HPLC-MSn Analisis fenolik Senyawa dan Purin Alkaloid di Green dan Black Tea

D
ANIELE
D
EL
R
IO,
†, ‡ A
MANDA
J. S
TEWART,
†W
ILLIAM
M
Ullen,
†J
ENNIFER
B
guci,
†, § M
ichael
EJ L
EAN
,§F
URIO
B
RIGHENTI
,‡
DAN
LAN
C
ROZIER
*, † Produk Tanaman dan Kelompok Gizi Manusia, Divisi Biokimia dan Biologi Molekuler, Institut
Biomedis dan Ilmu Kehidupan, Universitas Glasgow, Gedung Graham Kerr, Glasgow G12 8QQ
, Inggris, Unit Nutrisi Manusia, Departemen Kesehatan Masyarakat, Universitas Parma, Via
Volturno 39, 43100 Parma, Italia, dan Bagian Nutrisi Manusia, Divisi Kedokteran
Perkembangan, Universitas Glasgow, Glasgow Royal Infirmary, Gedung Queen Elizabeth,
Glasgow G31 2ER, United Kingdom
Tea adalah campuran kompleks yang mengandung berbagai senyawa dari phenolic sederhana
hingga thearubigins yang kompleks, banyak di antaranya memiliki sifat antioksidan yang
terkenal. Makalah ini menjelaskan penerapan metode spektrometri kromatografirmass kinerja
tinggi (HPLC-MSn) untuk analisis cepat dan rutin lebih dari 30 phenolic dalam teh. Infus teh
hijau dan hitam disuntikkan langsung ke kolom HPLC fase terbalik, dan fenolik dielusi
menggunakan dua gradien fase bergerak yang berbeda, yang dioptimalkan untuk
menyelesaikan turunan katekin dan yang lainnya, flavonol dan theaflavin. Senyawa,
diidentifikasi berdasarkan waktu retensi mereka, spektrum absorbansi, dan pola fragmentasi
MS, termasuk (+) - catechin, (r) -epicatechin, theaflavin dan berbagai turunan gallate mereka,
quercetin dan kaempferol mono-, di-, dan triglycosides , ester asam quinic asam galat dan
hidroksisinnamat, dan alkaloid purin, kafein dan theobromin.
KATA KUNCI: Camellia sinensis; teh hijau; teh hitam; Analisis HPLC-MSn; katekin; theaflavin;
flavonol; gallate; turunan asam quinic dari hidroksisinnamat; alkaloid purin
1. PENGENALAN
Teh adalah salah satu minuman yang paling banyak dikonsumsi di dunia. Tumbuh di sekitar 30
negara di seluruh dunia, pabrik teh (Camellia sinensis L.) berasal dari SE Cina. Teh umumnya
dikonsumsi dalam satu dari tiga bentuk: hijau, oolong, atau hitam. Sekitar 3,0 juta metrik ton teh
kering diproduksi setiap tahun, 20% diantaranya adalah teh hijau, 2% adalah oolong, dan
sisanya adalah teh hitam (1). Meskipun diproduksi terutama dari C. sinensis dan Camellia
assamica dalam jumlah yang lebih kecil, masing-masing dari teh diproses secara berbeda dan
memiliki karakter yang unik, rasa, dan profil kimia. Untuk menghasilkan teh hijau, setelah daun
dipetik, daun muda digulung dan dikukus untuk meminimalkan oksidasi. Dalam produksi teh
hitam, setelah daun digulung, yang mengganggu kompartemasi seluler dan membawa senyawa
fenolik ke dalam kontak dengan oksidase polifenol, daun C. sinensis muda mengalami oksidasi
selama 90r120 menit sebelum pengeringan. Selama periode ini, yang disebut sebagai
fermentasi (meskipun jelas berbeda dari fermentasi alkohol beralkohol-ragi), flavan-3-ols diubah
menjadi produk kondensasi kompleks, theaflavins dan,
polimernyathearubigins. Teh oolong, yang diproduksi terutama di Taiwan dan diekspor ke
Jepang dan Jerman, diproduksi dengan periode fermentasi lebih pendek dari teh hitam dan
dikatakan memiliki rasa dan warna di suatu tempat antara teh hijau dan hitam (2). Fenolat
utama yang ada dalam teh adalah flavan-3-ols dan flavonol. Flavan-3-ols utama dalam teh hijau
adalah (r) -epicatechin dan turunan gallate. Senyawa-senyawa ini hadir dalam jumlah yang
lebih rendah dalam teh hitam yang digantikan oleh theaflavins dan thearoundins (3, 4). Flavonol
utama dalam teh adalah konjugasi quercetin dan kaempferol dengan tingkat rendah myricetin
dan bagian konjugasi bervariasi dari mono- ke di- dan triglycosides (5r8). Senyawa terkait
lainnya yang ditemukan dalam teh adalah asam galat, quinic ester dari asam gallic, coumaric,
dan caffeic bersama dengan alkaloid purin, theobromine dan kafein (Skema 1) (9, 10),
proanthocyanidins (11, 12), dan tingkat jejak flavones (13).
Analisis senyawa ini biasanya melibatkan penggunaan berbagai sistem kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC) dengan absorbansi atau deteksi dioda array dengan setiap sistem yang
dirancang untuk pemisahan hanya sejumlah komponen fenolik dalam teh (3, 14r19 ). Ada
beberapa
* Kepada siapa korespondensi harus ditangani. Tel: + 44-141-330- 4613. Faks: +
44-141-330-5394. E-mail: a.crozier@bio.gla.ac.uk.
studi di mana baik flavan-3-ols dan profil flavonol dalam teh telah diperiksa secara simultan dan
mendalam (20). † Divisi Biokimia dan Biologi Molekuler, Universitas Glasgow.
‡ Departemen Kesehatan Masyarakat, Universitas Parma. § Divisi Kedokteran Perkembangan,
Universitas Glasgow.
Makalah ini menjelaskan dua resolusi tinggi, gradien elusi mundur-fase sistem HPLC untuk
pemisahan lebih dari 30 flavonol, flavan-3-ols, dan senyawa terkait dalamhijau dan
tehhitam, dan identifikasi mereka dengan deteksi dioda array dan spektrometri massa
electrospray ( MS) menggunakan instrumen perangkap ion dengan fasilitas MSN.
