LAPORAN VIROLOGI

ELEKTROFORESIS DNA

KELOMPOK 7

I GUSTI NGURAH TEJA PRATAMA (P07134016001)

NI PUTU HENY YUDIANI LESTARI (P07134016006)

NI KOMANG SETYANINGSIH (P07134016013)

NI KOMANG TRISNA UTAMI (P07134016017)

KADEK DWIYANTI WAHYUNI (P07134016024)

NI KOMANG AYU ANDRENA PARMITA DEWI (P07134016028)

KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHTAN DENPASAR

JURUSAN ANALIS KESEHATAN

2018
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara
berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang
semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah
pengembangan di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan Biologi
Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis
ditemukan dan dipakai mempunyai arti transport atau perpindahan melalui
partikel-partikel listrik. metode elektroforesis telah digunakan dan dikembangkan
di dalam teknik analisa untuk penelitian-penelitian di bidang biologi dan
genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan
teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah.
Di bidang ilmu biologi ataupun biologi molekuler, metode elektroforesis banyak
digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun
tumbuhan. Metode elektroforesis baru benar-benar dipakai oleh para peneliti
genetik di tahun 1957 setelah HUNTER & MOLLER mempunyai ide penelitian
dengan menggunakan sifat-sifat enzim sebagai katalisator untuk memperlihatkan
keberadaannya secara Kimia Histologi (Zona elektroforesis)(1)
Elektroforesis merupakan suatu metode pemisahan dengan prinsip kerja
yang berdasarkan pada adanya perbedaan kecepatan gerak partikel bermuatan
bila terdapat dalam suatu medan listrik. Salah satu contohnya adalah
elektroforesis gel agarosa yang merupakan metode standar untuk memisahkan,
mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Ektroforesis gel agarosa
tersusun atas agarose sebagai pendukung yang merupakan suatu polissakarida
yang diekstraksi dari berbagai jenis ganggang merah. Molekul agarose adalah
polimer linier dari unit disakarida berulang yang tersusun atas D-
galaktopiranosa dan 3,6 anhidro L-galaktosa yang dihubungkan dengan ikatan
1,3-gllikosidik(2).
 Gel agarosa dengan tebal 0,5 cm (Brown, 2003) akan memaksa DNA
dengan ukuran 5 sampai 60 kb bergerak melewati celah kerangka agarosa ke arah
anoda (karena muatan positif pada gugus phosphatnya). Kecepatan migrasi DNA
ditentukan oleh beberapa faktor diantaranya ukuran molekul DNA, konsentrasi
agarosa, konformasi molekul DNA, voltase yang digunakan, adanya etidium
bromide, komposisi larutan buffer(1)
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub
positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan
bergerak menuju kutub negatif (anode). Prinsip inilah yang dipakai dalam
elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya
sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fase diam (stationary
phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena partikel sol
bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik.
Kemampuan perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah
kutub yang berlawanan merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses
elektroforesis yang dinyatakan sebagai mobilitas elektroforetik(3).
Elektroforesis DNA pada gel agarosa tidak dipengarui secara bermakna
baik oleh komposisi basa DNA maupun oleh suhu kamar saat gel dijalankan. Jadi
dalam gel agarosa mobilitas elektroforesis fragmen DNA dengan berbagai
ukuran tidak berubah antara 4oC dan 30oC. Pada umumnya gel agarosa
dijalankan pada temperatur kamar. Namun gel yang mengandung agarosa kurang
dari 1,5% adalah sangat lunak, sehingga paling baik bila dijalankan pada 4oC
supaya gel cukup keras(1).
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan permasalahan
dalam laporan ini yaitu bagaiana cara atau prosedur dalam memisahkan,
mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA melalui uji elektroforesis gel
agaore?
1.3 Tujuan
Berdasarkan masalah yang ditentukan pada praktikum ini, adapun tujuan dari
laporan ini adalah sebagau berikut:
1.3.1 Tujuan Umum
 Mengetahui dan memahami prosedur pembuatan gel agaore dan dapat
mengetahui prosedur uji elektroforesis.
1.3.2 Tujuan Khusus
 Untuk dapat memisakan, mengidentifikasi dan memurnikan fragmen
DNA dengan elektroforesisi gel agarose.
 Untuk dapat memahami prinsip dari uji elektroforesis gel agarosa.
1.4 Manfaat
1.4.1 Manfaat Teoritis
Dapat digunakan sebagai pengembangan ilmu pengetahuan mengenai proses
pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen DNA dengan elektroforesis
gel agarose.
1.4.2 Manfaat Praktis
Untuk dapat dijadikan sebagai bahan acuan bagi pratikum berikutnya yang
melakukan praktikum sejenis.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

