Tujuan Praktikum :

1. Mengetahui cara mengisolasi enzim polifenol oksidase

2. Menentukan aktivitas dari enzim polifenol oksidase
3. Menentukan aktivitas enzim berdasarkan pengaruh pH, suhu, dan inhibitor

Teori Dasar :
Enzim merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi mempercepat proses
reaksi tanpa ikut bereaksi dalam suatu reaksi kimia organik. Hal tersebut menyebabkan
terjadinya perombakan nutrien untuk menyediakan energi dan chemical building blocks. Enzim
bekerja sangat spesifik terhadap reaksi yang dikataliskan maupun terhadap substrat yang ada
pada reaksi. Kespesifikan enzim dapat dilihat dari bentuk, muatan, dan karakteristik enzim dan
substratnya. Pembentukan trasition state dalam kompleks enzim substrat adalah awal
kemampuan enzim untuk mengkatalisis. Substrat yang terikat pada daerah spesifik dari enzim
disebut sisi aktif. Sisi aktif pada enzim dibagi menjadi 2 model, yaitu model lock and key dan
induced fit. Model lock and key yang diajukan oleh Emil Fisher menjelaskan bahwa enzim dan
substrat memiliki bentuk geometri yang saling memnuhi seperti “kunci dan gembok”. Lalu
model induced fit yang dikemukan oleh Daniel Koshland menjelaskan bahwa ketika substrat
terikat dengan enzim maka enzim akan terpicu perubahan konformasinya oleh substrat
sehingga reaksi dapat terjadi.
Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti konsentrasi enzim,
kosentrasi substrat, suhu, pH dan inhibitor. Konsentrasi enzim mempengaruhi kecepatan awal
suatu reaksi yang dikatalis enzim. Semakin tinggi konsentrasi enzim maka semakin cepat pula
kecepatan awal suatu reaksi tersebut. Lalu, konsentrasi substrat yang meningkat maka
kecepatan awal reaksi akan meningkat hingga mencapai nilai maksimum. Hal tersebut terjadi
ketika kondisi lain dipertahankan konstan. Selain itu, pergeseran pada nilai pH akan
mempengaruhi aktivitas enzim. Pergeseran kecil pH akan menurunkan aktivitas enzim karena
adanya perubahan ionisasi gugu dari sisi aktif enzim. Suhu juga mempunyai pengaruh terhadap
aktivitas enzim. Peningkatan suhu akan meningkatkan energi termal dari molekul substrat yang
bereaksi. Namun, energi kinetik enzim akan melampaui rintangan energi sehingga kecepatan
reaksi akan meningkat. Terakhir, aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh inhibitor. Inhibitor
pada enzim dapat berupa substansi asing yang memiliki efek inhibisi pada enzim tersebut.
Inhibisi kerja enzim dapat dibagi menjadi dua, yaitu inhibisi irreversible dan inhibisi reversible.
Alat dan Bahan :
1. Blender 14. Air liur
2. Kentang 15. Air es
3. Aseton 16. Air mendidih
4. Larutan buffer Na3PO4 0,1 M 17. Larutan iodium 0,01 M
5. Kertas saring Whatman no.1 18. Larutan buffer
6. Tabung reaksi 19. Larutan tepung 1%
7. Larutan buffer fosfat 0,1 M 20. Larutan NaCl
8. Larutan katekhol 21. Larutan saliva
9. H2O 22. Toluen
10. Larutan enzim kasar 23. Kloroform
11. Pereaksi CuSO4 24. HgCl2
12. Pereaksi Folin Ciocalteu 1 M 25. Fenol 2
13. Larutan Bovin Serum Albumin 26. NaF