2. MATERI DAN METODE
2.1. Material. Tetley GB Ltd. (Greenford, Middlesex, UK) mensuplai sampel teh hijau dan hitam
Indonesia. (+) - Catechin, (r) - gallocatechin, (r) -epicatechin, (r) -epicatechin gallate, (r)
-epigallo- catechin, (r) -epigallocatechin gallate, asam galat, kafein, theobromine, quercetin-3
-glucoside, quercetin-3-rutinoside, dan FolinrCiocalteu phenol reagent dipasok oleh Sigma
(Poole, Dorset, UK).hitam
Skema1. Struktur Fenolat Utama dan Alkaloid Purin yang ditemukan dalamTeh yang
ekstrak tehmengandung campuran theaflavin, theaflavin-3-gallate, theaflavin-3′-gallate, dan
theaflavin-3,3′-digallate juga diperoleh dari Sigma. Quercetin-3-arabinoside,
quercetin-3-galactoside, kaempferol-3-glucoside, kaempferol-3-rutinoside, dan 5-caffeoylquinic
acid (asam chlo- rogenic) dipasok oleh AABB Chemicals (Southampton, UK). Pelarut HPLC
diperoleh dari Rathburn Chemicals (Walkerburn, Skotlandia).
2.2. Persiapan Teas. Larutan stok infus teh disiapkan dengan menambahkan 18 mL air
mendidih ke 1 g daun. Setelah 3 menit, minuman disaring untuk menghilangkan partikel
sebelum analisis filtrat.
2.3. LC-Diode Array dan Analisis MSn. Analisis awal sampel teh menyoroti kebutuhan untuk
menggunakan dua metode HPLC terpisah untuk memisahkan pertama senyawa yang
diturunkan dari katekin dan kedua flavonol dan theaflavin. Meskipun ini meningkatkan waktu
analisis, itu sangat meningkatkan resolusi kromatografi dari senyawa yang diteliti.
Teh infus dianalisis menggunakan sistem gradien HPLC Surveyor terdiri dari pompa HPLC,
detektor dioda array absorbansi, pemindaian 250-700 nm, dan autosampler didinginkan hingga
4 ° C (Thermo Finnigan, San Jose, CA). Pemisahan dilakukan dengan menggunakan
Phenomenex RP-MAX 4 μm 250 mm x 4,6 mm C
12
kolom kebalikan fase(Torrance, CA) dipertahankan pada 40 ° C, dielusi pada 1 mL minr1
dengan 60 menit gradien baik 4r25% ( analisis katekin dan hidroksisinnamat) atau gradien
10r30% (pemisahan flavonol dan theaflavin) dari asetonitril dalam air yang mengandung 1%
asam format. Setelah campuran dilewatkan melalui sel aliran dari absorbansi monitor, kolom
eluat dipisahkan dan 20% diarahkan ke spektrometer massa Finnigan LCQ Decca dengan
antarmuka electrospray (ESI), beroperasi dalam mode MS pemindaian penuh dari 150 hingga
2000 amu . Sampel dianalisis menggunakan kedua mode ionisasi negatif dan positif. Parameter
ESI-MS adalah sebagai berikut: potensi sumber ESI, 4 kV; suhu kapiler, 400 ° C.
Asam galat, (r) -gallocatechin, (r) -epigallocatechin, (r) -epigallo- catechin gallate, (r)
-epicatechin gallate, (+) - catechin, (r) -epicatechin, theaflavins, 5-caffeoylquinic acid,
quercetin-3-glukosida, rutin, kaempferol-3-glukosida, kafein, dan theobromine semua dihitung
dengan mengacu pada kurva kalibrasi standar yang diperoleh dengan deteksi dioda array pada
λ
maks
nilai. Standar tidak tersedia dalam semua contoh sehingga asam 3-galoylquinic dikuantifikasi
dalam setara asam galat, asam 4-p-cooy- roylquinic dan asam 3-caffeoylquinic (asam
neochlorogenic) dalam 5-caffeoylquinic setara asam, dan theaflavin di (r). ) -epicatechin
Gambar 1. Senyawa fenolik dan alkaloid purin utama dalam aliquot (A) teh hijau (5 μL) dan (B)
teh hitam (10 μL) dianalisis pada 250 mm x 4,6 mm id Sinergie RP Max 80 kolom dielusi
dengan 60 menit gradien 4−25% asetonitril dalam 1% asam format berair pada laju alir 1 mL
minr1 dan dipantau pada 280 nm. Identifikasi puncak: 1, asam galat; 2, asam 5-galloylquinic; 3,
(-) - gallocatechin; 4, theobromine; 5, asam 3-caffeoylquinic; 6, (-) - epigallocatechin; 7, (+) -
catechin; 8, asam 5-caffeoylquinic; 9, kafein; 10, (-) - epicatechin; 11, (-) - epigallocatechin
gallate; 12, asam 4-p-coumaroylquinic; dan 13, (-) - epicatechin gallate.
setara. Semua senyawa yang diturunkan dari quercetin, kecuali rutin, dikuantifikasi dalam
quercetin-3-glukosida, dan semua senyawa berbasis kaempferol dikuantifikasi dengan referensi
kaempferol-3-glukosida.
2.4. Pengukuran Total Polifenol dan Thearubigins. Untuk mengukur total polifenol dalam infus
teh hitam, metode Folinr Ciocalteu diterapkan dan data dinyatakan dalam setara asam galat
(21). Tingkat Thearubigin diperkirakan dengan menambahkan tingkat keseluruhan fenolat
individu ditentukan oleh HPLC dan mengurangkan angka ini dari perkiraan total polifenol yang
diperoleh dengan uji FolinrCiocalteu (9).
3. HASIL DAN DISKUSI
3.1. Profil fenolik dari Teh. Dua sistem elusi gradien digunakan untuk analisis HPLC fase balik
fenolat dalam infus teh. Meskipun sebagian besar studi yang dilaporkan dalam literatur
menggunakan gradien panjang tunggal, pendekatan ini dapat menghasilkan resolusi yang tidak
lengkap dari beberapa komponen fenolik dengan puncak kecil yang sering ditutupi oleh
komponen yang lebih menonjol yang mengelupas di dekatnya. Untuk memecahkan masalah ini,
dua 60 menit gradien digunakan sebagai berikut: gradien asetonitril 4r25% dioptimalkan untuk
katekin terpisah, gallocatechins, dan ester gallate, dan gradien asetonitril 10r30% yang
dirancang untuk menyelesaikan konjugat flavonol dan theaflavin. Jejak serapan HPLC diperoleh
ketika gradien ini digunakan untuk menganalisis teh hijau dan hitam diilustrasikan pada Gambar
1 dan 2.
3.2. Identifikasi Fenoloid Utama dan Alkaloid Purin dalam Teh Hijau dan Hitam. Senyawa
fenolik
dalam teh hijau dan hitam diidentifikasi berdasarkan waktu retensi mereka, spektrum
absorbansi, dan pola fragmentasi MS dan, bila memungkinkan, dengan cochromatography
dengan standar otentik. Perlu dicatat bahwa sejumlah fenolat yang ditemukan dalam teh tidak
tersedia dalam bentuk yang dimurnikan. Namun, dalam banyak kasus, senyawa dapat
diidentifikasi berdasarkan data fragmentasi MS digabungkan dengan karakterisasi dalam studi
yang diterbitkan sebelumnya (3, 6, 7, 22).