1. VIRUS
a. Pengertian Virus
Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme
biologis. Virus bersifat parasite obligat, hal tersebut disebabkan karena virus hanya
dapat bereproduksi di dalam sel material hidup dengan menginvasi dan
memanfaatkan sel makhluk hidup karena virus tidak memiliki perlengkapan seluler
untuk bereproduksi sendiri. Biasanya virus mengandung sejumlah kecil asam nukleat
(DNA atau RNA, tetapi tidak kombinasi keduanya) yang diselubungi semacam bahan
pelindung yang terdiri atas protein, lidip, glikoprotein atau kombinasi ketiganya.
Genom virus akan diekspresikan menjadi baik protein yang digunakan untuk memuat
bahan genetik maupun protein yang dibutuhkan dalam daur hidupnya (4)
Virus merupakan parasit obligat intraseluler dimana dalam replikasinya
sangat bergantung pada system metabolisme sel inang. Ukuran virus sangat kecil
(ukuran virus 20-30 nm) sehingga tidak dapat dilihat dengan mata telanjang dan
tidak dapat dilihat dengan mikroskop cahaya. Virus hanya bisa dilihat dengan
mikroskop elektron. Virus adalah agen infeksius ukuran kecil dan komposisi
sederhana yang dapat berkembang biak hanya dalam sel hidup dari hewan, tumbuhan,
atau bakteri (5)
b. Isolasi DNA
Asam nukleat adalah polinukleotida yang terdiri dari unit-unit
mononukleotida, jika unit-unit pembangunnya deoksinukleotida maka asam nukleat
itu disebut deoksiribonukleat (DNA) dan jika terdiri dari unit-unit mononukleotida
disebut asam ribonukleat (RNA). Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah
satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam mempelajari teknik biologi molekular.
Ekstraksi atau isolasi asam nukleat dapat membuang dan memisahkan asam nukleat
dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat
yang diperoleh dapat dianalisis atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi
molekular lainnya. Ekstraksi asam nukleat ini berguna untuk meneliti bahan yang
bersifat mikro dengan alat-alat yang bersifat mikro (C et al., 2014).
Isolasi DNA merupakan salah satu teknik dasar dalam biologi molekuler yang
dapat dikembangkan menjadi penelitian-penelitian yang kompleks mengenai
informasi genetik yang dimiliki oleh suatu organisme. Informasi pada DNA disimpan
dalam bentuk basa nukleotida yaitu adenine (A), guanine (G), cytosine (C), dan timin
(T). Setiap sekuen basa nukleotida mengandung informasi genetik yang berperan
dalam perkembangan dan pengaturan organisme. Sebuah sel memiliki DNA yang
merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.Suatu
sel lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki oleh organisme dan terorganisasi
menjadi kromosom disebut sebagai genom. DNA dapat diisolasi, baik pada manusia,
tumbuhan, hewan, maupun mikroorganisme (6).
Isolasi DNA merupakan tahapan pekerjaan awal yang harus dilakukan dalam
berbagai pemeriksaan analisis DNA. Keberhasilan proses isolasi DNA seringkali
sangat menentukan hasil pekerjaan selanjutnya. Proses ekstraksi untuk mendapatkan
DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam
analisis molekuler. Berbagai analisis biologi molekuler memerlukan hasil isolasi
DNA dengan tingkat kemurnian dan kualitas yang baik. DNA hasil isolasi harus
terbebas dari berbagai kontaminan seperti protein dan RNA yang dapat menggangu
berlangsungnya proses PCR. Oleh karena itu, metode isolasi DNA yang tepat sangat
diperlukan untuk mendapatkan DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik.
Kualitas DNA genom yang baik merupakan hal penting yang dibutuhkan dalam
aplikasi biologi molekuler. Aplikasi tersebut meliputi PCR (Polymerase Chain
Reaction), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), dan analisis molekuler yang lain. Berbagai teknik
ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar sehingga saat ini muncul
berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA dalam bentuk kit yang prosesnya akan
lebih mudah, cepat, dan sederhana (7)
 Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi
molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk
memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik
molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarose (8)

c. Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan
molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan
ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein
dan asam nukleat). Pemberian aliran listrik dapat menyebabkan terjadi perpindahan
aliran elektron dan zat objek, kemudian akan bergerak dari elektroda negatif ke arah
sisi elektroda positif. Objek yang berat molekulnya lebih besar akan lebih lambat
berpindah. Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan dan mempurifikasi
makromolekul. Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan
asam nukleat yang memiliki perbedaan ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul
penyusunnya. Molekul-molekul tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik
sehingga akan bermigrasi karena adanya perbedaan muatan. Molekul protein dan
asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari kutub negatif menuju kutub
positif dari gel elektroforesis. Gel elektroforesis terdiri dari pemecahan molekul
menjadi fragmen banyak oleh aksi enzim tertentu. Fragmen ini tersebar di media
poliakrilamida atau gel agarosa dimana medan listrik diterapkan. Masing-masing
fragmen memiliki muatan listrik yang berbeda dan berat molekul, menyebabkan
mereka harus bermigrasi pada tingkat yang berbeda melalui gel (9)

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA
dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran,
kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.

 Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:

1. Elektroforesis bebas (free electrophoresis) merupakan molekul atau partikel yang
akan dipisahkan tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan
yang mengandung partikel tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di
antara dua larutan.
2. Elektroforesis zona merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak
digunakan, mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat,
agarose atau poliakrilamid, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi
proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa
tidak mungkin untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Ada
kemungkinan faktor yang lain yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada
proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. dimungkinkan karena dalam proses
penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu dari suhu penyimpanan (8)

Metoda elektroforesis gel agarosa didasarkan pada pergerakan molekul

bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik.
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan
elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal.
Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA
(sekuensing). Molekul organik yang dapat dielektroforesis antara lain DNA, RNA,
dan protein. Lokasi fragmen DNA yang terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis
dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan pewarna. Pewarna yang
digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basa-basa pada
DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan
lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Etidium bromida merupakan
senyawa karsinogenik sehingga dalam melaksanakan percobaan yang menggunakan
etidium bromida harus menggunakan sarung tangan (10)

Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.
Marker berfungsi untuk mengetahui ukuran DNA hasil apmlifikasi. Marker DNA
yang terdapat dalam gel elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi molekul
DNA yang bermigrasi untuk menentukan perkiraan ukuran basa-basanya (11)

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose
atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan
elektroforesis. DNA dalam gel agarosa dapat terlihat dengan penambahan red gel yang
akan berikatan dengan DNA dan akan bersifat fluorescens dibawah sinar UV.
Penambahan loading dye dilakukan bertujuan sebagai penanda pergerakan DNA dalam
gel agarose.(12)

DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan

listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan
kecepatannya tergantung dari (12) :

a. Ukuran molekul DNA

b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan
penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk (12) :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan
 BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 WAKTU DAN TEMPAT

3.1.1 Waktu :
 Kamis, 6 Desember 2018
Pukul : 14.00-16.50 WITA
3.1.2 Tempat :
 Laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes Denpasar

 Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan Analis Kesehatan Poltekkes

Denpasar

3.2 ALAT DAN BAHAN

3.2.1 Alat

1. Satu set alat elektroforesis

2. Mikropipet dan tip
3. Gel Doc
4. Power Supply
5. Parafilm

3.2.2 Bahan

1. DNA Marker
2. Sampel Isolasi Jaringan
3. Sampel Isolasi Plasma
4. Ethidium Bromide (EtBr)
5. Gel Agarose
6. Loading Buffer (Loading dye)
7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)
 8. Akuades
3.3 CARA KERJA
3.3.1 Pembuatan Gel Agarose
1. Dibut TAE dengan kepekatan 1X dari buffer TAE 50X, dengan cara
memipet 20 mL TAE 50X dilarutkan dalam 980 mL akuades
2. 1,5 gram bubuk agarose dilarutkan pada 150 ml Buffer TAE 1X.
3. Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.
4. Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu ruang.
5. Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.
6. Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan
hingga mengeras.
7. Setelah gel tersebut mengeras, sisir dapat diambil dan gel agarose siap
untuk digunakan.

