EFEKTIVITAS VITAMIN

“ Assay Sianokobalamin oleh Lactobacillus leichmanii “

MAKALAH
Diajukan untuk memenuhi sebagian tugas mata kuliah Mikrobiologi Farmasi

Kelompok : 6
Intania Pertiwi ( 2016.01.00.02.011 )

Putri ( 2016.01.00.02.018 )

Dian Sartika ( 2016.01.00.02.026)

Dosen Pembimbing : Tika Afriani, M.Farm., Apt

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

UNIVERSITAS MOHAMMAD NATSIR

BUKITTINGGI

2018
 KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas segala limpahan
rahmat dan karunia-Nya kepada kami sehingga dapat menyelesaikan makalah Mikrobologi
Farmasi “ uji efektifitas vitamin “
Kami menyadari bahwa di dalam pembuatan makalah ini masih banyak kekurangan baik
materi maupun cara penulisannya. Oleh karena itu, kami dengan rendah hati dan dengan tangan
terbuka menerima masukan, saran dan usul guna menyempurnakan makalah ini.
Kami berharap semoga makalah ini bermanfaat bagi seluruh pembaca.

Penulis, Mei 2018

Kelompok VI
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
B12 defisiensi adalah penyebab anemia pernisiosa , penyakit anemia yang biasanya berakibat
fatal dan memiliki etiologi yang tidak diketahui ketika pertama kali dijelaskan dalam
kedokteran.George Whipple telah melakukan eksperimen di mana ia diinduksi anemia pada
anjing oleh perdarahan mereka, dan kemudian memberi mereka makan berbagai makanan untuk
mengamati yang diet memungkinkan mereka pemulihan tercepat dari anemia yang dihasilkan.
Dalam prosesnya, ia menemukan bahwa menelan sejumlah besar hati tampaknya paling cepat
menyembuhkan anemia kehilangan darah. Dengan demikian, ia hipotesis bahwa konsumsi hati
mungkin mengobati anemia pernisiosa. Dia mencoba ini dan melaporkan beberapa tanda-tanda
keberhasilan pada tahun 1920.
Setelah serangkaian studi klinis yang cermat, George Richards Minot dan William Murphy
berangkat untuk sebagian mengisolasi zat dalam hati yang sembuh anemia pada anjing, dan
menemukan bahwa itu adalah besi . Mereka juga menemukan bahwa zat hati yang sama sekali
berbeda sembuh anemia pernisiosa pada manusia, yang tidak berpengaruh pada anjing di bawah
kondisi yang digunakan. Perlakuan faktor spesifik untuk anemia pernisiosa, ditemukan dalam jus
hati, telah ditemukan oleh kebetulan ini.Minot dan Murphy melaporkan percobaan ini pada tahun
1926.Ini adalah kemajuan nyata pertama dengan penyakit ini.Meskipun penemuan ini, selama
beberapa tahun pasien masih diperlukan untuk makan dalam jumlah besar hati mentah atau
minum dalam jumlah yang cukup jus hati.
Pada tahun 1928, ahli kimia Edwin Cohn menyiapkan ekstrak hati yang 50 sampai 100 kali
lebih kuat daripada produk hati alami.Ekstrak itu pengobatan yang bisa diterapkan pertama untuk
penyakit ini. Untuk pekerjaan awal mereka dalam menunjukkan cara untuk pengobatan bekerja,
Whipple, Minot, dan Murphy bersama 1934 Hadiah Nobel dalam Fisiologi atau Kedokteran .
Peristiwa ini pada akhirnya menyebabkan penemuan vitamin yang larut, yang disebut
vitamin B12 , dari kaldu bakteri. Pada tahun 1947, saat bekerja untuk Departemen Ilmu Unggas
di University of Maryland, Mary Shaw Shorb (dalam sebuah proyek kolaborasi dengan Folkers
dan Merck) diberikan dengan $ 400 hibah untuk mengembangkan apa yang disebut “uji LLD”
untuk B 12 . LLD berdiri untuk Lactobacilis lactis Dorner, strain bakteri yang diperlukan “LLD
faktor” untuk pertumbuhan, yang akhirnya diidentifikasi sebagai B 12 . Shorb dan rekan-rekannya
menggunakan uji LLD untuk cepat mengekstrak faktor anemia pernisiosa anti-dari ekstrak hati,
dan murni B 12 diisolasi dengan cara ini dengan tahun 1948, dengan kontribusi dari ahli kimia
Shorb, Karl A. Folkers Amerika Serikat dan Alexander R. Todd dari Inggris. Untuk penemuan
ini, pada tahun 1949 Mary Shorb dan Karl Folkers menerima Mead Johnson Award dari
American Society of Nutritional Sciences.