MSDS :
Na3SO4 Buffer Fosfat
- Padat - Cair
- Berat molekul: 142,04 g/mol - Titik lebur: -5°C
- Titik lebur: 888°C - Titik didih: 109°C
- Penanganan: - Penanganan:
• Bawa korban ke udara segar • Beri oksigen jika terhirup
jika terhirup • Jika terkena kulit segera cuci
• Jika terkena kulit, cuci air air mengalir
mengalir
Aseton Katekhol
- Cair - Padat
- Berat molekul: 58.08 g/mol - Titik lebur: 245°C
- Titik lebur: -95,4°C - Titik didih: 106°C
- Titik didih: 56,2 °C - Penanganan:
- Penanganan: • Bilas mata dengan air selama
30 menit
 • Jika terkena mata, bilas dengan • Jika tertelan jangan memicu
air selama 15 menit dan periksa muntah dan beri susu
kelopak mata
• Jangan dimuntahkan jika tertelan
Bovine Serum Albumin Pereaksi Folin Ciocalteu
- Padat - Cair
- Penanganan: - Penanganan:
• Jika terkena kulit, lepas • Jika terkena kulit, lepas
pakaian yang terkontaminasi pakaian yang terkontaminasi
dan cuci dengan air mengalir dan cuci dengan air mengalir
bagian kulit yang terkena. bagian kulit yang terkena.
• Lakukan pernapasan buatan • Lakukan pernapasan buatan
jika terhirup jika terhirup
CuSO4 Iodine
- Padat - Cair
- Berat molekul: 159,61 g/mol - Berat molekul: 253.81 g/mol
- Titik lebur: 200°C - Penanganan:
- Penanganan: • Jika terkena mata, bilas
• Jika terkena mata, bilas dengan air selama 15 menit
dengan air selama 15 menit dan periksa kelopak mata
• Jika tertelan, beri air • Jika tertelan, beri air
minuman sebanyak 1-2 gelas minuman sebanyak 1-2 gelas
Cara Kerja :
1. Isolasi Enzim Polifenol Oksidase

Blender 250g potongan

Endapan berupa tepung
kentang dalam 250mL Larutkan endapan dalam
aseton disaring dan
aseton (sebaiknya dalam 150mL aseton dan
mengandung enzim
keadaan dingin) di blender kembali
polifenol oksidase
blender gelas ±3 menit

Keringkan endapan
dengan cara dianginkan
Larutkan 1g tepung
Aduk campuran selama 1
aseton dalam 37,5mL
jam pada suhu antara 5-
larutan buffer Na3PO4
10℃
0,1M dan pH 6,8

Sentrifugasi campuran Dekantasi dan saring

Diperoleh filtrat yang
pada 3000 rpm selama cairan pada kertas saring
merupakan enzim kasar
30 menit Whatman no.1

2. Penentuan Aktivitas Polifenol Oksidase

Siapkan 3 tabung reaksi

Inkubasi tabung yang
dan lakukan percobaan
terisi pada suhu 30℃
sesuai petunjuk pada
selama 30 menit
tabel 6

Hentikan aktivitas enzim

Tentukan perubahan
dengan merendam
absorbansi pada 𝜆 = 470
tabung dalam air
nm
mendidih selama 3 menit
3. Penentuan Kadar Protein Enzim Kasar (Metode Lowry)

Tambahkan 5mL pereaksi

Kocok dan inkubasi selama
CuSO4 ke dalam 0,5mL
10 menit
larutan enzim kasar

Tambahkan 0,5 pereaksi

Inkubasi selama 30 menit
Folin Ciocalteu 1 M

Larutan standar yang

dapat digunakan adalah
Ukur absorbansinya pada
larutan BovinSerum
𝜆 = 700 nm
Albumin dengan
konsentrasi 20 - 200𝜇𝑔

4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase

Berikan keterangan seperti:

Siapkan 11 tabung reaksi K1 = kontrol 1
sesuai tabel 7 K2 = kontrol 2
S = Sampel

Aktivitas enzim dihentikan

Inkubasi tabung yang terisi dengan merendam tabung
pada 30℃ selama 30 menit dalam air mendidih selama
3 menit

Tentukan perubahan
absorbansi pada 𝜆 = 470
nm
5. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase

Siapkan 11 tabung reaksi

dan lakukan percobaan Inkubasi tabung pada
sesuai dengan petunjuk 30℃ selama 30 menit
tabel 8

Aktivitas enzim
Tentukan perubahan
dihentikan dengan
absorbansi pada 𝜆 =
mendidihkan dalam air
470 nm
selama 3 menit

6. Pengaruh Suhu terhadap AktivitasEnzim Polifenol Oksidase

Aktivitas enzim
Sediakan 15 tabung
dihentikan dengan
reaksi dan ikuti
mendidihkan dalam air
prosedur pada tabel 9
selama 3 menit