3.3.2 Elektroforesis
1. Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.
2. Disiapkan kertas parafilm, ditambahkan dengan 2µl gel stain diatasnya.
3. Ditambahkan 2µl loading dye dicampur dan 5µl produk DNA pada
parafilm yang telah tersedia dengan bantuan mikropipet, lalu
dicampurkan.
4. Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose
5. Sedangkan untuk 5µl DNA marker 100bp yang ditambahkan dengan 2 µl
gel stain dituangkan pada sumur/well pertama.
6. Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power
supply.
7. Power Supply ( 250mA, 100V) dinyalakan selama 45 menit.

8. Hasil running diangkat menggunakan sarung tangan, kemudian

divisualisasikan pada UV transiluminator (UV Solo).
3.3.3 Pembacaan Pita DNA dengan UV Solo

1. Ditekan tombol power pada bagian kanan atas touch screen.

2. Dinyalakan UV solo dengan cahaya putih, buka pintu dan letakkan gel di
atas permukaan transiluminator. Tutup pintu kembali.

3. Diklik icon VisionWorks untuk membuka software.

4. Dinyalakan cahaya UV pada transilluminator pada bagian bawah kanan

ON (I). Digunakan nob untuk mengatur intensitas cahaya.

5. Pada software, tekan Start Preview untuk melihat gel. Untuk mengubah
posisi gel, dimatikan lampu UV dan tur posisi gel kembali.

6. Sambil melihat tampilan gel pada LCD, diatur kcerahan dengan memutar
knob F-Stop dan diatur focus lensa.

7. Penggunaan perbesaran optic maksimum yang bersamaan dengan bukaan

lensa besar (angka kecil) akan menghasilkan gambar yang tidak focus.
Diatur kembali cincin focus lensa untuk menjernihkan gambar.

8. Untuk memperbesar atau mengecilkan gambar, optic lensa dapat diputar

dengan cincin zoom pada lensa kamera.

9. Selain itu, dapat juga menggunakan software untuk memperbesar atau

mengecilkan gambar pada bagian gambar tertentu dengan tombol “+” dan
“-“ pada sisi kanan gambar. Ditekan dan digeser sesuai ukuran yang
diinginkan.

10. Gambar preview yang dibesar atau dikecilkan akan menjadi hasil gambar
yang diambil, disimpan, dan dicetak.

11. Ditekan Capture Mode untuk mengatur waktu ekspose UV saat melihat
atau mengambil gambar. Auto exposure dapat diatur dan memilih : Best
Better Good Minimum.
12. Ditekan tombol Histogram untuk pengaturan gambar (terang atau gelap)
dan dapat menekan tombol Reset untuk mengembalikannya seperti semula.
Diubah Auto Adjust ON akan mengatur histogram secara otomatis
sehingga mendapatkan hasil yang ideal.

13. Ditekan Action untuk mengambil langkah Start Preview, Start Capture,
Do Nothing.

14. Ditekan Start Capture untuk mengambil gambar.

15. Ditekan Done dan Save.

16. Gambar yang diambil akan tersimpan atau tercetak secara otomatis ataupun
dapat dilakukan manual dengan menekan tombol Save dan Print (otomatis
atau annual dapat diatur di setting). Gambar akan tersimpan dilokasi yang
telah diatur dalam setting.

17. Dimatikan lampu UV (transilluminator).

18. Dimatikan alat dengan menekan tombol Power pada bagian kanan atas
touch screen dan dikelurkan gel setelah UV Solo TS selesai digunakan.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL PENGAMATAN

Hasil Gambar Keterangan Gambar

Hasil dari elektroforesis berupa pita-

pita yang terpisahkan berdasarkan
berat molekulnya.