Puncak 1r13 dipisahkan pada gradien asetonitril 4r25% (lihat Gambar 1A, B). Spektrometri
massa digunakan ionisasi negatif, seperti ditunjukkan di bawah ini, dengan pengecualian
puncak 4 dan 9
Gambar 2. Konjugat flavonol utama dan theaflavin dalam alikuot (A) teh hijau (10 μL) dan (B)
teh hitam (10 μL) dianalisis pada 250 mm x 4,6 mm id Sinergie RP Max 80 kolom dielusi
dengan 60 menit gradien 10−30% asetonitril dalam 1% asam format berair pada laju alir 1 mL
minr1 dan dipantau pada 365 nm. Penyisipan mengilustrasikan absorbansi pada 280 nm.
Identifikasi puncak: 14, quercetin-rhamnosylgalactoside; 15, quercetin-3-rutinoside; 16,
quercetin-3-galactoside; 17, quercetin-rhamnose-hexose-rhamnose; 18, quercetin-3-glukosida;
19, kaempferol-rhamnose-hexose-rhamnose; 20, kaempferol galactoside; 21,
kaempferol-3-rutinoside; 22, kaempferol-3-glukosida; 23, konjugasi kaempferol pentosa; 24,
theaflavin; 25 dan 26, konjugat kuersetin tidak diketahui; 27, theaflavin-3-gallate; 28, konjugat
kaempferol tidak dikenal; 29, theaflavin-3′-gallate; 30, theaflavin-3,3′-digallate; dan 31, konjugat
kaempferol tidak dikenal.
Tabel 1. Waktu Retensi, Karakteristik Spektrum Massa, dan Identitas Flavan-3-ols,
Hidroksisinammat, dan Alkaloid Purin Hadir dalam senyawaTeha
puncak
R
(menit) [M - H] r (m / z) MS2 (m / z) )
1 5.8 asam galat 169 125 2 6.2 5-galloylquinic acid 343 191 (asam quinic; [M - H] r-galloyl), 169
3 9.4 (-) - gallocatechin 305 261, 221, 219, 179 4 10.7 theobromine 181b 5 13.2 Asam
3-caffeoylquinic 353 191 (asam quinic; [M - H] r-caffeoyl), 179 6 15.9 (-) - epigallocatechin 305
261, 221, 219, 179 7 18.4 (+) - catechin 289 245, 205 8 21.3 5-caffeoylquinic acid 353 191
(quinic acid; [M - H] r-caffeoyl) 9 22.1 caffeine 195b 10 25.5 (-) - epicatechin 289 245, 205, 179
11 26.8 (-) - epigallocatechin-3-gallate 457 331, 305, 169 12 27,6 4-p-coumaroylquinic acid 337
173 (asam quinic; [M - H] r-coumaroyl) 13 38.8 (-) - epicatechin-3-gallate 441 331, 289, 169
nomor Peak dan waktu retensi merujuk untuk Gambar 1. b [M + H] +.
di mana spektrum yang lebih baik diperoleh dengan ionisasi positif. Data MS yang diperoleh
dengan senyawa individu dirangkum dalam Tabel 1. Puncak 1 (t
R
, 5,8 menit; λ
maks
, 277 nm) dikromatografi dengan asam galat dan memiliki spektrum absorbansi yang sama.
Identifikasi ini dikonfirmasi oleh analisis MS-MS yang mengungkapkan adanya ion molekul
bermuatan negatif ([M r H] r) pada m / z 169, yang terfragmentasi untuk menghasilkan ion
fragmen sekunder (MS2) pada m / z 125 ( lihat Tabel 1).
Peak 2 (t
R
, 6,2 mnt; λ
max
, 271 nm) diidentifikasi sebagai 5-galloylquinic acid (theogallin), yang sebelumnya telah
dikarakterisasi dan dideteksi dalam jumlah yang signifikan dalam teh hijau (15, 23). Standar
otentik tidak tersedia; Namun, analisis MS puncak menunjukkan ion [M r H] r pada m / z 343
yang terfragmentasi untuk menghasilkan spektrum MS2 dengan ion pada m / z 191, amu dari
asam quinic, dan m / z 169, yang sesuai dengan asam galat.
Puncak 3 (t
R
, 9,4 menit; λ
maks
, 270 nm) diidentifikasi sebagai (r) - gallocatechin atas dasar waktu retensi, perbandingan
dengan standar otentik, dan [M r H] r pada m / z 305, yang menghasilkan fragmen MS2 besar
pada m / z 261 dan fragmen minor lebih lanjut pada m / z 221, 219, dan 179.
Puncak 4 (t
R
, 10.7 menit; λ
maks
, 272 nm) memiliki [M + H] + pada m / z 181 dan atas dasar spektrum massa, spektrum
absorbansi, dan cochromatography diidentifikasi sebagai alkaloid purin, theobromine. Puncak 5
(t
R
, 13,2 menit; λ
maks
, 325 nm) menghasilkan [M r H] r pada m / z 353 dan MS2 ion pada m / z 191 dan 179, yang
sesuai dengan keberadaan 3-caffeoylquinic asam seperti yang dijelaskan oleh Clifford et al.
(22).
Puncak 6 (t
R
, 15,9 menit; λ
maks
, 270 nm) diidentifikasi sebagai (r) - epigallocatechin atas dasar cochromatography dengan
standar otentik dan spektrum massa dengan [M r H] r pada m / z 305 dan MS2 fragmen pada m
/ z 261, 221, 219, dan 179.
Puncak 7 (t
R
, 18,4 menit; λ
maks
, 279 nm) diidentifikasi sebagai (+) - katekin dengan perbandingan spektrum absorbansi dan
waktu retensi dengan standar yang otentik. Ini dikonfirmasi oleh MS-MS, yang menghasilkan [M
r H] r pada m / z 289 dan ion MS2 yang menonjol pada m / z 245 dan fragmen minor pada m / z
205.
Peak 8 (t
R
, 21.3 min; λ
max
, 325 nm) cochromatographed dengan 5-caffeoylquinic acid. Ini juga memiliki absorbansi dan
spektrum massa yang sama ([M r H] r pada m / z 353 dan satu fragmen MS2 utama pada m / z
191) sebagai asam 5-caffeoylquinic, yang sebelumnya telah terdeteksi dalam teh hitam (9) .
Dalam sistem HPLC digunakan, 4-caf- feoylquinic acid elutes ca. 45 detik setelah asam
5-caffeoylquinic, biasanya dengan resolusi awal. Kedua isomer dapat, oleh karena itu,
dibedakan secara kromatografi serta oleh MS sebagai ion MS2 utama yang berasal dari asam
4-caffeoylquinic pada m / z 179 sementara fragmen yang sesuai dari asam 5-caffeoylquinic
pada m / z 191 (22) .
