kekuatan ionik medan listrik pada kisaran 2-
8 V/cm sesuai pada suhu ruang. Kekuatan medan magnet yang dihasilkan jika lebih
besar dari 10 V/cm, maka dapat memberikan efek pemanasan yang dapat
menyebabkan pada media penyangga terjadi kehilangan air yang diakibatkan proses
penguapan. Hal tersebut juga mengakibatkan pergeseran hasil fragmen-fragmen.
Pemanasan merupakan salah satu faktor yang mengakibatkan senyawa-senyawa
terdenaturasi. Disamping kekurangan dengan menggunakan tegangan yang tinggi,
keuntungan elektroforesis pada voltase tinggi mengakibatkan pemisahan yang
sangat cepat. Sehingga senyawa-senyawa dengan berat molekul rendah akan
mengalami proses difusi yang paling baik dipisahkan dalam kondisi elektroforesis
tegangan tinggi (Harahap, 2018).
Cara kerja elektroforesis pada percobaan kali ini yaitu pertama-tama
ditimbang gel agarose sebanyak 0,4 gram, kemudian dicampurkan agarose dan TBE
5x (20 mL) kedalam erlenmeyer serta diberikan plastic seal pada erlenmeyer berisi
campuran dan diberi lubang sebanyak 6 kali pada bagian atas erlenmeyer.
Erlenmeyer kemudian dipanaskan menggunakan microwave (micro 3) selama 1
menit dan tuangkan agarosa pada cetakan sebanyak 20 m. Sisiran diletakkan pada

88
bagian garis hitam cetakan untuk membentuk sumuran di medium elektroforesis
kemudian ditambahkan TBE 5x hingga tanda batas pada chamber dan ditutup
chamber serta sesuaikan antara kutub positif dan negatif, setelah itu dipasang
parafilm untuk pencampuran DNA ladder dan amplicon. Loading dye (1 µL) +
DNA ladder (4 µL) + DNA staining (1 µL) dicampurkan pada parafilm dan
didiamkan beberapa menit hingga memadat dan dilepas sisiran secara perlahan.
Cetakan diambil dan pisahkan dari chamber, bersihkan bagian bawah cetakan,
kemudian diletakkan cetakan ke dalam tangki dan posisikan bagian garis hitam
cetakan dengan kutub negatif. 6 µL campuran dimasukkan ke dalam lubang cetakan
secara berurutan dari DNA ladder hingga amplicon, kemudian dipasangkan kabel
kutub negatif dengan negatif dan kutub positif dengan positif, disambungkan tangki
ke power supply dan dirunning selama 50 menit, diletakan agarose di atas lampu
UV untuk melihat panjang bp (base pair).
Berdasarkan hasil visualisasi kualitatif DNA setelah dielektroforesis pada
UV transluminator (320 nm) diperoleh bahwa pita DNA marker tampak di medium
elektroforesis dan DNA sampel menghasilkan pita-pita DNA pada band DNA B,
D, F, dan G sedangkan pada pita band DNA A, C, E, dan H tidak muncul. Hal
tersebut kemungkinan disebabkan karena arus listrik yang terlalu besar yang
mengakibatkan panas yang akan merubah bentuk pita DNA atau DNA dimasukkan
ke dalam sumuran dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut.
Berdasarkan hasil interpretasi kuantitatif diperoleh regresi linear y= -0,039x +
111,281 dengan jarak migrasi band DNA A, B, C, D, E, F, G, H secara berturut-
turut sepanjang 5,14 cm; 4,5 cm; 3,89 cm; 4,38 cm; 5,78 cm; 3,11 cm; 4,67 cm; dan
5,25 cm. Hasil ini dapat disimpulkan bahwa band DNA E merupakan jarak paling
jauh bermigrasi. Hasil panjang band tiap DNA sampel diperoleh 4,711, hasil
analisis yang diperoleh menunjukkan ke delapan sampel yang diuji diduga
merupakan sampel yang sama yaitu anggrek bulan (Phalaenopsis amabilis).

89
 VIII. DAFTAR PUSTAKA

Buckingham, L. 2019. Molecular Diagnostics Fundamentals, Methods, and

Clinical Applications. Davis Company, America.

Fuad, A. R. M., I. Ulfin & F. Kurniawan. 2016. Penggunaan Agar-agar Komersial

sebagai Media Gel Elektroforesis Pada Zat Warna Remazol: Pengaruh
Komposisi Buffer, pH Buffer dan Konsentrasi Media. Jurnal Sains dan Seni
ITS. 5: 130-133.

Harahap, M. R. 2018. Elektroforesis: Analisis Elektronika Terhadap Biokimia

Genetika. Jurnal Ilmiah Pendidikan Teknik Elektro. 2: 21-26.

Widyanto, R. M., N. Muslihah, T. Y. M. Raras, I. S. Rahmawati, C. Y. Dini & A.

R. Maulidiana.2021. Gizi Molekuler. UB Press, Malang.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta.

Penilaian
Buku Laporan Kerja
Pretes kerja Kebersihan Paraf korektor
Kerja Kerja (Asisten)
sendiri

( )

90