MAKALAH RESUME JURNAL PENELITIAN INTERNASIONAL

Evaluation of bacterial contamination in raw milk, ultra-high temperature

milk and infant formula using single molecule, real-time sequencing
technology
Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Tugas Mata Kuliah Analisis Cemaran Lingkungan

Dosen : Nia Kristiningrum, M.Farm., Apt.

Disusun Oleh: Kelompok 9

Aries Syafitri P 142210101015
Siti Nur Azizah H 152210101127
Mayrani Sholihania 152210101143
Milka Bella Savira P 162210101011

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2018
Abstrak
The Pacific Biosciences single molecule, real-time sequencing technology (SMRT)
diketahui memiliki beberapa kelebihan dalam menganalisis profil bakteri sampel lingkungan.
Pada studi ini, munculnya kontaminan bakteri pada susu mentah, susu UHT, dan susu formula
bayi ditentukan oleh SMRT panjang gen 16S rRNA. Profil bakteri yang diperoleh pada
taksonomi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang jelas dalam struktur bakteri pada 16
sampel susu yang dianalisis. Tidak ada indikasi bakteri patogen yang ditemukan. Namun,
beberapa bakteri yang terdeteksi (misalnya, Bacillus cereus, Enterococcus casseliflavus, dan
Enterococcus gallinarum) mungkin berpotensi pada kecacatan kualitas produk dan antibiotik
bakteri dalam transfer gen. Meski jumlah sampel susu yang dianalisis terbatas, data yang
diperoleh nenunjukkan layak menggunakan SMRT platform sequencing dalam mendeteksi
kontaminasi bakteri. Makalah kami juga memberikan informasi referensi yang menarik untuk
pengembangan masa depan dalam pencegahan atau strategi baru untuk mengendalikan
keamanan produk susu dalam skala besar jalur produksi industri.

1. Pendahuluan
Kontaminasi bakteri dari produk susu sangat dikhawatirkan di seluruh dunia, produksi
dan konsumsi susu telah berkembang secara luas selama dekade terakhir. Susu mentah, susu
UHT, dan susu formula adalah produk susu jenis utama yang dikonsumsi oleh orang dewasa
dan bayi. Produk-produk susu ini dikenal memiliki kandungan gizi yang kaya karbohidrat,
protein, dan mineral, yang dapat meningkatkan pertumbuhan mikroba serta beberapa patogen
yang dibawa makanan. Konsumsi produk yang mengandung patogen dapat menyebabkan
penyakit mulai dari sakit perut hingga gejala yang lebih serius (misalnya, diare, demam,
muntah, dan sebagainya. Terjadinya jenis bakteri lain dapat berpotensi mempengaruhi kualitas
gizi dan sensorik produk properti sehingga menyebabkan kerugian ekonomi yang signifikan.
Dengan demikian, metode yang akurat dan efektif untuk menilai makanan yang terkontaminasi
mikroba adalah yang paling penting.
Cara tradisional mendeteksi kontaminasi bakteri dalam produk susu bergantung pada
penggunaan metode tes biokimia Proses analisis sampel memakan waktu lama, tidak mudah
ditangani, dan hasilnya bisa ambigu karena variabel biokimia fenotipe mikroba. Faktor-faktor
ini mendorong pengembangan metode yang andal dan cepat untuk identifikasi mikroba yang
ada dalam produk susu.
Beberapa penelitian telah dilakukan dengan memasukkan berbagai teknik molekuler,
seperti gel pulsed-field elektroforesis, PCR real-time, dan microarray, untuk menyelidiki
prevalensi bakteri yang terkontaminasi dan tingkat kontaminasi dalam produk susu. Padahal
beberapa perbaikan telah terbukti menggunakan teknik pendeteksian berbasis molekul ini.
Keterbatasan yang dimiliki oleh metodologi ini adalah kegagalan dalam menyediakan profil
mikroba keseluruhan dalam sampel, karena sebagian besar pendekatan ini membutuhkan
deteksi dari mikroorganisme target spesifik. Profil lengkap mikroba ditawarkan untuk evaluasi
obyektif pada kualitas sampel mikroba dan mengkuantifikasi tingkat kontaminasi.
The Pacific Biosciences, teknologi sekuens real-time (SMRT) diketahui memiliki
beberapa keuntungan menganalisis profil bakteri dari sampel lingkungan berdasarkan gen 16S
rRNA full-length. Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk menerapkan teknologi
tersebut dalam menilai bakteri kontaminasi produk susu, termasuk susu mentah, susu UHT, dan
susu formula bayi. Studi kami telah menunjukkan kelayakan untuk pertama kalinya
menggunakan sistem sekuensing SMRT dalam mendeteksi bakteri kontaminasi dalam sampel
susu. SMRT akan menarik minat industri makanan untuk pemantauan yang efektif terhadap
kualitas makanan mikroba dan keamanan selama produksi.