Puncak 9 (t
R
, 22,1 menit; λ
maks
, 268 nm) adalah kafein. Ini cochromatographed dengan alkaloid purin dan memilikisama
Tabel yang2. Kali Retensi, Karakteristik Spektrum Massa, dan Identitas Flavonol dan
Theaflavins Hadir dalamTeha
puncakt
R
(min) senyawa [M - H] r (m / z) MSn (m) / z)
14 25,9 quercetin-rhamnosylgalactoside 609 301 (Q; [M - H] r-Gal-Rham) 15 27,0
quercetin-3-rutinoside 609 301 (Q; [M - H] r-Glc-Rham) 16 27,6 quercetin -3-galactoside 463
301 (Q; [M - H] r-Gal) 17 28,1 quercetin-rhamnose-hexose-rhamnose 755 609 ([M - H] r-Rham),
301 (Q; [M - H] r -Rham-Hex-Rham) 18 28,6 quercetin-3-glukosida 463 301 (Q; [M - H] r-Glc) 19
30,9 kaempferol-rhamnose-hexose-rhamnose 739 593 ([M - H] r-Rham), 431 ([M - H]
r-Rham-Hex), 285 (K; [M - H] r-Rham-Hex-Rham) 20 32,5 kaempferol-galactoside 447 285 (K;
[M - H] r-Gal) 21 33,0 kaempferol-3-rutinoside 593 285 (K; [M - H] r-Glc-Rham) 22 34,7
kaempferol-3-glukosida 447 285 (K; [M - H] r-Glc) 23 39,6 kaempferol pentose konjugasi 417
285 (K; [M - H] r-Pen) 24 49.0 theaflavin 563 25 50,3 u konjugat kuersetin tidak dikenal 901 755
([M - H] r - 146), 609 ([M - H] r - 146 - 146), 301 (Q; [M - H] r - 146 - 146 - 308) 26 51,7 quergetin
konjugasi tidak diketahui 901 755 ([M - H] r - 146), 609 ([M - H] r - 146 - 146),H]
463 ([M -H] r - 146 - 146 - 146), 301 (Q; [M - H] r - 146 - 146 - 308) 27 52,5 theaflavin-3-gallate
715 28 54,5 tidak diketahui kaempferol konjugasi 885 739 ([M - H] r - 146), 593 ([M - H] r - 146 -
146), 285 (K; [M - H] r - 146 - 146 - 308) 29 54.7 theaflavin-3′-gallate 715 30 55,5 theaflavin-3,
3′-gallate 867 31 58,4 tidak diketahui kaempferol konjugat 885 739 ([M - H] r - 146), 593 ([M - H]
r - 146 - 146), 285 (K; [M - H] r - 146 - 146 - 308)
nomor Peak dan waktu retensi mengacu pada Gambar 2. Q, quercetin; K, kaempferol; Ara,
arabinosyl; Gal, galactosyl; Glc, glukosil; Hex, hexosyl; Pena, pentosil; dan Rham, rhamnosil.
spektrum absorbansi dan spektrum massa ion positif yang identik ([M + H] + pada m / z 195).
Puncak 10 (t
R
, 25,5 menit; λ
maks
, 278 nm) diidentifikasi sebagai (r) - epikatekin berdasarkan spektrum absorbansi, waktu retensi,
dan pola fragmentasi MS-MS ([M r H] r pada m / z 289 dan fragmen MS2 utama pada m / z 245
dengan ion lebih lanjut pada m / z 205).
Peak 11 (t
R
, 26.8 min; λ
max
, 273 nm) memiliki spektrum absorbansi yang sama dan cochromatographed dengan (r)
-epigallocatechin-3- gallate. Kehadiran flavan-3-ol dikonfirmasi oleh MS-MS, yang
menghasilkan [M r H] r pada fragmen m / z 457 dan MS2 pada m / z 331, 305, dan 169.
Puncak 12 (t
R
, 27,6 menit; λ
maks
, 311 nm) memiliki spektrum absorbansi yang sama tetapi waktu retensi HPLC berbeda ke
asam p-coumaric. Analisis MS menghasilkan [M r H] r pada m / z 337 dan ion MS2 yang
menonjol pada m / z 173, yang, sesuai dengan Clifford et al. (22), cocok dengan spektrum
massa asam 4-p-coumaroylquinic, komponen teh hitam yang dikenal (9).
Puncak 13 (t
R
, 38,8 menit; λ
maks
, 275 nm) diidentifikasi sebagai (r) - epicatechin-3-gallate atas dasar perbandingan spektrum
absorbansi, waktu retensi, dan fragmentasi MS-MS ([M r H] r pada m / z 441 dan fragmen MS2
utama pada m / z 331, 289, dan 169) dengan yang memiliki standar otentik.
Menggunakan 60 menit, 10r30% gradien asetonitril, fase terbalik HPLC memisahkan puncak
14r28 seperti yang diilustrasikan pada Gambar 2A, B. Ringkasan waktu retensi HPLC, λ
maks
, dan spektra MS-MS disajikan pada Tabel 2. Dasar dari identifikasi adalah sebagai berikut.
Puncak 14 dan 15 (t
R
, 25,9 dan 27,0 menit; λ
maks
, 353 nm) diidentifikasi sebagai quercetin-hexose-rhamnose berdasarkan MS-MS dan waktu
retensi. The [M r H] r dalam setiap kasus adalah m / z 609, yang menghasilkan fragmen MS2 di
m / z 301, [M r H] r dari quercetin aglycone. Hilangnya m / z 308 ini berhubungan dengan
pembelahan gula rhamnose-hexose. Kurangnya quercetin-hexose atau quercetin-rhamnose ion
menengah menunjukkan bahwa gula yang dibelah adalah fragmen rutin rutin sebagai bagian
rhamnose-glukosa tidak terpecah menjadi gula konstitutifnya. Kedua puncak memiliki spektra
MS yang sama, dan kemungkinan dari perilaku kromatografi bahwa puncak eluting sebelumnya
14 adalah quercetin-rhamnosylgalactoside dan puncak terakhir 15 adalah
quercetin-rhamnosylglucoside. Identitas puncak 15 kemudian
dikonfirmasi sebagai quercetin-3-rhamnosylglucoside (quercetin-3-rutinoside, alias rutin)
dengan mengacu pada standar otentik.
Puncak 16 dan 18 (t
R
, 27,6 dan 28,6 menit; λ
maks
, 353 nm) diidentifikasi sebagai konjugasi kuersetin-heksosa berdasarkan urutan elusi dan
MS-MS. Kedua puncak menghasilkan [M - H] - pada m / z 463, yang menghasilkan ion MS2
utama pada m / z 301. Ini berhubungan dengan quercetin dengan hilangnya gugus heksose.
Seperti dengan puncak 14 dan 15, puncak 16 dan 18 memiliki spektrum massa yang identik
dan cenderung menjadi quercetin galactoside dan glukosida quercetin, masing-masing.
