I.

Pengecatan Gram
A. Tujuan
Mengetahui dan memehami prosedur pewarnaan gram dan mengelompokkan
bakteri ke dalam kelompok gram positif atau bakteri gram negatif serta menentukan
morfologinya.

B. Prinsip
Saat bakteri diwarnai dengan zat pewarna primer (kristal violet), bakteri gram
positif akan menyerap zat warna tersebut sehingga berwarna ungu. Sedangkan bakteri
gram negatif akan melepas zat warna (kristal violet) setelah dicuci dengan alkohol dan
kemudian akan menyerap zat warna terakhir yang diberikan yaitu safranin atau fuchsin
sehingga berwarna merah.

C. Alat, Bahan, dan Reagen

1. Alat-Alat
a. Mikroskop
b. Ose bulat
c. Lampu spiritus
d. Pipet tetes
e. Objek glass
f. Lidi berserabut
2. Bahan
a. Sampel dari media biakan
b. Sampel urin
c. Sampel sputum
d. Sampel kerokan
e. Sampel cairan tubuh (cairan otak, cairan pleura, dll)
3. Reagen
a. Kristal violet / Gentian violet (Cat gram A)
b. Lugol (Cat gram B)
c. Alkohol (Cat gram C)
d. Safranin (Cat gram D)
e. Air
f. Oil imersi
D. Cara Kerja
1. Preparasi Sampel
a. Sampel dari media biakan
1) Diambil objek glass yang bersih dan bebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api spiritus.
2) Setelah dingin, teteskan setetes larutan PZ (secukupnya).
3) Dengan ose steril (telah dipijarkan), ambil satu koloni kuman, campur dengan
larutan PZ sampai homogen, kemudian ratakan dan tipiskan pada objek
gelas sehingga membentuk diameter 1-2 cm.
4) Difiksasikan di atas lampu spiritus (dilewati 2-3 kali).

b. Sampel urin
1) Diambil objek glass yang bersih dan bebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api spiritus, dan biarkan dingin.
2) Sampel urin dihomogenkan.
3) Dengan ose bulat steril (telah dipijarkan), diambil sampel urin, kemudian
ratakan dan tipiskan pada objek gelas sehingga membentuk diameter 1-2 cm.
4) Difiksasikan di atas lampu spiritus (dilewati 2-3 kali).

c. Sampel sputum
1) Diambil objek glass yang bersih dan bebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api spiritus, dan biarkan dingin.
2) Diambil lidi dengan ujung berserabut, lalu diambil sampel sputum dengan
mengutamakan bagian yang terdapat dahak (gumpalan).
3) Dioleskan dan diratakan di atas objek glass membentuk diameter 1-2 cm.
Gumpalan yang tersisa dibuang.
4) Difiksasikan di atas lampu spiritus (dilewati 2-3 kali).

d. Sampel kerokan kulit

1) Diambil objek glass yang bersih dan bebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api spiritus, dan biarkan dingin.
2) Ditetesi larutan PZ secukupnya di atas objek glass.
3) Diambil sampel kerokan kulit pada daerah yang sesuai permintaan dokter.
 Contoh: permintaan cat gram pada sampel kerokan kulit tangan, maka
ditanyakan pada pasien bagian kulit tangan mana yang gatal, lalu diambil
sampel kerokan di bagian tersebut).
4) Dikerok bagian kulit tersebut dengan halus menggunakan ujung objek glass
lain, lalu ditempelkan kerokan yang didapat pada larutan pz tadi sehingga
ujung objek glass menjadi basah. Ulangi kerokan hingga 3 kali, sampai
didapatkan sampel kerokan terlihat pada pz.
5) Dibiarkan mongering, lalu difiksasi di atas lampu spiritus (dilewati 2-3 kali).

e. Sampel Bakteri Index (Kusta)

1) Diambil objek glass yang bersih dan bebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api spiritus, dan biarkan dingin.
2) Bagian cuping telingan pasien dipencet-pencet sampai menguning.
3) Ditusuk menggunakan lanset hingga didapatkan sampel serum.
4) Ditempelkan sampel serum tersebut pada objek glass, lalu dibiarkan
mengering.
5) Difiksasi di atas lampu spiritus (dilewati 2-3 kali).