Tentukan perubahan
absorbansi pada 𝜆 =
470 nm

7. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Enzim Polifenil Oksidase

Aktivitas enzim
Sediakan 15 tabung
dihentikan dengan
reaksi dan ikuti
mendidihkan dalam air
prosedur pada tabel 10
selama 3 menit

Tentukan perubahan
absorbansi pada 𝜆 =
470 nm
8. Pengumpulan Air Liur

Cuci mulut dengan cara berkumur-

kumur menggunakan air, sehingga
bebas dari sisa makanan

Tampung air liur sampai volumenya

kurang lebih 25mL

9. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Sediakan 4 tabung Inkubasi larutan harus

reaksi dan ikuti langsung dilakukan
prosedur pada tabel setelah penambahan
11 saliva

Seluruh tabung jangan Setiap menit ambil

dibiarkan pada rak 1mL sampel dan
tabung kecuali tabung menambahkan 2 tetes
no.2 latutan iodium 0,01 M

Amati aktivitas
enzimnya
10. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Sediakan 5 tabung reaksi Tentukan pH berapa

dan ikuti prosedur pada Inkubasi pada suhu 38℃ mencapai titik akromatif
tabel 12 paling cepat

Tabung no.1 dan 2,

sebelum penambahan
Lakukan tes iodium pada
larutan, terlebih dahulu
setiap tabung
harus diasamkan dengan
asam asetat

11. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Sediakan 6 tabung reaksi Diamkan selam 10 menit

dan ikuti prosedur pada sambil beberapa kali
tabel 13 dikocok

Tambahkan 5mL larutan

Inkubasi pada suhu 38℃
tepung 1% pada setiap
selama 15 menit
tabung

Amati dan tentukan

Lakukan tes iodium dan
senyawa berfungsi
tes benedict pada setiap
sebagai inhibitor
setengah jumlah volume
terhadap pytialin atau
larutan pada tabung
tidak
Pembahasan :
1. Isolasi Enzim Polifenol Oksidase
Polifenol oksidase atau PPO adalah enzim yang digolongkan dalam
oksidoreduksi dan mengkatalisis proses senyawa monofenol menjadi senyawa kuinon.
Senyawa tersebut dapat mengalami reaksi yang sangat reaktif dengan menghasilkan pigmen
melanin akibat polimerisasi. Warna yang dihasilkan oleh pigmen tersebut adalah merah, coklat,
dan hitam. Enzim PPO dapat berfungsi sebagai pemicu biosintesis lignin atau berpartisipasi
dalam perlindungan mekanik dari jaringan tumbuhan yang luka atau memar. Perlindungan
mekanik tersebut terlihat dari perubahan warna menjadi kecoklatan jika terluka.
Untuk membuktikan kandungan enzim PPO dilakukan proses isolasi sehingga dapat
teramati. Enzim PPO diisolasi dengan memblender kentang dan disaring serta ditambah aseton
sehingga didapatkan endapan tepung aseton. Endapan tersebut dilarutkan ke dalam larutan
buffer Na3PO4 0,1 M dan diaduk. Larutan tersebut di sentrifugasi, lalu di dekantasi, dan disaring
dengan kertas saring Whatman no.1. Hasil penyaringan yang didapat berupa enzim kasar yang
dapat digunakan pada percobaan lainnya.
2. Penentuan Aktivitas Polifenol Oksidase
Aktivitas enzim ditentukan oleh banyaknya jumlah enzim yang dapat
mengkatalis suatu substrat pada kondisi optimum. Laju reaksi oksidasi substrat
pirogalol dengan enzim polifenol oksidase (PPO) merupakan hal yang diamati pada
aktivitas PPO. Aktivitas tersebut terlihat dari bahan yang digunakan menjadi berwarna
kecoklatan. Percobaan tersebut dimulai dengan menyiapkan 3 tabung reaksi sesuai
dengan petunjuk Tabel 6 di bawah. Lalu inkubasi tiap tabung dalam suhu 30℃ selama
30 menit. Setelah itu, tabung direndam dalam air mendidih selama 3 menit sehingga
aktivitas enzim terhenti. Perubahan warna diamati dengan spektrofotometer dengan
panjang 420 nm. Unit aktivitas yang ekuivalen pada aktivitas PPO dinyatakan dengan
kenaikan 0,001 absorbansi per menit.
3. Penentuan Kadar Protein Enzim Kasar (Metode Lowry)
Percobaan ini dilakukan dengan menggunakan BSA untuk menemukan kadar
protein dari berbagai konsentrasi standar protein. Perhitungan dilakukan dengan
menggunakan metode Lowry secara spesifik. Hasil tersebut menunjukkan kemurnian
enzim yang dilihat melalui spektrofotometer dengan panjang gelombang 700 nm.
Tetapi hal tersebut tidak dapat menjadikan aktivitas spesifik dari enzim kasar sebagai
tolak ukur kemurnian suatu enzim. Hal tersebut dikarenakan tahap pemurnian enzim
belum dilakukan.
4. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Polifenol Oksidase
Angka pH pada suatu reaksi sangat mempengaruhi enzim. Perubahan pH akan
mengakibatkan kerja enzim dapat berubah karena keadaan yang terlalu asam ataupun
basa. Enzim akan bekerja secara efektif pada pH lingkungan atau pH optimum. Jika pH
bergeser maka aktivitas enzim akan menurun sangat cepat. Enzim PPO memiliki pH
optimum sebesar 6,0 tetapi masih stabil pada pH 4,0–7,0. Percobaan dilakukan
menyiapkan 11 tabung reaksi yang diberi perlakukan seperti Tabel 7 di bawah. Tabung
diinkubasi dalam suhu 30℃ selama 30 menit. Setelah itu, tabung direndam dalam air
mendidih selama 3 menit sehingga aktivitas enzim terhenti. Pengaruh pH pada aktivitas
PPO dapat diamati dengan perubahan absorbansi pada spektrofotometer dengan
panjang gelombang 420 nm.

5. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase

Konsentrasi substrat memiliki pengaruh pada aktivitas enzim PPO. Konsentrasi
substrat yang semakin besar membuat aktivitas enzim semakin tinggi. Namun, enzim
akan membentuk kompleks enzim substrat jika konsentrasi substrat sudah berlebih.
 Percobaan dilakukan dengan menyiapkan 11 tabung dengan perlakuan seperti pada
Tabel 8 di bawah. Inkubasi tabung dalam suhu 30℃ selama 30 menit. Setelah itu,
tabung direndam dalam air mendidih selama 3 menit sehingga aktivitas enzim terhenti.
Lalu tentukan perubahan absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang
gelombang 420 nm.

6. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase

Suhu sangat mempengaruhi aktivitas suatu enzim. Setiap enzim memiliki suhu
optimum yang membantu enzim bekerja lebih baik. Perubahan pada suhu
mempengaruhi reaksi enzimatis dan stabilitas enzim. Jika di bawah suhu optimum,
enzim memiliki aktivitas yang rendah sedangkan jika di atas suhu optimal, enzim akan
terdenaturasi. Enzim tidak akan efektif jika suhu kurang dari 0℃ dan berhenti pada
suhu 196 ℃ . Lalu enzim akan terdenaturasi pada suhu 55 - 65 ℃ . Enzim PPO
mempunyai kestabilan suhu relatif sekitar 50 – 70℃. Percobaan dilakukan dengan
menyediakan 15 tabung reaksi dengan perlakuan seperti tabel 9 di bawah. Lalu, tabung
direndam dalam air mendidih selama 3 menit sehingga aktivitas enzim terhenti. Amati
perubahan absorbansi dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 420 nm.
7. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Aktivitas Enzim Polifenol Oksidase
Enzim memerlukan waktu untuk memecah protein menjadi protein yang larut.
Waktu yang diperlukan tersebut adalah waktu inkubasi. Pada saat inkubasi, adanya
faktor lain yang terlibat seperti cahaya, suhu, dan bahan kimia. Namun, waktu inkubasi
dengan nilai aktivitas enzim berbanding terbalik. Hal tersebut dikarenakan waktu
inkubasi yang lama akan menurunkan aktivitas enzim. Percobaan tersebut dilakukan
dengan menyiapkan 15 tabung reaksi sesuai dengan Tabel 10 di bawah. Lalu, tabung
direndam dalam air mendidih selama 3 menit sehingga aktivitas enzim terhenti. Setelah
itu, amati perubahan absorbansi melalui spektrofotometer dengan panjang gelombang
420 nm.