Berdasarkan kromatografi dengan senyawa referensi dan spektra MS-MS yang identik, puncak
18 diidentifikasi sebagai quercetin-3-glukosida dan puncak 16, yang merupakan komponen
minor, adalah quercetin-3-galactoside. Kedua flavonol ini dikenal sebagai komponen teh hitam
(6, 8).
Puncak 17 (t
R
, 28,1 menit; λ
maks
, 343 nm) diidentifikasi sebagai quercetin-rhamnose-hexose-rhamnose atas dasar MS-MS.
Analisis mengungkapkan [M - H] - pada m / z 755, yang terfragmentasi untuk menghasilkan ion
MS2 utama pada m / z 609. Ini kerugian 146 amu sama dengan pembelahan unit rhamnosil.
Sebagaimana dibahas di atas untuk puncak 14 dan 15, sebuah fragmen ion pada m / z 609
sesuai dengan konjugasi kuersetin-rhamnosa-heksosa. Analisis MS3 lebih lanjut dari MS2 m / z
609 menghasilkan ion pada m / z 301, sesuai dengan quercetin. Umumnya, dalam fase HPLC
terbalik, semakin banyak gugus gula yang melekat pada aglikon flavonoid, semakin awal waktu
retensi. Namun, urutan elusi anthocyanin menunjukkan bahwa penambahan rhamnose ke
bagian glukosil dapat menyebabkan antosianin terelusi lebih lambat daripada sebelumnya (24).
Posisi gula konjugasi juga dapat memiliki efek yang ditandai seperti pada sistem fase terbalik
yang digunakan dalam penelitian ini quercetin-4′-glukosida jauh lebih dipertahankan daripada
quercetin-3-glukosida.
Perlu dicatat bahwa puncak 17 bukanlah quercetin-3- glucosylrhamnosylglucoside yang
sebelumnya diidentifikasi dalam teh oleh Finger dkk. (8) karena quercetin trisaccharide ini akan
menghasilkan [M - H] - pada m / z 787 bukan m / z 755. Juga bukan puncak ini
quercetin-rhamnose-rhamnose-glucoside yang diidentifikasi oleh Englehardt et al. (25) seperti
yang ditunjukkan oleh m / z 146 kehilangan rhamnose meninggalkan ion fragmen pada m / z
609 (quercetin-rhamnose-glukosa).
Puncak 19 (t
R
, 30,9; λ
maks
, 342 nm) diidentifikasi sebagai konjugat kaempferol-rhamnose-hexose-rhamnose atas dasar
spektrum MS-MS. The [M - H] - di m / z 739 terionisasi untuk menghasilkan fragmen MS2
utama pada m / z 593. Kehilangan 146 amu ini sesuai dengan pembelahan unit rhamnosil.
Fragmentasi lebih lanjut dari ion m / z 593 menghasilkan ion MS3 utama pada m / z 431 dan
285, yang sesuai dengan kaempferol rhamnoside (kehilangan 162 amu) dan kaempferol
(kehilangan 308 amu yang berhubungan dengan pembelahan suatu rhamnose-hexose moiety),
masing-masing. Ini trisaccharide kaempferol memiliki berat molekul 32 amu lebih rendah dari
kaempferol-3-glucosylrhamnosylglucoside, yang telah terdeteksi dalam teh hitam oleh Finger et
al. (8). Demikian pula, meskipun [M - H] - di m / z 739 adalah sama seperti yang akan diperoleh
dengan kaempferol-rhamnose-rhamnose-galactoside dan
kaempferol-rhamnose-rhamnose-glucoside yang diidentifikasi dalam teh oleh Engelhardt et al.
(25), kehilangan awal kelompok rhamnosil selama fragmentasi mengungkapkan urutan
keterikatan moieties gula konjugasi menjadi berbeda.
Puncak 20 (t
R
, 32,5 menit; λ
maks
, 345 nm) diidentifikasi sebagai kaempferol galactoside. Ion pada m / z 447 sesuai dengan [M -
H] - konjugat kaempferol-heksosa, dan fragmen MS2 yang dihasilkan pada m / z 285 ([M - H] - -
162) adalah kaempferol. Puncak 22, yang merupakan kaempferol-3-glukosida, memiliki
spektrum MS yang sama sehingga kemungkinan puncak 20 mengandung
kaempferol-galactoside. Galaktosida elas lebih awal darisesuai
glukosida yang, dan galaktosida kaempferol telah terdeteksi pada infus teh hitam oleh Price et
al. (6).
Puncak 21 (t
R
, 33,0 menit; λ
maks
, 345 nm) diidentifikasi sebagai kaempferol rutinoside. [M - H] - m / z 593 menghasilkan fragmen
MS2 pada m / z 285 (kaempferol; M - 308, hilangnya hexose- rhamnose tanpa ion perantara
pada m / z 447). Sesuai dengan penugasan ini, cochromatography mengungkapkan bahwa
senyawa yang terlibat adalah kaempferol-3-rutinoside.
Puncak 22 (t
R
, 34,7 menit; λ
maks
, 343 nm) adalah kaempferol-3- glukosida berdasarkan spektrum MS-MS ([M - H] - pada m / z
447 dan fragmen MS2 utama pada m / z 285), spektrum absorbansi, dan cochromatography
dengan senyawa referensi.
Puncak 23 (t
R
, 39,6 menit; λ
maks
, 343 nm) adalah konjugat pentose kaempferol, atas dasar ion negatif MS-MS. [M - H] - pada m
/ z 417 menghasilkan ion MS2 utama pada m / z 285 (kaempferol) dengan M - 132 yang
menyamakan dengan hilangnya bagian pentosil.
Puncak 24, 27, 29, dan 30 (t
R
, 49,0, 52,5, 54,7, dan 55,5 menit; semua dengan λ
maks
, 270, 374, dan 453 nm) diidentifikasi sebagai theaflavin atas dasar MS-MS, urutan elusi , dan
cochro- matography dengan campuran standar yang mengandung theaflavin,
theaflavin-3-gallate, theaflavin-3′-gallate, dan theaflavin-3,3′-digallate. Empat theaflavin utama
dalam campuran uji elusi setelah konjugat flavonol utama dalam urutan berikut: theaflavin>
theaflavin-3-gallate> theaflavin-3′-gallate> theaflavin-3,3′-digallate (9, 18, 26). Keempat
senyawa ini semuanya memiliki spektrum absorbansi yang sama, yang tidak seperti spektrum
catechin atau flavonol. Puncak 24 menghasilkan [M - H] - pada m / z 563, yang sesuai dengan
theaflavin. [M - H] - dari puncak 27 dan 29 muncul pada m / z 715, 152 amu lebih tinggi dari
puncak 24. Peningkatan ini sesuai dengan penambahan unit galloyl. Atas dasar spektrum
massa dan urutan elusi, disimpulkan bahwa puncak 27 adalah theaflavin-3-gallate dan puncak
29 adalah theaflavin-3′-gallate. Kedua senyawa tersebut diketahui hadir dalam teh hitam (3, 9).