2. Bahan dan Metode

2.1 Preparasi Sampel
Sebanyak 16 sampel dikumpulkan, diantaranya 2 sampel susu mentah dari peternakan
lokal, 4 sampel susu UHT, dan 10 sampel susu formula bayi dari supermarket. Sampel susu
mentah dikumpulkan secara aseptik dan semua sampel disimpan dalam kotak es selama
perjalanan. Informasi sampel diuraikan dalam Tabel 1.
2.2 Ekstraksi DNA
DNA diekstraksi menggunakan DNA OMEGA kit isolasi. Kemudian kualitas dari DNA
yang telah diekstraksi diperiksa dengan elektroforesis gel agarose 1% dan spektrofotometri.
Semua sampel DNA yang diekstraksi disimpan pada suhu −20°C untuk dianalisis lebih lanjut.

2.3 Amplifikasi PCR

Bakteri 16S rRNA diamplifikasi menggunakan PCR untuk sekuens SMRT. Selanjutnya
diperkuat menggunakan forward 27F (5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′) dan primer
1541R (5′- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ′). Primer-primer ini mengandung satu set 16-
nukleotida. Amplifikasi PCR dari 16S rRNA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya.
Program PCR adalah 95°C untuk 4 menit, 30 siklus 95°C selama 60 detik, 60°C selama 45 detik,
dan 72°C selama 60 detik dengan perpanjangan akhir 72°C selama 7 menit. Amplikon
disekuensing menggunakan kimia P6-C4 instrumen PacBio RS II (Pacific Biosciences).
Selajutnnya kontrol kualitas untuk amplifikasi dan urutan PCR preprocessing dilakukan seperti
yang dijelaskan sebelumnya.

2.4 Analisis Data

Pengolahan data mentah dilakukan menggunakan protokol RS_ReadsOfinsert.1 yang
tersedia di Portal SMRT versi 2.7 (PacBio). Parameter penyaringan, termasuk lintasan penuh
minimum, akurasi prediksi minimum, panjang bacaan sisipan minimum dan Panjang bacaan
maksimum, masing-masing ditetapkan dengan nilai 5, 90, 1,400, dan 1.800. Ekstraksi sekuens
berkualitas tinggi pertama kali dilakukan dengan paket QIIME (Wawasan kuantitatif dalam
Ekologi Mikroba, versi 1.7; Caporaso et al., 2010b); PyNAST dan UCLUST kemudian
diterapkan untuk menyelaraskan kualitas tinggi yang diekstrak urutan di bawah 100%
pengelompokan identitas untuk mendapatkan urutan yang representative. Urutan set
diklasifikasikan ke dalam unit taksonomi operasional (OTU) di bawah batas ambang identitas
99% menggunakan UCLUST setelah pemilihan urutan perwakilan. Taksonomi setiap urutan
perwakilan OTU ditugaskan menggunakan database Ribosomal Database Project II yang
diklasifikasikan pada ambang bootstrap minimum 80%. Pohon taksonomi de novo dibangun
menggunakan OTU representatif yang diatur dalam FastTree untuk downstream analisis,
termasuk perhitungan β diversity. Shannon-Wiener, keragaman Simpson, Chao1, dan estimator
dihitung untuk mengevaluasi keragaman α. Jarak UniFrac didasarkan pada pohon filogenetik.
Kedua perhitungan tertimbang dan tidak tertimbang dilakukan untuk analisis titik utama.
Presentasi grafik yang dihasilkan oleh versi paket R 3.1.2 (https://www.r-project.org/) dan
perangkat lunak Asal versi 8.5.

2.5 Nomor Akses Urutan Nukleotida

Urutan data dalam penelitian ini telah disimpan dalam database MG-RAST (Accession
No. 4633130.3–4633145.3; http://metagenomics.anl.gov/).