f. Sampel cairan tubuh (cairan otak, cairan pleura, dll)

1) Diambil objek glass yang bersih dan bebaskan dari lemak dengan cara
memanaskan di atas nyala api spiritus, dan biarkan dingin.
2) Diambil sampel cairan menggunakan mikropipet, lalu diteteskan secukupnya
pada objek glass.
3) Diratakan dan ditipiskan sampel pada objek gelas menggunakan yellow tip
sehingga membentuk diameter 1-2 cm.
4) Dibiarkan mongering, lalu difiksasi di atas lampu spiritus (dilewati 2-3 kali).

2. Pengecatan Gram
a. Preparat ulasan sampel yang telah difiksasi selanjutnya dicat dengan
pengecatan Gram.
b. Diteteskan preparat ulasan sampel dengan cat gram A yang mengandung Kristal
Violet, dan diamkan selama 1 menit. Usahakan cat merata dan mengenai seluruh
permukaan ulasan.
c. Cuci dengan air mengalir secara perlahan-lahan.
 d. Teteskan Mordant atau Lugol Iodine (cat gram B) sampai merata dan mengenai
seluruh permukaan ulasan, diamkan selama 1 menit.
e. Cuci dengan air mengalir secara perlahan-lahan.
f. Teteskan larutan alkohol (cat gram C) sampai merata dan mengenai seluruh
permukaan ulasan, dan diamkan selama 30 detik.
g. Cuci dengan air mengalir secara perlahan-lahan.
h. Teteskan larutan Safranin (cat gram D) sampai merata dan mengenai seluruh
permukaan ulasan, diamkan selama 1 menit.
i. Cuci dengan air mengalir secara perlahan, dan keringkan dengan tisu. Cukup
ditempelkan pada sisi ulasan (tanpa merusak ulasan), biarkan mengering di
udara.
j. Amati di bawah Mikroskop dengan perbesaran 100x lensa objektif dengan oil
imersi.

II. Kultur Urin

A. Tujuan
Untuk mengidentifikasi jenis bakteri penyebab infeksi dari sampel urin dan
menentukan antibiotik yang sesuai untuk keperluan pengobatan pasien.

B. Prinsip Kerja
Penanaman sampel pada media MCA (untuk memperbanyak dan menentukan
golongan kuman) dan pada media Kled (untuk perhitungan jumlah koloni kuman)
disertai dengan tes presumptive gram untuk menentukan langkah tes berikutnya.
Apabila terdapat pertumbuhan koloni pada media MCA, dilanjutkan tes oksidase, hasil
oksidase positif dilanjutkan pada pemilihan kaset TDR One 64, hasil oksidase negative,
dilanjutkan pemilihan kaset TDR NF 64 untuk menentukan jenis bakteri pada sampel
urin dan antibiotik yang sesuai untuk tindakan pengobatan.

C. Alat, Bahan dan Reagen

1. Alat-Alat
a. Objek glass
b. Ose bulat
c. Mikropipet dan tip
 d. TDR Choice (TDR STAPH-64, TDR STR, TDR ONE-64, TDR NF-64)
e. TDR J-100
f. TDR-300 B
g. Inkubator

2. Bahan
a. Sampel urine
b. Media MCA
c. Media BAP
d. Media Kled
3. Reagen
a. Cat gram I, II, III, dan IV
b. Oil Imersi
c. Aquadest