Puncak 30 diidentifikasi sebagai theaflavin-3,3′-digalate atas dasar [M - H] - pada m / z 867, 152
amu lebih tinggi dari [M - H] - dari puncak 27 dan 29, dan 304 amu lebih tinggi dari puncak 24.
Puncak 25, 26, 28, dan 31 (t
R
, 50,3, 51,7, 54,5, dan 58,4 menit) telah diidentifikasi. Puncak 25 dan 26 memiliki λ
maks
314 nm sementara puncak 28 dan 31 memiliki λ
maks
306 dan 310 nm, masing-masing. Puncak 25 dan 26 memiliki [M - H] - pada m / z 901, yang
menghasilkan berbagai kombinasi ion MS2 pada m / z 755, 609, dan 301 sesuai dengan
hilangnya dua fragmen 146 amu berturut-turut dan satu fragmen 308 amu . Hilangnya 146 dan
308 amu sesuai dengan pembelahan satu rhamnosil dan rutinosil moiety, masing-masing. Ion
fragmen pada m / z 301 sesuai dengan quercetin aglikon. Namun, waktu retensi yang lama dari
senyawa ini tidak sesuai dengan mereka yang quercetin tetraglycoside terkonjugasi dengan
satu disakarida dan dua monosakarida. Untuk mengkonfirmasi aglycone itu sebenarnya
quercetin, teh itu diinfuskan ke spektrometer massa dan MS4 dilakukan pada ion pada m / z
901. Hasil fragmentasi ion m / z 301 menegaskan bahwa aglycone adalah quercetin. Peaks 28
dan 31 memiliki [M - H] - di m / z 885 dan menghasilkan pola fragmentasi yang sama ke puncak
25 dan 26 (kehilangan 146-146-308 amu) sehingga menimbulkan ion basa pada m / z 285,
sesuai dengan kaempferol. Namun, seperti dengan senyawa berbasis quercetin, puncak 25 dan
26, waktu retensi HPLC panjang dari puncak 28 dan 31 akan muncul untuk menghalangi
kemungkinan mereka menjadi flavonol tetraglikosida, yang karena polaritasnya yang tinggi,
akan mengelupas pada titik yang jauh lebih awal. pada gradien fase kebalikan. Kemungkinan
alternatif adalah bahwa setidaknya satu dari kerugian 146 amu adalah karena pembelahan
p-coumaroyl daripada unit rhamnosyl (27). Penambahan bagian p-coumaroyl untuk
glukosida antosianin nyata meningkatkan retensi HPLC fase balik (24, 28). Telah dilaporkan
bahwa penambahan asam organik hidroksatomatis menghasilkan pergeseran karakteristik
dalam spektrum absorbansi ke arah 310 nm (29). Ini sesuai dengan λ
maks
dari puncak 28 dan 31, spektrum yang juga mempertahankan bahu pada ∼370 nm, karakteristik
aglikon flavonol. Namun, analisis yang lebih rinci diperlukan untuk menentukan identitas
konjugat p-coumaroyl-gula konjugasi quercetin dan kaempferol ini.
Meskipun 31 senyawa terdeteksi secara total, dapat dilihat bahwa tidak ada teh yang
mengandung kadar yang dapat dideteksi dari myricetin conju- gates. Hal ini sesuai dengan
temuan Price et al. (6) konjugat myricetin ditemukan pada konsentrasi yang relatif rendah pada
beberapa tetapi tidak semua teh. Proanthocyanidins (11, 12) dan flavones (13) juga tidak
terdeteksi dalam penelitian ini. Komponen-komponen ini relatif kecil dalam teh, dan deteksi
mereka biasanya hanya layak setelah pengayaan sampel.
3.3. Perbedaan Tingkat Phenolic dan Alkaloid Purin dalam Infus Teh Hijau dan Hitam. Selama
analisis HPLC, perkiraan kuantitatif dari masing-masing fenolat dan alkaloid purin dalam infus
teh hijau dan hitam diperoleh dari respon detektor dioda array sementara identitas puncak dan
kemurnian ditentukan oleh analisis MSn. Informasi yang diperoleh disajikan pada Tabel 3.
Meskipun teh yang dihasilkan dari pemetikan tunggal, kandungan kafein dan theobromin dari
teh hitam adalah 62 dan
Tabel 3. Konsentrasi Fenolat Utama dalamHitam dan Teh Hijau Infusionsa
senyawa(jumlah puncak) teh hijau teh hitam
kandungan teh hitam sebagai% dari kandungan teh hijau
asam galat (1) 6,0 ± 0,1 125 ± 7,5 2083 5-galloylquinic acid (2) 122 ± 1,4 148 ± 0,8 121 total
asam galat derivatif 128 273 213 (-) -gallocatechin (3) 383 ± 3.1 ND 0 (-) - epigallocatechin (6)
1565 ± 18 33 ± 0,8 2,1 (+) - catechin (7) 270 ± 9,5 12 ± 0,1 4,4 (-) - epicatechin (10) 738 ± 17 11
± 0,2 1,5 (-) - epigallocatechin gallate (11) 1255 ± 63 19 ± 0,0 1,5 (-) - epicatechin gallate (13)
361 ± 12 26 ± 0,1 7,2 total flavan-3-ols 4572 101 2,2 3-caffeoylquinic acid (5) 60 ± 0,2 10 ± 0,2
17 5-asam caffeoylquinic (8) 231 ± 1,0 62 ± 0,2 27 asam 4-p-coumaroylquinic (12) 160 ± 3,4
143 ± 0,2 89 total estetika quinit hidroksisinamatik 45 1 215 48 quercetin-rhamnosylgalactoside
(14) 15 ± 0,6 12 ± 0,2 80 quercetin-3-rutinoside (15) 131 ± 1,9 98 ± 1,4 75
quercetin-3-galactoside (16) 119 ± 0,9 75 ± 1,1 63 quercetin-rhamnose- hexose-rhamnose (17)
30 ± 0,4 25 ± 0,1 83 quercetin-3-glucoside (18) 185 ± 1,6 119 ± 0,1 64
kaempferol-rhamnose-hexose-rhamnose (19) 32 ± 0,2 30 ± 0,3 94 kaempferol-galactoside (20 )
42 ± 0,6 29 ± 0,1 69 kaempferol-rutinoside (21) 69 ± 1,4 60 ± 0,4 87 kaempferol-3-glukosida
(22) 102 ± 0,4 69 ± 0,968 kaempferol-arabinoside (23) 4,4 ± 0,3 ND 0 tidak diketahui quercetin
konjugasi (25) 4,0 ± 0,1 4,3 ± 0,5 108 quergetin konjugat yang tidak diketahui (26) 33 ± 0,1 24 ±
0,9 73 kaempferol konjugasi yang tidak diketahui (28) 9,5 ± 0,2 ND 0 konjugat kaempferol tidak
diketahui (31) 1,9 ± 0,0 1,4 ± 0,0 74 flavonol total 778 570 73 theaflavin (24) ND 64 ± 0,2
theaflavin-3-gallate (27) ND 63 ± 0,6 theaflavin-3′-gallate (29) ND 35 ± 0,8
theaflavin-3,3′-digallate (30) ND 62 ± 0,1 total theaflavins ND 224 theobromine (4) 57 ± 0.1 25 ±
0.6 44 caffeine (9) 866 ± 16 541 ± 2.9 62 total purine alkaloids 923 566 61
a Data expressed as mg L-1 ± standard error (n ) 3); ND, tidak terdeteksi.