B. Rumusan masalah
1. Apa itu Pengertian uji efektivitas vitamin dan asam amino?
2. Bagaimana Sifat fisika kimia sianokobalamin?
3. Bagaimana pentapan uji aktivitas vitamn B12?

C. TUJUAN MASALAH
1. Untuk mengetahui pengertian uji efektivitas vitamin dan asam amino
2. Unruk mengetahui sifat fisika kimia sianokobalamin
3. Untuk mengetahui uji aktivitas vitamin B12

D. Manfaat Penulisan
1. Untuk ilmu pengetahuan bagi mahasiswa
2. Untuk menambah wawasan tentang uji efektifitas vitamin bagi masyarakat
3. Untuk memperdalam pengetahuan tentang uji efektifitas vitamin
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Pengertian uji efektifitas vitamin dan asam amino

Uji ini merupakan kebalikan dari uji anti mikroba atau uji antibiotic yang didasarkan pada
penghambatan pertumbuhan mikroorganisme . Assay vitamin dan asam amino justru didasarkan
pada peningkatan pertumbuhan mikroorganisme. Pada uji ini digunakan media kultur bernutrisi
yang sesuai untuk mikroba uji, yaitu memiliki semua factor pertumbuhan. Kurva kalibrasi dari
konsentrasi substansi uji terhadap beberapa parameter pertumbuhan mikroorganisme seperti
berat sel kering (BSK) dapat di plotkan sehingga konsentrasi factor pertumbuhan dapat
ditentukan. Salah satu contoh uji ini yaitu assay sianokobalamin oleh Lactobacillus leichmanii.
Metode ini terdiri dari inkubasi sel-sel yang dicuci dua kali pada suhu 37ᴼC selama 45 menit
menggunakan destilasi air. Studi kelangsungan hidup dan pertumbuhan menunjukkan bahwa
prosedur stabilisasinya :
1. tidak mempengaruhi jumlah sel,
2. optimal untuk mengurangi kemungkinan terbawanya vitaminB12 atau nutrilites dan
cadangan lainnya, dan
3. membawa suatu tahapan sel-sel dari inokulum yang mengalami pertumbuhan
logaritmik pada inokulasi minimal selama (45 menit) hasilnya sama ketika sel - sel
diinkubasi dalam dekstrosa-air.
Kelangsungan hidup sel-sel dalam garam fisiologis lebih besar dari pada air suling , tetapi
memerlukan waktu yang lebih lama untuk menstabilkan inokulum dalam garam, yang
menghalangi penggunaannya dalam pekerjaan uji ini. Dalam persiapan inokulum dengan
Lactobacillus leichmannii ATCC ( American tipe culture collection ) 7830 untuk vitamin
Prosedur pemeriksaan B12 , bakteri biasanya dicuci satu sampai tiga kali sebelum digunakan
(Hoff-Jorgensen, 1954). Tes semacam itu sering menunjukkan hasil yang tidak menentu,
meskipun tindakan pencegahan dalam membersihkan tabung dan persiapan dari tes yang baik.
Dalam upaya memperbaiki prosedur kemungkinan bahwa hanya mencuci sel-sel tidak cukup
untuk menghilangkan nutrisi yang bisa dibawa di permukaan dari sel - sel atau di kolam
intraseluler .Nutrisi ini mungkin bisa mempengaruhi fisiologis keadaan inokulum dan
menyebabkan hasil yang tidak jelas.
 B. Sifat fisika kimia sianokobalamin
Sifat fisika kimia vitamin B12 adalah hablur atau amorf berwarna merah tua atau serbuk
hablur merah, berbentuk anhidrat, bersifat sangat higroskopis jika terpapar pada udara dan
menyerap air±12%.Vitamin ini agak sukar larut dalam air, larut dalam etanol, tidak larut dalam
aseton, kloroform dan eter. VitaminB12 (sianokobalamin) merupakan senyawa mikroesensial,
karena diperlukan tubuh dalam jumlah relative kecil untuk menjaga kesehatan.Fungsinya adalah
bekerja sebagai kofaktor untuk metabolism enzim, dan bila konsumsinya tidak terpenuhi dapat
menimbulkan gejala defisiensi, seperti penyakit anemia megaloblastik yang disertai gangguan
neurologik.Fungsi vitamin B12 juga terkait dengan fungsi asamfolat, khususnya dalam sintesis
nucleoprotein (DNA) yang normal. Kebutuhan vitamin B12 bagi orang sehat mencapai 1mg/hari,
dan sumbernya adalah jeroan sapi (hati,ginjal,jantung), kuningtelur, susu kering bebas lemak dan
makanan yang berasal dari laut, seperti ikan sardin, kerang dan kepiting. Vitamin B12
mempunyai nama kimia Coa-[a-(5,6-di methyl-benzim idazolyl)] Col3-cyanocobamide,
mempunyai rumus molekul C63H88CoN1P1P, bobot molekul1355, 38.Vitamin B12 termasuk
kelompok senyawa alam dengan struktur mirip derivate porfirin alam dan mengandung mif1eral
Co.Molekul vitamin B12 terdiri dari bagian cincin porfirin dengan satu atom kobalt, basa dimetil
benzimidazol, ribose dan asamfosfat. Satu molekul vitamin B12 tersebut mengandung Co
sebanyak4,35%.
 C. Penetapan uji aktivitas vitamin B12