- pita DNA pada sampel

jaringan terlihat jelas
terbentuk sehingga
menandakan DNA terisolasi
dengan baik
- pita DNA pada sampel
plasma tidak terlihat jelas
terbentuk sehingga
menandakan DNA tidak
terisolasi dengan baik

4.2PEMBAHASAN

Elektroforesis merupakan metode analisis fisika berdasarkan kecepatan

migrasi partikel bermuatan yang terlarut atau terdispersi, dalam larutan elektrolit
dibawah medan listrik. Prinsip pemisahan dengan elektroforesis gel adalah pemisahan
suatu molekul organik dari campurannya melalui suatu gel dalam suatu medan listrik.
Pemisahan terjadi tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran(3)
Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat kemurnian DNA
atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient
sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose
atau akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih
besar karena memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari
agarose (resolusi) lebih kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid
memiliki ukuran partikel yang lebih halus sehingga daya pemisahannya lebih baik.
Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid merupakan Teknik ini
merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat memisahkan molekul yang
diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti
sentrifugasi gradient(3)
Metode standar yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan
memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose. Teknik ini sederhana,
cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan DNA sesuai dengan
ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient sentrifugasi. Agarosa
yang disaring dari ganggang laut merupakan polimer dengan dasar struktur D-
alaktosa dan 3,6 –anhidro L-galaktosa. DNA dari 200 basa sampai 50 kilo basa dapat
dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai konsentrasi agarosa. Gel agarosa
biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam kekuatan medan listrik dan
arah tetap(3)
Gel yang biasa digunakan adlah gel agarosa. Gel agarosa dapat melakukan
pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang
basa (pb). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga nanti di dalam medan listrik
akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar
ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Gel agarosa dibuat dengan
melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan
diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan
kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan
antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke
anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi
DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. Molekul DNA
untai ganda linear, yang diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui
matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa.
Molekul yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. Hal
ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang efisien lajunya
dari pada molekul yang lebih kecil. Fragmen DNA linear dengan panjang tertentu
bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung konsentrasi
agarosa berbeda. Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA dengan
menggunakan etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya
digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid. Manfaat
elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk
PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat
disequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA(3)
Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan,antara lain
membandingkan gen homolog dari spesies yang berbeda, mengetahui susunan
sekuens berbagai genom, DNA finger printing, mengetahui ada atau tidaknya gen-
gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah
mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama
perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah
diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui
variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi
berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa
fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan
perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang
dikloning dalam rekombinan plasmid DNA(3)
Pada praktikum elektoforesis DNA digunakan gel Agarosa. Sebelum
melakukan elektroforesis, disiapkan terlebih dahulu gel agarosa dan buffer TAE. Gel
agarosa yang digunakan memiliki konsentrasi 1% yang dibuat dengan mencampurkan
1,5 gram agarosa dengan 150 ml TAE. Buffer TAE yang digunakan memiliki
kepekatan 1X dalam volume 1 liter, dibuat dengan mencampurkan 20 ml buffer TAE
dengan 980 ml akuades.
Penggunaan konsentrasi agarosa merupakan salah satu faktor yang
berpengaruh dalam laju migrasi DNA dan penggunaan gel dengan konsentrasi yang
berbeda dapat mengatasi perbedaan ukuran fragmen DNA. Konsentrasi gel agarosa
yang rendah memberikan resolusi yang baik untuk fragmen yang besar antara band
yang dekat ukurannya. Fragmen DNA termasuk fragmen besar sehingga dapat
menggunakan konsentrasi gel agarosa yang lebih rendah yaitu konsentrasi gel agarosa
1% untuk memberikan hasil resolusi yang baik(13)
Buffer Tris-acetate EDTA (TAE) atau Trisborat EDTA (TBE) dalam hal ini
sebagai fase gerak, merupakan buffer yang umum digunakan sebagai buffer
elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering yang tinggi pada titik