44%, respectively, of the concentration in green tea. Gallic acid was present in black tea in ca.
20-fold higher amount than found in green tea while the 5-galloylquinic acid content was only
marginally higher. The combined level of the six flavan-3-ols in green tea was 4572 mg L-1
while only 101 mg L-1 was present in the black tea.
The green tea contained 60 ( 0.2 and 231 ( 1.0 mg L-1, respectively, of 3-caffeoylquinic acid
and 5-caffeoylquinic acid with the black tea infusion containing ca. 4-5-fold lower quantities. In
contrast, at 160 ( 3.4 and 143 ( 0.2 mg L-1, respectively, for the green and black teas, there was
little difference in the concentration of 4-p-coumaroylquinic acid.
A total of 14 flavonol glycosides were detected in varying concentrations in the two teas (Table
3). The parent flavonols were quercetin and kaempferol, which were conjugated to a range of
sugars including glucose, galactose, pentose, and rhamnose, as mono-, di-, and trisaccharides.
The overall level of flavonols in the black tea was 73% of that found in the green tea infusion,
indicating that flavonols survive fermentation far better than flavan-3-ols.
Green tea contained no theaflavin, theaflavin-3-gallate, theaflavin-3′-gallate, or
theaflavin-3,3′-digallate, but all four compounds were detected in black tea in concentrations
ranging from 35 to 64 mg L-1 (Table 3). The albeit approximate estimate of the thearubigin
content of black tea was 1681 mg L-1 of gallic acid equivalents indicating that during
fermentation
there is substantial condensation of flavan-3-ols yielding these high molecular weight
derivatives. The overall levels of the different flavonoid and phenolic groups in the green and
black tea are summarized in Figure 3.
The data obtained in the present study merit comparison with the results of Rechner et al. (20)
who quantified 20 phenolics in seven black teas using a single gradient HPLC method with
diode array detection. The illustrated HPLC trace in Figure 1 of Rechner et al. (20) shows a
large unresolved peak eluting over 60% of the chromatogram. This was attributed to “chro-
matographically irresolvable” thearubigins. However, this ex- planation cannot be correct as the
traces in Figures 1B and 2B in the present paper demonstrate. A more likely cause of the rise
and fall in baseline is the incomplete separation of the phenolic compounds in the teas. This
would explain the lack of detection of (+)-catechin and (-)-gallocatechin, despite the availability
of reference compounds, and the ability to separate and quantify only five flavonols. In addition,
Rechner et al. (20) reported that 4-caffeoylquinic acid was the main chlorogenic acid in black
teas whereas in the present study 5-caffeoylquinic acid was found to be the main component
and 4-caffeoylquinic acid was not present in detectable amounts. These compounds can be
readily identified based on their MSn fragmentation patterns cited by Clifford et al. (22). The
importance of accurately quantifying the major phenolics in tea has additional compounding
factors when an estimation of total thearubigins content is made. Underestimation of phenolics
will result in an overestimate in the levels of thearubigins.
In summary, (+)-catechin, (-)-epicatechin, (-)-gallocatechin, (-)-epigallocatechin, (-)-epicatechin
gallate, and (-)-epigal- locatechin gallate have previously been identified in both green and black
tea by many investigators. One of the two gradient HPLC systems, used in the current study,
with diode array and MSn detection, facilitated the reliable identification and quan- tification, not
only of these six flavan-3-ols but also of gallic acid, 5-galloylquinic acid, 3- and 5-caffeoylquinic
acid, 4-p- coumaroylquinic acid, theobromine, and caffeine in green and black tea (Figure 1).
The second gradient HPLC system was optimized for a similarly rapid analysis of 14 flavonols
and four theaflavins found in teas. This study demonstrates the value of HPLC with MSn rather
than single stage MS detection for the reliable identification of trace levels of flavan-3-ols and
hy- droxycinnamates. It has been demonstrated in the current study and other investigations
(22, 27, 28, 30-33) that MSn and MS2 are especially useful in providing partial identifications of
trace quantities of flavonols and other natural products when reference compounds are not
available. Such structural information cannot
Figure 3. Percentile composition of the different classes of phenolics in green and black tea.
be obtained when HPLC is used with diode array, fluorescence, or electrochemical detectors.
Further information on the position of substituent groups and the positive identification of some
of the flavonols detected in teas would require the use of NMR as exemplified by the elegant
studies of Engelhardt and colleagues (5, 8). However, this would involve not only extensive
sample purification but also a requirement for several orders of magnitude more analyte than
the low nanogram quantities needed for HPLC-MSn and, as a consequence, would be
extremely time consuming and not an approach that lends itself to routine quantitative analysis.
ACKNOWLEDGMENT
We are grateful for the assistance received from Dr. Jon Leah and Dr. Tim Donovan. We thank
Dr. Claire J. Blacklock who was involved in some of the preliminary analyses.
LITERATURE CITED
(1) International Tea Committee. Annual Bulletin of Statistics;
ITC: 2002. (2) Duthie, GG; Crozier, A. Beverages. In Plants: Diet and Health; Goldberg, G., Ed.;
British Nutrition Foundation, Chapman Hall: London, 2003; pp 147-182. (3) Finger, A.; Kuhr, S.;
Engelhardt, UH Chromatography of tea
constituents. J. Chromatogr. 1992, 624, 293-315. (4) Balentine, DA; Wiseman, SA; Bouwens,
LCM The chemistry of tea flavonoids. Crit. Putaran. Makanan. Sci. Nutr. 1997, 37, 693-704. (5)
Finger, A.; Engelhardt, UH; Wray, V. Flavonol triglycosides containing galactose in tea.
Phytochemistry 1991, 30, 2057- 2060. (6) Price, KR; Rhodes, MJC; Barnes, KA Flavonol
glycoside content and composition of tea infusions made from com- mercially available teas and
tea products. J. Agric. Makanan Chem. 1998, 46, 2517-2522. (7) Wang, J.; Sporns, P.