Baku pembanding yakni sianokobalamin BPFI. Keringkan di atas silika gel P selama 4 jam
sebelum digunakan. Larutan uji : ukur, timbang, serbukkan, masukkan ke wadah yang berisi
larutan pengekstraksi. Tiap g/ml zat perlu 25 ml larutan pengekstraksi anhidrat P dan 1 g natrium
metabisµLfit P dalam air. Panaskan di autoklaf 121˚C selama 10 menit, endapkan , saring,
sentrifus. Encerkan jernih dengan air.
Contoh praktikum 1

LARUTAN BAKU PERSEDIAAN

Timbang Sianokobalamin BPFI, larutkan dalam etanol P 25%, hingga kadar 1 ug per ml.
Simpan dalam lemari pendingin.

LARUTAN PERSEDIAAN MEDIA BASA

Buat media : Campuran dehidrat yang mengandung komponen sama dapat digunakan
dengan syarat ketika dikonstitusi menurut ketentuan yang tercantumpada etiket, memberikan
suatu media yang sebanding dengan yang diperoleh dari formula berikut. Tambahkan menurut
urutan dalam daftar, larutkan L-sistin P dan L- triftopan P dalam asam klorida sebelum
penambhan 8 larutan berikutnya dalam larutan yang diperoleh. Tambahkan 100 ml air, campur,
dan larutkan dekstrosa anhidrat P, natrium asetat P, dan asam askorbat P. Saring, tambahkan
Larutan polisorbat 80, atur pH larutan antar 5,5 dan 6 dengan penambhan natrium hidroksida 1 N
dan tambahkan air murni hingga 250 ml.
L-Sistin P 0,1 g
L-Triptofan P 0,05 g
Asam klorida 1 N 10 ml
 Larutan adenin-guanin-urasil 5 ml
Larutan xantin 5 ml
Larutan vitamin I 10 ml
Larutan vitamin II 10 ml
Larutan garam A 5 ml
Larutan garam B 5 ml
Larutan asparagin 5 ml
Larutan kasein terhidrolisis asam 25 ml
Dekstrosa anhidrat P 10 g
Natrium asetat anhidrat P 5g
Asam askorbat P 1g
Larutan polisorbat 80 5 ml

SEDIAAN SARI TOMAT

Sentrifus sari tomat dalam kaleng yang dapat diperoleh di perdagangan hingga hampir
seluruh daging buah terpisah.Suspensikan bahan penyaring analitik 5 g per liter ke dalam
beningan dan saring.ulangi., hingga diperoleh filtrat jernih berwarna jerami. Simpan di bawah
lapisan toluena dalam lemari pendingin.

MEDIA BIAKAN
Larutkan 0,75 g ekstrak ragi P larut-air, 0,75 g pepton kering P, 1 g dekstrosa anhidrat P dan
0,2 g kalium fosfat monobasa P dalam 60 ml – 70 ml air. tambahkan 10 ml Larutan sari tomat
dan 1 ml Larutan Polisorbat 80. Atur pH larutan 6,8 dengan NaOh 1 N dan tambahkan air hingga
100 ml. Masukkan 10 ml larutan dalam tabung reaksi dan tutup dengan kapas, sterilkan tabung
dan isinya dalam autoklaf 121˚ 15 menit. Dinginkan secepat mungkin.