3. Hasil
3.1 Urutan Kelimpahan dan Keanekaragaman
Untuk mendapatkan profil bakteri yang akurat dari produk susu, dilakukan SMRT
sequencing dari 16S full-length gen rRNA. Sebanyak 26.976 bacaan mentah dihasilkan dari 16
sampel produk susu, dengan rata-rata 1,686 bacaan untuk setiap sampel. Dengan menghitung
indeks Shannon, indeks Simpson, indeks Chao1, dan mengamati indeks spesies (Tabel 1), jelas
bahwa sebagian besar sampel memiliki tingkat keanekaragaman hayati bakteri yang tinggi.
Khususnya, salah satu sampel formula bayi (sampel No. 9) ditemukan memiliki keragaman
tertinggi, dengan nilai indeks Shannon 7,874. Kurva keragaman Shannon-Wiener menunjukkan
bahwa kedalaman urutan cukup untuk semua sampel (Gambar 1). Data yang disajikan di sini
menunjukkan bahwa sebagian besar memiliki keragaman bakteri dalam sampel.

3.2 Komposisi Bakteri dalam Susu Mentah, Susu UHT, dan Susu Formula Bayi
Urutan yang dihasilkan oleh platform SMRT diidentifikasi ke tingkat filum, genus, dan
spesies untuk memungkinkan analisis mendalam dari kumpulan sampel bakteri. Umumnya,
ditampilkan distribusi kumpulan bakteri yang tidak seimbang pada sampel susu, dengan relatif
banyak bakteri yang sangat bervariasi antar sampel. Dengan menggunakan classifier Proyek
Ribosomal Project, lebih dari 19 filum diidentifikasi dari semua sampel, 5 dari mereka memiliki
relatif rata-rata lebih 1%, yaitu Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Deinococcus-
Thermus, dan Cyanobacteria. Firmicutes tampaknya menjadi filum yang paling umum di semua
sampel, sedangkan 6 filum terakhir hanya terdiri proporsi rendah (Gambar 2). Di tingkat genus,
relatif banyak rata-rata Enterococcus, Lactococcus, Solibacillus, Bacillus, Lactobacillus,
Streptococcus, Sporosarcina, Pseudomonas, Propionibacterium, Thermus, dan Acinetobacter
ditemukan lebih besar dari 1% (Gambar 3). Secara khusus, Enterococcus dan Lactococcus
adalah 2 genus paling banyak yang ditemukan dalam produk susu. Proporsi Enterococcus dalam
sampel susu formula berkisar antara 1,5 hingga 80%. Dua anggota genus ini, Enterococcus
casseliflavus (14,9%) dan Enterococcus gallinarum (9,7%) adalah yang paling umum dalam
sampel susu bubuk (Gambar 4). Spesies milik Thermus thermophilus, Streptococcus salivarius,
Sporosarcina newyorkensis, dan Bacillus cereus ditemukan di semua sampel dengan persentase
yang sama. Selain itu, 6 lainnya (termasuk Lactococcus piscium, Solibacillus silvestris,
Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii, Enterococcus durian, dan Propionibacterium
acnes) dari 334 Spesies yang teridentifikasi terdeteksi pada sampel yang memiliki persentase
lebih tinggi dari 1%.

3.3 Perbandingan Profil Bakteri Antara Produk Susu yang Berbeda

Untuk mengevaluasi perbedaan struktural dari profil bakteri di berbagai produk susu, titik
analisis utama berdasarkan pembobotan dan tak tertimbang serta dilakukan Jarak UniFrac. Skor
plot dihasilkan dengan komponen utama 1 dan 2 tidak terlihat pola pengelompokan yang jelas
berdasarkan pada produk susu dengan jenis sampel yang. Namun, kelompok yang berbeda
diidentifikasi dengan merencanakan dengan komponen utama 3 dan 4 (Gambar 5), masing-
masing, perhitungan untuk 24,91 dan 14,36% dari total varian. Hasil ini menunjukkan adanya
beberapa komponen bakteri perwakilan di setiap jenis sampel.