MALDI-TOF analysis of food flavonol
glycoside. J. Agric. Makanan Chem. 2000, 48, 1657-1662. (8) Finger, A.; Engelhardt, UH
Flavonol glycosides in tea - kaempferol and quercetin rhamnodiglucosides. J. Sci. Food Agric.
1991, 55, 313-321. (9) Kiehne, A.; Engelhardt, UH Theromspray-LC-MS analysis of various
groups of polyphenols in tea. II. Chlorogenic acids, theaflavins and thearubigins. Z.
Lebensm.-Unters. Forsch. 1996, 202, 299-302. (10) Ashihara, H.; Crozier, A. Biosynthesis and
degradation of caffeine and related purine alkaloids. In AdVances in Botanical Research;
Callow, JA, Ed.; Academic Press: London, 1999; Vol. 30, pp 117-205.
(11) Keihne, A.; Lakenbrink, C.; Engelhardt, UH Analysis of proanthocyanidins in tea samples. I.
LC-MS results. Z. Lebensm.- Unters. Forsch. 1997, 205, 153r157. (12) Lakenbrink, C.;
Engelhardt, UH; Wray, V. Identification of two novel proanthocyanidins in green tea. J. Agric.
Makanan Chem. 1999, 47, 4621r4624. (13) Kiehne, A.; Engelhardt, UH Determination of
flavone C- glycosides in tea. Z. Lebensm.-Unters. Forsch. 1993, 197, 239r 244. (14) Bronner,
WE; Beecher, Metode GR untuk menentukan isi katekin dalam infus teh dengan kromatografi
cair kinerja tinggi. J. Chromatogr. A 1998, 805, 137r142. (15) Kuhr, S.; Engelhardt, UH
Determination of flavanols, theogal- lin, gallic acid and caffeine in teas using HPLC. Z.
Lebensm.- Unters. Forsch. 1991, 192, 526r529. (16) Goto, T.; Yoshida, Y.; Kiso, M.;
Nagashima, H. Simultaneous determination of individual catechins and caffeine in green tea. J.
Chromatogr. A 1996, 749, 295r299. (17) Lin, J.-K.; Lin, C.-L.; Liang, Y.-C.; Lin-Shoei, S.-Y.; Jn,
I.-M. Survey of catechins, gallic acid and methylxanthines in green oolong, pu-erh, and black
teas. J. Agric. Makanan Chem. 1998, 46, 3635r3642. (18) Lee, M.-J.; Prabhu, S.; Meng, X.; Li,
C.; Yang, CS An improved method for the determination of green tea polyphenols in biomatrixes
by high-performance liquid chromatography with coulometric array detection. Anal. Biochem.
2000, 279, 164r 169. (19) Cabrera, C.; Giménez, R.; Lo ́pez, MC Determination of tea
components with antioxidant activity. J. Agric. Makanan Chem. 2003, 51, 4427r4435. (20)
Rechner, AR; Wagner, E.; Van Buren, L.; Wiseman, S.; Rice- Evans, CA Black tea represents a
major source of dietary phenolics among regular tea drinkers. Free Radical Res. 2002, 36,
1127r1135. (21) Singleton, VL; Orthofer, R.; Lamuela-Ravento ́s, RM Analysis of total Phenols
and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteau reagent. Metode
Enzymol. 1999, 299, 152r178. (22) Clifford, MN; Johnston, KL; Knight, S.; Kuhnert, N.
Hierachical scheme for LC-MSn identification of chlorogenic acids J. Agric. Makanan Chem.
2003, 51, 2900r2911. (23) Stagg, GV; Swaine, D. The identification of theogallin as
3-galloylquinic acid. Phytochemistry 1971, 10, 1671r1673. (24) Mullen, W.; Lean, MEJ; Crozier,
A. Rapid characterisation of anthocyanins in red raspberry fruit by HPLC coupled to a
single quadrupole mass spectrometer. J. Chromatogr. A 2002, 966, 63r70. (25) Engelhardt, UH;
Lakenbrink, C.; Lapczynski, S. Antioxidative phenolic compounds in green/black tea and other
methylxanthine containing beverages. In Caffeinated BeVerages, Health Benefits, Physiological
Effects and Chemistry; ACS Symposium Series 754; Parliament, TH, Ho C.-T., Schieberle, P.,
Eds.; American Chemical Society: Washington, DC, 2000; pp 111r118. (26) Mulder, TPJ; van
Platerink, CJ; Schuyl, PJS; van Amelsvoort, JMM Analysis of theaflavins in biological fluids
using liquid chromatography-electrospray mass spectrometry. J. Chromatogr. B 2001, 760,
271r279. (27) Guissi, M.; Giusti, M.; Rodrıguez-Saona, LE; Griffin, D.; Wrolstad, RE
Electrospray and tandem mass spectrometry as tools for anthocyanin analysis. J. Agric.
Makanan Chem. 1999, 47, 4657r4664. (28) Burns, J.; Mullen, W.; Landrault, W.; Teissedre,
P.-L.; Lean, MEJ; Crozier, A. Variations in the profile and content of anthocyanins in wines
made from Cabernet Sauvignon and Hybrid grapes. J. Agric. Makanan Chem. 2002, 50,
4096r4102. (29) Hong, V.; Wrolstad, RE Use of HPLC separation/photodiode array detection for
characterisation of anthocyanins. J. Agric. Makanan Chem. 1990, 38, 708r715. (30) Mullen, W.;
McGinn, J.; Lean, MEJ; MacLean, MR; Gardner, P.; Duthie, GG; Crozier, A. Ellagitannins,
flavonoids and other phenolics in red raspberries and their contribution to antioxidant capacity
and vasorelaxation properties. J. Agric. Makanan Chem. 2002, 50, 5191r5196. (31) Mullen, W.;
Graf, B.; Caldwell, ST; Hartley, RC; Duthie, GG; Lean, MEJ; Crozier, A. Determination of
flavonol metabolites in plasma and tissues of rats by HPLC-radiocounting and tandem mass
spectrometry following oral ingestion of [2-14C]- quercetin-4′-glucoside. J. Agric. Makanan
Chem. 2002, 50, 6902r 6909. (32) Mullen, W.; Hartley, RC; Crozier, A. Detection and identifica-
tion of 14C-labeled flavonol metabolites by HPLC-radio-counting and tandem mass
spectrometry. J. Chromatogr. A 2003, 1007, 21r29. (33) Mullen, W.; Yokota, T.; Lean, MEJ;
Crozier, A. Analysis of elligitannins and conjugates of ellagic acid and quercetin in raspberry
fruits by LC-MSn. Phytochemistry 2003, 64, 617r 624.
Received for review December 18, 2003. Revised manuscript received March 17, 2004.
Accepted March 17, 2004. This project was funded by a grant from the Tetley Company (UK).
JF0354848