isoelektriknya. Borat bertindak sebagai conducting ion sehingga dapat
mempertahankan kesetimbangan ion H+ dan OH- yang dihasilkan oleh elektrode, hal
ini berhubungan dengan fungsi buffer dalam menjaga kesetimbangan pH saat migrasi
fragmen DNA berlangsung, perubahan pH dapat mendenaturasi struktur DNA
sehingga merubah elektromobilitas DNA(14)
Larutan agarosa yang telah dibuat kemudian dituangkan ke baki gel agarosa
dan diletakkan sisiran untuk membuat sumuran lalu dibiarkan hingga larutan menjadi
gel yang padat. Setelah gel agarosa padat, sisiran dicabut kemudian baki yang telah
berisi gel agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan ditambahkan buffer
TAE hingga terendam seluruhnya(15)
Tahap berikutnya yaitu persiapan mengisi marker dan sampel ke dalam
sumuran. Marker atau penanda DNA adalah fragmen DNA yang telah diketahui
ukurannya. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran
berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel
dengan mengelektroforesis marker tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan
sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel
untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap
logaritma ukuran molekul. Marker yang digunakan dalam praktikum memiliki 100
pasang basa dan sudah berisi loading dye, sehingga nantinya hanya akan dicampur
dengan pewarna gel atau gel stain sebelum dimasukkan ke sumur(16)
Sampel suspense DNA yang akan dimasukkan ke sumur sebelumnya harus
dicampur dengan loading dye dan gel stain. Loading dye terdiri dari glycerol,
bromphenol blue, dan xylene cyanol FF. Glycerol berfungsi sebagai pemberat
sehingga DNA berada di bawah sumuran, sedangkan bromphenol blue dan xylene
cyanol FF berfungsi sebagai visualisasi pada gel sehingga proses migrasi DNA pada
saat berlangsungnya elektroforesis tidak melebih batas gel dan membantu pergerakan
sampel ke anoda. Sedangkan gel stain berfungsi untuk memberi warna sehingga DNA
akan berpendar. Sampel yang dicampur dengan loading dye dan gel stain akan
berubah warna menjadi ungu(1)
Tahap selanjutnya adalah mengisi sumuran dengan marker, marker dipipet 7
µl lalu diisi pada sumur yang pertama. Dilanjutkan dengan campuran 5 µl sampel dan
masing-masing 2 µl loading dye diisi pada sumur yang kedua. Setelah campuran diisi
ke masing-masing sumur, kemudian dilakukan running. Sebelumnya tangki
elektroforesis harus ditutup dengan rapat. Selanjutnya dipasang elektroda sesuai
dengan kutub, untuk elektroda negative (anoda) ditunjukkan dengan warna hitam dan
muatan positif (katoda) berwarna merah. Jika elektroda sudah dipasang, kemudian
atur tegangan pada angka 100V, MA 250 dan timer 45 menit lalu tekan start. Adanya
arus listrik akan ditunjukkan dengan pergerakan TAE seperti menghasilkan
gelembung kecil yang berada dalam tangki elektroforesis.
Setelah running selama 45 menit dan sudah terlihat pergerakan marker dan
sampel, selanjutnya dibaca dan diamati di bawah sinar UV menggunakan UV
transiluminator atau gel dok. Prinsip kerja dari alat ini adalah sinar UV yang
dipancarkan akan memendarkan Ethidium bromide (EtBr) yang menempel pada
DNA. Sehingga visualisasi DNA bisa terlihat lewat pancaran yang berwarna orange
keputihan tersebut. Jika proses pemisahan DNA berhasil akan ditandai dengan adanya
pita yang berpendar pada masing-masing sumur. Pita-pita yang berjarak sama dari
sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di
dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti
bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama(3) Pembacaan pada gel doc
diperoleh hasil pita DNA dari sampel jaringan terlihat jelas terbentuk, menandakan
DNA terisolasi dengan baik. Sedangkan Pita DNA dari sampel plasma tidak terlihat
jelas terbentuk, menandakan DNA tidak terisolasi dengan baik.
 Menurut Juliandi (2014) terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
kecepatan migrasi DNA antaranya :
1. Ukuran molekul DNA
Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi
molekul berukuran kecil.
2. Konsentrasi agarosa
Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih
cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi
tinggi. Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarosa dalam membuat gel
harus memperhatikan ukuran molekul DNA yang akan dianalisis.
3. Konformasi DNA
Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama
akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda.
4. Voltase yang digunakan
Dalam voltase, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya
voltase yang digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan voltase dinaikkan,
mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Ini mengakibatkan
pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun dengan meningkatnya voltase
yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi
molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per
cm.
5. Komposisi larutan buffer
Apabila tidak ada kekuatan ion di dalam larutan, maka aliran listrik
akan sangat minimal dan migrasi DNA sangat lambat. Sementara larutan
buffer berkekuatan ion tinggi akan meningkatkan panas, sehingga aliran listrik
menjadi sangat maksimal. Ada kemungkinan gel akan meleleh dan DNA
dapat mengalami denaturasi.
6. Keberadaan etidium bromida di dalam gel
Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi
molekul DNA linear sebesar 15%.
 BAB V