D. Cara Kerja
1. Hari Ke-1
a. Disiapkan alat dan bahan yang digunakan, dan pastikan dalam keadaan
steril.
b. Dihomogenkan sampel urin pasien.
c. Dilakukan pengenceran dengan memipet 200 µl urine dimasukkan ke
dalam 2 ml aquadest (pengenceran 10x), lalu dihomogenkan.
d. Diinokulasi ke media MCA dan media Kled dengan cara yaitu :
1) Dipipet campuran tadi sebanyak 10 µl ke dalam media MCA
(kelebihan sedikit tidak masalah), dan dengan ose steril (telah
dipijarkan) distreak menjadi 4 kuadran tanpa mengenai bagian dinding
plate, lalu media MCA dibalik dan diinkubasi 1x24 jam.
2) Dipipet campuran tadi tepat sebanyak 10 µl ke dalam media Kled, dan
dengan ose steril (telah dipijarkan) distreak pada seluruh permukaan
media Kled tanpa mengenai dinding media, lalu media Kled dibalik
dan diinkubasi 1x24 jam pada suhu 37ºC.
 e. Dilakukan tes presumptif gram untuk mengidentifikasi jenis bakteri apa
yang terdapat pada sampel urin, sehingga menjadi acuan untuk tahap
atau penggunaan kaset yang tepat pada tes berikutnya.
 Diambil sampel urin dengan ose bulat steril (telah dipijarkan), lalu
dioleskan dan ditipiskan pada objek glass sehingga membentuk
ukuran diameter 1-2 cm, dan dikeringkan.
 Difiksasi (dilewatkan di atas nyala api 2- 3 kali).
 Diletakkan diatas bak pengecatan.
 Digenangi dengan cat gram I (gentian violet) selama 1 menit.
 Dicuci di air mengalir secara perlahan.
 Digenangi dengan cat gram II (lugol) selama 1 menit.
 Dicuci di air mengalir secara perlahan.
 Digenangi dengan cat gram III (aceton-alkohol) selama 30 detik.
 Dicuci di air mengalir secara perlahan.
 Digenangi dengan cat gram IV (safranin) selama1 menit.
 Dicuci di air mengalir secara perlahan.
 Dibaca di mikroskop dengan perbesaran lensa objektif 100 kali
dengan oil imersi, dan ditulis jenis bakteri yang ditemukan.

2. Hari ke-2
a. Diidentifikasi semua jenis koloni bakteri yang tumbuh (bentuk, ukuran dan
warna), baik pada media MCA maupun media Kled.
b. Dari masing-masing koloni yang tumbuh di cat gram untuk menentukan
jenisnya dan tetap berpedoman pada hasil test presumtive.
c. Pada media MCA hanya ditumbuhi oleh bakteri gram negative baik dalam
bentuk cocus maupun basil.
1) Jika didapatkan pertumbuhan pada media MCA, maka dilanjutkan
dengan test oksidase dengan kertas oksidase strip.
a) Dipanaskan ujung ose hingga memijar.
b) Diambil koloni yang tumbuh pada media MCA kemudian diletakkan
di atas objek glass.
 c) Digoreskan pada kertas Oksidase Test Strip.
Negatif : Sesuai warna koloni
Positif : Biru tua (biru violet)
2) Jika hasil oksidase positif, maka dilanjutkan dengan penggunaan
kaset TDR 1 64.
3) Jika hasil oksidase negative, maka dilanjutkan dengan penggunaan
kaset TDR NF (golongan non-fermentasi).
d. Pada Media Kled hanya diperuntukkan untuk hitung jumlah koloni kuman.
Peraturan dasarnya, bahwa batas koloni yang diperbolehkan yaitu di
bawah 100.000 (ditemukan 0 koloni), jika melebihi jumlah tersebut, maka
harus dilanjutkan sampai kultur selesai dan didapatkan antibiotic yang
sesuai untuk keperluan pengobatan.
1) Jika ditemukan adanya pertumbuhan koloni kuman, selanjutnya
dihitung dan dikalikan dengan 100.000 (pengenceran dalam CFU/ml),
sehingga didapatkan hasil jumlah koloni kuman pada sampel urin, dan
pengamatan distop.
e. Jika pada media MCA tidak didapatkan pertumbuhan kuman, sedangkan
pada media Kled didapatkan pertumbuhan kuman, dan setelah dicat
gram, terdapat bakteri gram positif (meskipun tidak sesuai presumptive),
maka dilanjutkan isolasi pada media BAP dengan membuat streak 4
kuadran, media dibalik, lalu diinkubasi 1x24 jam pada suhu 37ºC.
1) Dilakukan uji katalase dan koagulase dari setiap koloni yang tumbuh
di media BAP
a) Uji Katalase:
 Dipanaskan ujung ose hingga memijar.
 Diambil koloni yang tumbuh pada media BAP kemudian
diletakkan di atas objek glass.
 Diteteskan dengan H202 dan diperhatikan adanya gelembung gas
yang muncul.
Note: katalase positif (+) : ada gelembung gas
katalase negatif (-) : tidak ada gelembung gas
 b) Uji Koagulase:
 Dipanaskan ujung ose hingga memijar.
 Diambil koloni yang tumbuh pada media BAP kemudian
diletakkan di atas objek glass.
 Diteteskan plasma citrate pasien kemudian dihomogenkan.
Note: koagulase positif (+) :menggumpal
koagulase negatif (-) : tidak menggumpal
f. Semua koloni yang tumbuh di murnikan kembali. (Jika koloni tumbuh di
media BAP dan MCA maka koloni yang dimurnikan hanya koloni pada
media MCA saja ke media MCA yang baru). Kemudian diinkubasi 1x24
jam.