MEDIA SUSPENSI
Encerkan Larutan persediaan media basal, dengan air sama banyak. Masukkan 10 ml larutan
ke dalam tabung reaksi.Sterilkan dan dinginkan.
BIAKAN PERSEDIAN
Lactobacillus leichmanii. Tambahkan 1 – 1,5 g agar ke 100 ml Media biakan panaskan di
atas tangas uap, diaduk agar melarut. Masukkan 10 ml larutan panas dalam tabung reaksi, tutup
dan sterilkan 121˚ 15 menit dalam aoutoklaf dan biarkan tabung dingin dalam posisi tegak.
InokµLasi dengan cara tusukan tiga tabung dengan biakan murni Lactobacillus leichmannii.
Inkubasi 16 – 24 jam 30˚ - 40˚± 0,5˚, dan simpan di lemari pendingin. Buat biakan segar dalam
agar tegak paling sedikit 3 kali tiap minggu.

INOKULUM
Pindahkan sel dari biakan induk Lactobacillus leichmannii, ke dalam 2 tabung steril
masing-masing berisi 10 ml Media biakan. Inkubasi biakan selam 16 – 24 jam 30˚ - 40˚± 0,5˚,
sentrifus biakan dan enaptuangkan beningan. Suspensikan sel dari biakan dalam 5 ml Media
suspensi steril dan campur. Tepatkan volume dengan Media suspensi setreil hingga enceran
(1:20) dalam larutan NaCl P 0,9% memberikan transmitans 70% jika dukur pada λ 530 nm
menggunakan larutan NaCl P 0,9% sebagai blangko. Buat pengenceran (1:400) suspensi yang
telah diukur menggunakan Larutan persediaan media basal dan gunakan untuk inokulum uji.

KALIBRASI SPEKTROFOTOMETER
Tera λ spektrofotometer secara berkala, menggunakan sel λ baku. Sebelum membaca tiap
pengujian, kalibrasi spektrofotometer untuk transmitans 0% dan 100 % menggunakan air dengan
λ yang diatur pada 530 nm.

PROSEDUR
Bersihkan alat, sterilisasi. Tambahkan dalam tiap tabung dari 2 seri tabung berturut-turut 1,
1,5, 2, 3, 4, dan 5 ml larutan baku. Pada tiap tabung ini dan 4 tabung kosong yang serupa
tambahkan 5 ml larutan persediaan media basall dan air hingga 10 ml. Ke dalam 2 seri tabung
reaksi lain, tambahkan 1, 1,5, 2, 3, dan 4 ml larutan uji. Ke dalam tiap tabung tambahkan 5 ml
Larutan persediaan media basal dan air hingga 10 ml. Letakkan 1 seri tabung berisi larutan baku
dan Larutan uji di dalam satu rak dan seri kedua dalam rak lain atau bagian dari rak, sebaiknya
letakkan urutan tabung secara acak. Tutup tabung untuk menghindarkan kontaminasi bakteri dan
sterilkan di autoklaf 121˚ 5 menit.Dinginkan secepat mungkin untuk menghindarkan
pembentukan media akibat panas berlebih. Tambahkan ke dalam tiap tabung 0,5 ml Inokulum
kecuali 2 dari 4 tabung yang tidak berisi Larutan baku (blangko tidak terinokµLasi). Inkubasi
tabung pada suhu antara 30˚ dan 40˚ pertahankan suhu tetap dalam ±0,5˚ selama 16 jam sampai
12 jam. Hentikan pertumbuhan dengan cara pemanasan pada suhu tidak kurang dari 80˚selama 5
menit. Dinginkan hingga suhu kamar.Goyangkan isinya, dan ukur transmitans dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm.Pengamatan dilakukan beberapa detik setelah
digoyang, bila transmitans tetap selama 30 detik atau lebih. Lakukan pembacaan untuk tiap
tabung dalam selang waktu yang hampir sama. Dengan mengatur transmitans pada 100% untuk
blangko tidak terinokulasi, baca transmitans dari blangko terinokulasi. Jika perbedaan lebih besar
dari 5% atau jika terkontaminasi dengan jasad renik lain abaikan hasil penetapan. Dengan
mengatur transmitans pada 100% untuk blangko tidak terinokulasi, baca transmitans tiap tabung
lain. Abaikan hasil penetapan bila kemiringan kurva baku menunjukkan masalah sensitifitas.