PENUTUP

5.1 Simpulan

Berdasarkan pratikum, yang telah dilakukan, yaitu identifikasi DNA

dengan metode elektroforesis dalam gel agar rose, pembacaan pada gel doc
setelah sampel di elektroforesis pada gel agarose untuk membentuk marker laju
DNA ,diperoleh hasil pita DNA dari sampel jaringan terlihat jelas terbentuk
dengan berpendarnya pita akibat sinar UV, yang menandakan DNA terisolasi
dengan baik. Pita hanya dilihat pada sampel jaringan, sedangkan Pita DNA dari
sampel plasma tidak terlihat jelas terbentuk, menandakan DNA tidak terisolasi
dengan baik.

5.2 Saran

Dalam melakukan pengujian untuk identifikasi DNA dengan ,metode

elektroforesis dalam gel agarose sangat diperhatikan dari kondisi inokulasi,
instrumen, serta sterilitas pembuatan gel yang dapat mempengaruhi hasil dan
pergerakan arus pada gel .
 DAFTAR PUSTAKA

1. Pratiwi R. Mengenal metode elektroforesis. Oseana. 2010;26(1):25–31.

2. Lestari P. Uji aktivitas pemotongan dna superkoil fraksi protein daun kucing-
kucingan (. 2008;

3. Aditta L. Genetika dan Biologi Molekuler ( Elektroforesisi Dna (SDS-PAGE)).

2013;

4. Damara D, Nulhakim RL, Pertanian F, Garut U. VIRUS. 2017;(52):1–5.

5. Ayu G, Kencana Y. Modul Training CARA MENGISOLASI VIRUS

DANMENGIDENTIFIKASI. 2017;13–21.

6. Widyastuti DA. Isolasi DNA Kromosom Salmonella sp . dan Visualisasinya

pada Elektroforesis Gel Agarosa. 2011;311–7.

7. Murtiyaningsih H. ISOLASI DNA GENOM DAN IDENTIFIKASI

KEKERABATAN GENETIK NANAS MENGGUNAKAN RAPD
(RANDOM AMPLIFIED POLIMORFIC DNA). 2017;15(1).

8. Na E, Gelu A, Klini PU, Hemiji KOJ, Giot J. AGAROSE GEL

ELECTROPHORESIS – APPLICATIONS IN CLINICAL CHEMISTRY.
2010;29(1):9–14.

9. Lee J, Huang C, Wang N, Lu C. Automatic DNA sequencing for

electrophoresis gels using image processing algorithms.
2011;2011(August):523–8.

10. Koprowski R, Wróbel Z, Korzy A, Chwia K. Automatic analysis of 2D

polyacrylamide gels in the diagnosis of DNA polymorphisms Automatic
analysis of 2D polyacrylamide gels in the diagnosis of DNA polymorphisms.
2013;

11. Biomedicine T. Modified gel preparation for distinct DNA fragment analysis
in agarose gel electrophoresis. 2010;27(2):351–4.
12. Sinaga J. Laporan Praktikum Isolasi DNA, Teknik PCR dan Elektroforesis
Agarose. Nama Juwita Rika Nailuvar Sinaga. 2012;

13. Pakpahan SE. Pengujian Konsentrasi gel agarose 1% dan 1,2% pada
elektroforesis DNA Mycobacterium Tuberculosis. 2015;5:19–23. Available
from: http://www.depkes.go.id/article/view/2383/diabetes-melitus-penyebab-
kematian-nomor-6-di-dunia-kemenkes-tawarkan-solusi-cerdik-melalui-
posbindu.html

14. Juliandi B, Pengantar K. Penuntun Praktikum Mikroteknik. 2014;(Idk Ii).

15. Agnes Rengga Indrati, Ida parwati N. Jurnal 4.Pdf. Vol. XL No 4, Korelasi
Nilai Anion Gap Dengan Nilai Base Excess Serta Peranan Kadar Klorida
Terhadap Anion Gap Pada Penderita Asidosis Metabolik. 2008.

16. Vivikananda E. UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA Deteksi DNA

Babi dan DNA Sapi dengan Menggunakan Metode Insulated Isothermal
Polymerase Chain Reaction (ii-PCR). 2014.