4. Diskusi
Susu adalah sumber makanan yang berharga yang dapat memenuhi permintaan gizi yang
terus meningkat di dunia. Adanya kontaminasi dalam produk ini memberikan ancaman
kesehatan masyarakat yang sangat serius dan dapat mengganggu kualitas makanan. Dengan
demikian, sangat penting untuk mengembangkan metode yang akurat dan cepat untuk
mengevaluasi kontaminasi bakteri dalam produk susu. Meskipun beberapa teknik deteksi
molekuler telah banyak mengalami peningkatan dari metode tradisional, akan tetapi metode saat
ini untuk menilai kontaminasi pada susu tampaknya tidak memuaskan.
Studi ini melaporkan untuk pertama kalinya kelayakan menggunakan teknologi
sekuensing PacBio SMRT terbaru untuk menggambarkan profil kontaminasi bakteri dari produk
susu berdasarkan gen 16S rRNA. Teknologi PacBio SMRT lebih menguntungkan daripada
pendekatan sekuens lainnya.
 Diatas adalah Kurva indeks keanekaragaman yang memperkirakan keragaman mikroba
dari produk susu.
Karena rasanya lembut, nyaman, murah dan kualitas gizi yang tinggi, popularitas susu
mentah tumbuh di kalangan orang dewasa. Di Eropa dan Amerika Serikat, thermophilic
Campylobacter spp., Escherichia coli shigatoxic, Salmo-nella spp., dan Staphylococcus aureus
adalah 4 bakteri patogen utama yang sering dikaitkan dengan wabah yang ditularkan melalui
air susu. Selain itu, Listeria monocytogenes dan Yersinia enterocolitica telah dilaporkan dalam
sampel susu sapi mentah dari Finlandia. Bakteri patogen ini belum terdeteksi di salah satu
sampel dalam penelitian ini . Sebaliknya, 2 spesies, L. piscium dan S. silvestris, ditemukan
mendominasi mikroflora dalam susu mentah sampel.
Susu dengan suhu sangat tinggi merupakan produk susu populer lainnya yang
dikonsumsi oleh orang dewasa. Perlakuan memberikan suhu tinggi selama produksi susu UHT
adalah langkah pemrosesan langsung yang membantu membunuh bakteri yang ada dalam susu
mentah dan dengan demikian, memperpanjang masa penyimpanan produk. Namun, proses
seperti itu tidak menjamin bahwa susu benar-benar bebas dari kontaminasi bakteri. Kedua
bakteri termofil dan mesofil adalah bakteri yang lazim ditemukan dalam susu UHT. Bakteri
termofilik (misalnya, anggota genus Bacillus) dapat tumbuh pada suhu tinggi. Meskipun
sebagian besar bakteri ini jarang menyebabkan masalah yang mengancam jiwa atau kesehatan,
akan tetapi mereka dapat mempengaruhi kualitas produk makanan secara merugikan.
 Gambar diatas merupakan gambar plot kotak dari kelimpahan relatif bakteri yang
terdeteksi dalam produk susu pada tingkat filum. Titik-titik yang diisi mewakili outlier; titik
terbuka merupakan contoh spesifik.
Di antara 3 jenis produk yang diuji, susu formula bayi telah mendapat perhatian terbesar
di Cina, mungkin karena meningkatnya kesadaran masyarakat akan keamanan makanan dan
tingginya kerentanan bayi terhadap penyakit yang ditularkan melalui makanan. Mirip dengan
susu mentah, bakteri kontaminan patogen tertentu dalam susu formula adalah agen penyebab
infeksi manusia.
Selain itu, keberadaan spesies yang resisten terhadap antibiotik dalam susu formula
bayi telah menimbulkan kekhawatiran serius. Telah disarankan bahwa adopsi yang luas dari
pengobatan antibiotik terhadap penyakit sapi telah menyebabkan beberapa bakteri resisten
antibiotik. Masalah resistensi antibiotik telah meningkat menjadi krisis klinis dan kesehatan
masyarakat yang utama, karena beberapa antibiotik ampuh kehilangan efektivitasnya pada
tingkat yang mengkhawatirkan.

5. Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kontaminasi mikroba produk susu dideteksi menggunakan sistem
sekuensing PacBio SMRT dengan menghasilkan pembacaan long sequence. Hasil yang di dapat
telah menunjukkan bahwa teknik sekuensing ini dapat memberikan klasifikasi taksonomi yang
akurat untuk ketepatan genus dan tingkat spesies, dan dengan demikian sebagian besar
meningkatkan kapasitas dalam membedakan antara kontaminasi bakteri. Namun, karena jumlah
sampel yang rendah yang digunakan dalam penelitian ini, diperlukan kerja yang lebih mendalam
untuk menetapkan seperangkat pedoman yang lebih lengkap untuk penerapannya di masa
mendatang dalam pengendalian mutu susu selama produksi industri.