Contoh praktikum 2 :

Bahan dan metode

Organisme L.leichmannii ATCC7830 (USDA strain 313) diperoleh dari American TypeI
Presentaddress: Departemen Mikrobiologi, Scientific Associates, Inc., St.Louis, Mo. Culture
Collection, Washington, D.C. Strain ini adalah auxotroph yang membutuhkan vitamin B12 untuk
pertumbuhan (Hoffmann et al., 1948), dan digunakan dalam metode USP untuk memeriksa
vitamin. L.leichmannii telah ditemukan untuk menanggapi timidin (Skeggs et al., 1948) serta
deoxyribosides lainnya (Kitay, McNutt, dan Snell, 1949).Sediaan yang didinginkan disubkultur
setiap bulan dan disimpan dalam tabung Micro Assay Culture Agar (Difco).Lactobacilli ditanam
dalam tabung yang berisi jumlah 10ml Mikro Inokulum Broth (Difco). Setelah 15 hingga 24 jam
pada 37 C, sel-sel itu disentrifugasi pada 3.000 putaran / menit dalam centrifuge Internasional
(model V atau UV) dan dicuci dua kali dalam air suling steril (deionisasi) atau garam fisiologis
(jumlah 10ml) dengan cara yang sama. Pellet akhir disuspensikan dalam 10 ml B12 Assay Broth
(Difco) (kaldu bebas B12) untuk kelangsungan hidup dan studi pertumbuhan, dengan atau tanpa
inkubasi sebelumnya. Sel-sel juga tersuspensi dalam dekstrosa-air, dan kelangsungan hidup
mereka, serta karakteristik pertumbuhan berikutnya dalam kaldu bebas B12 telah dipelajari.
Inokulum yang dicuci dan disiapkan dalam Micro Inoculum Broth disarankan untuk memperoleh
hasil percobaan yang sinkron.

Jumlah yang layak

Dalam protokol standar yang digunakan dalam setiap contoh, jumlah 1 ml dari bahan uji
diencerkan dengan 10⁻⁶ dalam botol pengenceran yang mengandung 99 ml air suling steril; 0,5
ml pengenceran akhir diuji dalam rangkap dua untuk kemampuan pembentukan koloni dengan
inokulasi ke dalam 10 ml cairan 1,5% Inokulum Mikro agar yang dibungkus dan disimpan dalam
bak air (55 Cc). Agar diinokulasi segera dituangkan ke dalam petri cawan( disposable) dan
dibiarkan gel; tabung lain dari media yang sama digunakan sebagai lapisan atas. Karena
L.leichmannii adalah mikro aerophile, tioglikolat agar tidak diperlukan.Pertumbuhan yang
diperoleh dari koloni terisolasi yang didapatkan dengan baik dalam 48 jam di bawah lapisan
teratas, tetapi kurang jelas tanpa lapisan itu. Jumlah koloni padaplat duplikat jarang berbeda dari
lebih kurang 4%; jumlah yang berbeda lebih kurang 7% tidak termasuk dalam hasil. Semua
inkubasi berada pada 37 C.

Persiapan inokulum
Sel dicuci dua kali dalam air suling steril seperti yang dijelaskan di atas.Pellet akhir sel-sel
kemudian disuspensi kan10 ml air suling steril dan diinkubasi dalam water bath (37 C) selama 45
menit; 0,2 ml kemudian ditambahkan ke 80 ml air suling steril, dan dua 3 tetes dari inokulum
disiapkan yang dilarutkan ditambahkan ke masing-masing tabung uji dengan menggunakan 20
ml tabung steril kaca steril yang dicuci.

Hasil
 Untuk menentukan kelangsungan hidup sel yang dicuci dua kali dalam air suling pada
37 C, pellet akhir disuspensikan dalam 10 ml air suling steril dalam tabung, dan jumlah sel diuji
pada interval. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, tidak ada jumlah sel perubahan yang
signifikan untuk sekitar 45 menit, setelah waktu itu terjadi penurunan tajam ke sekitar setengah
jumlah awal.

Pada Gambar 1. Kelangsungan hidup sel yang dicuci dua kali dalam suling. Hasil yang sama
diperoleh ketika 0,25 Mg per 100 ml dextrose-air digunakan.