8. Pengumpulan Air Liur

Air liur atau saliva merupakan zat yang dihasilkan oleh kelenjar air liur yang
terdiri dari 99,5% air dan 0,5% non air. Saliva mengandung banyak zat organik yang
berfungsi pada proses pencernaan manusia. Percobaan dilakukan menampung air liur
sebagai sampel dalam percobaan ini. Sebelum pengambilan sampel, bersihkan mulut
dengan cara berkumur dengan air. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan sisa
makanan di mulut sehingga tidak membuat hasil percobaan tidak murni.
9. Pengaruh Suhu terhadap Aktivitas Enzim Saliva
Enzim saliva dapat dipengaruhi faktor suhu. Kemampuan menghidrolisis
amilum menjadi maltosa dan glukosa dalam mulut dimiliki oleh enzim saliva. Hal
 tersebut dapat diliat dari perlakuan pada 4 tabung reaksi yang dikuti prosedur pada
Tabel 11 di bawah. Pada saat tabung ditambahkan saliva, inkubasi harus langsung
dilakukan agar suhu lingkungan tidak memberi pengaruh kecuali pada tabung no. 2.
Setiap satu menit teteskan iodium dan amati perubahan warna pada sampel.

10. Pengaruh pH terhadap Aktivitas Saliva

Perubahan pH pada saliva sendiri dapat terjadi adanya faktor yang terlibat
seperti kapasitas buffer yang diterima, kecepatan aliran saliva, dan keberadaan
mikroorganisme di rongga mulut. Percobaan dilakukan dengan menyediakan 5 tabung
reaksi dengan perlakukan seperti pada Tabel 12 di bawah. Lalu setiap tabung diinkubasi
pada suhu 38℃. Pengamatan di lakukan dengan menambahkan larutan buffer hingga
mencapai titik akromatik. Pada titik tersebut, diamati pH ke berapa larutan tersebut
memperoleh titik aromatiknya.

11. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim Saliva

Inhibitor merupakan molekul yang berpengaruh terhadap aktivasi enzim dengan cara
menurunkan aktivasi suatu enzim. Inhibitor memiliki hubungan erat dengan konsentrasi
substrat. Jika konsentrasi substrat rendah, inhibitor akan mempengaruhi laju reaksi
dengan menghambatnya. Hambatan atau inhibisi dibagi menjadi dua, yaitu inhibisi
irreversible dan inhibisi reversible. Percobaan dilakukan dengan menyediakan 6 tabung
reaksi sesuai perlakuan pada Tabel 13 di bawah. Tabung didiamkan selama 10 menit
sambil dikocok beberapa kali. Lalu ditambahkan larutan 1% tepung pada tiap tabung.
Setelah itu, setiap tabung diinkubasi pada suhu 38℃ selama 15 menit. Selanjutnya,
dilakukan tes iodium dan tes benedict. Tes iodium berguna untuk mendeteksi
 keberadaan amilum sebelum direaksikan sedangkan tes benedict berguna untuk
menguji amilum yang telah berubah menjadi glukosa.

Kesimpulan :
1. Isolasi enzim polifenol oksidase dilakukan dengan mengamati perbedaan kelarutan
pada enzim dengan komponen lain.
2. Penentuan aktivitas enzim polifenol oksidase dapat dilakukan dengan menentukan
kadar protein enzim kasar menggunakan metode Lowry serta pengecekan dengan tes
iodium.
3. Enzim dapat dipengaruhi oleh perubahan suhu, pergeseran pH, jumlah konsentrasi
substrat, waktu inkubasi, dan adanya inhibitor.

Daftar Pustaka :
Mardiah, E. 2011. Mekanisme inhibisi enzim polifenol oksidase pada sari buah markisa dengan
sistein dan asam karbonat. Jurnal Riset Kimia 4(2): 32– 37.
Nieuw, A.A., & E.C.I. Veerman. 1991. Ludah dan Kelenjar Ludah: Arti Bagi Kesehatan Gigi.
1st ed. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta: xxiii + 269 hlm.
Putra, G.P.G., Wartini, N.M. & Anggreni, A.A.M.D. 2010. Karakteristik enzim polifenol
oksidase biji kakao (Theobroma cacao Linn.). Agritech 30(3): 152 – 157.
Wahyuni, S. 2017. BIOKIMIA ENZIM DAN KARBOHIDRAT. Unimal Press, Lhokseumawe:
viii + 82 hlm.