Gambar 2. Kelangsungan hidup sel cuci dua kali dalam 10 kaldu bebas B12 pada 37 C.Simbol:
menunjukkan dua percobaan survival yang menunjukkan hampir dua kali lipat jumlah
sel; 0 menunjukkan peningkatan jumlah sel B yang sama bahkan setelah enam kali pencucian.
 Pada sekitar 90 menit,Angka-angka naik turun atau sedikit meningkat, hanya untuk turun ke
tingkat yang lebih rendah setelah 270 menit (tidak ditampilkan). Kelangsungan hidup sel-sel
yang dicuci dua kali dalam kaldu bebas B12 pada 37C dipelajari dengan menangguhkan sel
dalam kaldu dan menguji jumlah survivor pada interval. Gambar 2A dan B menunjukkan bahwa
sel-sel yang dicuci dua kali meningkat dalam angka hingga hampir dua kali lipat jumlah awal
ketika mereka diinkubasi dalam kaldu bebas vitamin B12. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar. 2C, sel memiliki kemampuan yang sama untuk meningkatkan jumlahnya bahkan
setelah enam kali pencucian. Perlu dicatat bahwa kurva berbeda dengan pertumbuhan budaya
yang berbeda. Dalam percobaan lain, sel-sel dicuci seperti di atas, tetapi diinkubasi untuk
berbagai periode waktu pada 37 C dalam air suling steril sebelum disuspensikan dalam kaldu
bebas B12 pada 37 C dan diuji pada interval. (Gambar 3A) Ketika sel-sel dicuci diinkubasi
selama 45 menit dalam air suling sebelum penyemaian dalam kaldu bebas vitamin B12, ada
pembagian sedikit residual setelah angka naik selama 11,5 jam, (Gambar 3B) 30 menit sebelum
inkubasi tidak cukup untuk menguras nutrisi cadangan, dan (Gambar 3C) 60 menit terbukti
merusak dan menghasilkan pola pertumbuhan yang tidak menentu.

gambar 3. Kelangsungan hidup sel yang dicuci dua kali dalam kaldu bebas B12 setelah inkubasi
dalam air suling pada 37 C untuk berbagai periode waktu. Simbol: 0 menunjukkan pola
pertumbuhan setelah 45 menit sebelum inkubasi; A menunjukkan pola setelah 30 menit sebelum
inkubasi; 0 menunjukkan pola setelah 60 menit sebelum inkubasi. Pola setelah 45 menit dari
inkubasi sebelumnya dalam 0,25 mg per 100 ml dekstrosa-air agak mirip dengan yang diperoleh
ketika air suling digunakan selama 45 menit inkubasi.
Ketika sel dicuci dua kali dalam garam fisiologis dan kemudian disuspensikan dalam garam
fisiologis pada 37 C, tidak ada perubahan signifikan dalam jumlah sel selama 270 menit
(Gambar 4A). Sel-selnya menunjukkan sedikit peningkatan jumlah yang pasti setelah dicuci dua
kali dalam garam fisiologis, diinkubasi dalam air garam fisiologis selama 1 jam, dan kemudian
tersuspensi dalam air kaldu bebas vitamin B12 pada suhu 37 C (Gambar 4B).

(A) Kelangsungan hidup sel dicuci dua kali dalam garam fisiologis, tersuspensi dalam yang
sama, dan diinkubasi pada 37 C. (B) Pertumbuhan sel dicuci dua kali dalam garam fisiologis,
diinkubasi dalam yang sama selama 1 jam, dan kemudian ditunda di B12 Kaldu bebas pada suhu
37 C. Hasil dari inkubasi 2 jam dalam salin serupa dengan yang selama 1 jam.
Dalam percobaan serupa lainnya, setelah 2 jam inkubasi, jumlah yang layak diambil selama
periode dalam air kaldu bebas vitamin B12 menunjukkan replikasi yang sama tetapi pasti. Ketika
sel dicuci dua kali dalam air suling, diinkubasi dalam 0,25 mg per 100 ml air dekstrosa selama
45 menit, dan kemudian diresuspensi dalam kaldu bebas B12 pada 37 C, kurva menyerupai yang
diperoleh dalam air suling biasa (Gambar 3A).
Dalam percobaan terakhir, sel dicuci dua kali dalam air suling dan kemudian segera
diunggulkan dalam kaldu Inokulum Mikro (inokulum dicuci) atau diinkubasi dalam air suling
selama 45 menit sebelum penyemaian (inokulum disiapkan). Gambar 5A menunjukkan bahwa,
ketika sel-sel dicuci segera diunggulkan dalam kaldu Micro Inoculum, jumlah sel meningkat
selama 60 menit pertama, menurun selama 60 menit berikutnya, dan kemudian mengalami
pertumbuhan fase logaritmik. Pertumbuhan log ini dicapai segera setelah inokulum yang
diinkubasi diunggulkan dalam kaldu Micro Inoculum (Gbr.5B), menunjukkan bahwa sel-sel
"bertahap" selama periode inkubasi.

Pertumbuhan kaldu Inokulum Mikro sel yang: (A) dicuci dua kali dalam air suling; (B)
dicuci dalam air suling dan diinkubasi selama 45 menit dalam air suling pada suhu 37 C.
Pembahasan

Hasil kami menunjukkan bahwa vitamin B12 atau nutrilites pengganggu lainnya terbawa
pada sel-sel dicuci dari inokulum L. Leichmannii atau disimpan dalam kolam intraseluler
mengubah keadaan fisiologis inokulum dan menyebabkan hasil yang tidak menentu yang sering
dialami dengan tes vitamin B12. Sejak L. leichmannii ATCC 7830 adalah suatu auxotrop
Memerlukan vitamin B12, (Hoffmann et al., 1948), kemampuan sel yang dicuci untuk
bereplikasi dalam kaldu bebas vitamin B12 (Gbr. 2) menunjukkan adanya inokulum vitamin atau
faktor pertumbuhan lainnya (Skeggs et al., 1948; Kitay et al., 1949). Teknik yang serupa dengan
yang dijelaskan oleh orang lain (Aronson dan Spiegelman, 1958; Horowitz, Saukkonen, dan
Chargaff, 1958; Harold, 1963) digunakan. Sel yang dicuci dua kali diinkubasi dalam air suling,
dekstrosa-air, dan garam fisiologis; periode optimal untuk penipisan ditentukan sebagaimana
dinilai oleh ketidakmampuan sel untuk bereplikasi dalam kaldu bebas vitamin B12. Studi
kelangsungan hidup L. leichmannii dalam air suling menunjukkan bahwa jumlah sel turun
hingga hampir setengah jumlah awal setelah sekitar 45 menit (Gambar 1); setelah itu, angka-
angka itu naik turun untuk beberapa waktu, tetapi efek merusak yang terus berlanjut membawa
pengurangan lebih lanjut ke hitungan yang lebih rendah pada sekitar 270 menit. Hanya sedikit
sel yang bertahan hidup di air suling itu ditemukan, bagaimanapun, bahwa selama sekitar 45
menit tidak ada efek buruk pada nomor sel. Ketika sel-sel seperti itu diunggulkan dalam kaldu
bebas vitamin B12, mereka menunjukkan ketidakmampuan untuk bereplikasi sampai tingkat
yang cukup selama hampir 12 jam (Gambar 3A). Perlu dicatat bahwa mencuci sel sebanyak
enam kali tidak dapat membawa ini (Gambar. 2C). Ternyata 45 menit optimal untuk proses
deplesi, sel masih menunjukkan replikasi setelah 30 menit kelaparan dan pengobatan 60 menit
merusak seperti yang ditunjukkan pada (Gambar 1), dengan pola pertumbuhan yang tidak
menentu (Gambar 3C).

Temuan yang menarik adalah 0,25 mg per 100 ml air dekstrosa tidak mengurangi waktu di
mana proses penipisan selesai; pada kenyataannya, hasilnya identik dengan yang diperoleh
dengan air suling (Gbr. 3). Ini mungkin menunjukkan bahwa sumber energi ekstraseluler tidak
diperlukan untuk proses tersebut. Itu tidak mengherankan bahwa kelangsungan hidup sel dalam
garam fisiologis adalah yang terbaik, karena tidak ada penurunan tajam dalam jumlah sel yang
terjadi (Gambar 4A). Namun, inkubasi selama 2 jam tidak cukup untuk menstabilkan inokulum
(Gambar 4B). Ini menghalangi penggunaan saline dalam pekerjaan rutin. Percobaan pada
sinkron menunjukkan bahwa sel-sel yang dicuci tidak "dalam fase" dan memakan waktu sekitar
120 menit sebelum mereka mengalami pertumbuhan logaritmik (Gambar. 5A). Ketika inokulum
yang disiapkan digunakan dalam percobaan yang sama, sel-sel segera memulai pertumbuhan
logaritmik, menunjukkan bahwa sel-sel stabil juga bertahap dalam proses. Dengan metode
persiapan inokulum ini, tes serum vitamin B12 selama lebih dari 1 tahun menunjukkan tidak ada
hasil yang tidak menentu yang sebelumnya dicatat dengan inokulum yang biasa dicuci. Titrasi
asamimetri antara duplikat dan triplicate tube disepakati dengan seksama, dan kurva standar
stabil dan dapat direproduksi. Harus ditunjukkan bahwa sejumlah pengamatan menunjukkan
bahwa uji normal yang dicapai dengan inokulum yang dicuci menunjukkan sedikit, jika ada,
perbedaan dalam jumlah sebenarnya dari vitamin yang diuji. Satu pekerja lain (P. B. Goins,
komunikasi pribadi) menggunakan inokulum yang disiapkan dalam metode turbidimetrik pada
sediaan farmasi juga mencatat konsistensi dalam pembacaan antara tabung duplikat dan kurva
pertumbuhan. Dapat disimpulkan bahwa metode ini menunjukkan janji untuk mencapai
konsistensi dan, oleh karena itu, tes vitamin B12 yang lebih dapat diandalkan dalam serum dan
persiapan komersial. Teknik serupa yang mungkin berguna dengan inokulum mikrobiologi
lainnya sedang diselidiki.
 BAB III
PENUTUP

A. Kesimpulan
Uji ini merupakan kebalikan dari uji anti mikroba atau uji antibiotic yang didasarkan pada
penghambatan pertumbuhan mikroorganisme . Assay vitamin dan asam amino justru didasarkan
pada peningkatan pertumbuhan mikroorganisme.
Sifat fisika kimia vitamin B12 adalah hablur atau amorf berwarna merah tua atau serbuk
hablur merah, berbentuk anhidrat, bersifat sangat higroskopis jika terpapar pada udara dan
menyerap air±12%.Vitamin ini agak sukar larut dalam air, larut dalam etanol, tidak larut dalam
aseton, kloroform dan eter VitaminB12 (sianokobalamin) merupakan senyawa mikroesensial,
karena diperlukan tubuh dalam jumlah relative kecil sangat untuk menjaga kesehatan.Fungsinya
adalah bekerja sebagai kofaktor untuk metabolism enzim, dan bila konsumsinya tidak terpenuhi
dapat menimbulkan gejala defisiensi, seperti penyakit anemia megaloblastik yang disertai
gangguan neurologik.
Uji pentapan aktivitas vitamin B12 Baku pembanding yakni sianokobalamin BPFI.
Keringkan di atas silika gel P selama 4 jam sebelum digunakan. Larutan uji : ukur, timbang,
serbukkan, masukkan ke wadah yang berisi larutan pengekstraksi. Tiap g/ml zat perlu 25 ml
larutan pengekstraksi anhidrat P dan 1 g natrium metabisµLfit P dalam air. Panaskan di autoklaf
121˚C selama 10 menit, endapkan , saring, sentrifus. Encerkan jernih dengan air.

B. Saran
Melalui makalah ini, penulis menyarankan kepada penulis sendiri dan kepada siapaun agar
uji efektifitas vitamin dan asam amino ini bisa bermanfaat bagi semuanya.
 DAFTAR PUSTAKA

Agriyani, 2003/2004, Mikrobiologi Farmasi.

Edi Atmawinata, Drh. 2006. Mikrobiologi Industri. Penerbit Yrama

Natsir, M. Djide. dan Sartini.,2007, Dasar-Dasar Mikrobiologi. UNHAS. Makassar

Natsir, M. Djide. dan Sartini., 2010, Mikrobiologi Klinik. UNHAS. Makassar

Pelczar, M.J., 1986, Dasar-Dasar Mikrobiologi 1, (tejemahan oleh Hadioetomo, R.S., dkk). Mc
Graw-Hill Book Compani

Siti Laila dan Bagod Sudjadi,2007. Biologi SMA.Penerbit Yudhistira. Bandung

Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi
IV.Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta

HOFFMANN, C. E., E. L. R. STOKSTAD, A. L. FRANKLIN, AND T. H. JUKES. 1948.

Response of Lactobacillus leichmannii 313 to the antipernicious anemia factor. J. Biol.
Chem. 176:1465-66.