3. Hari ke-3
Dilakukan identifikasi kuman dan sensitivitas antibiotik
a. Jika koloni yang tumbuh di media BAP menunjukkan hasil katalase negatif
(-) maka dilanjutkan ke TDR STR
1) Dibakar ose bulat hingga memijar kemudian ditunggu dingin.
2) Diambil koloni yang sudah dimurnikan dari media BAP kemudian dibuat
suspensi sesuai standar kekeruhan 2,0 Mc Farland di tabung common
biochemistry yang diukur pada alat turbidimetri.
3) Dipipet suspensi tersebut sebanyak 100 µl ke dalam tabung common
susceptibility kemudian dihomogenkan.
4) Letakkan tabung common biochemistry, common susceptibility dan well
TDR STR 64 di alat TDR J-100, maka alat akan memipet suspense dari
tabung common biochemistry secara otomatis pada wel identifikasi
kuman dan tabung common susceptibility untuk wel uji sensitivitas
masing-masing sebanyak 150 µl.
5) Ditambahkan mineral oil sebanyak 3-4 tetes pada well A2 saja.
6) Diinkubasi 1x24 jam.
7) Dibaca pada alat TDR-300 B.
b. Jika koloni yang tumbuh di media BAP menunjukkan hasil katalase positif
(+) maka dilanjutkan ke TDR STAPH-64.
1) Dibakar ose bulat hingga memijar kemudian ditunggu dingin
2) Diambil koloni yang sudah dimurnikan dari media BAP kemudian dibuat
suspensi sesuai standar kekeruhan 0,5 Mc Farland di tabung common
biochemistry yang diukur pada alat turbidimetri.
3) Dipipet suspensi tersebut sebanyak 50-80 µl ke dalam tabung
common susceptibility kemudian dihomogenkan.
4) Letakkan tabung common biochemistry, common susceptibility dan
well TDR STR 64 di alat TDR J-100, maka alat akan memipet
suspense dari tabung common biochemistry secara otomatis pada
wel identifikasi kuman dan tabung common susceptibility untuk wel uji
sensitivitas masing-masing sebanyak 150 µl.
5) Ditambahkan mineral oil sebanyak 3-4 tetes pada well no. A1, A2, dan
A7.
6) Diinkubasi 1x24 jam.
7) Dibaca pada alat TDR-300 B.

c. Jika koloni yang tumbuh di media MCA menunjukkan hasil oksidase

negatif (-) maka dilanjutkan ke TDR ONE 64
1) Dibakar ose bulat hingga memijar kemudian ditunggu dingin
2) Diambil koloni yang sudah dimurnikan dari media BAP kemudian
dibuat suspensi sesuai standar kekeruhan 0,5 Mc Farland di tabung
common biochemistry yang diukur pada alat turbidimetri.
3) Dipipet suspensi tersebut sebanyak 10-20 µl ke dalam tabung
common susceptibility kemudian dihomogenkan.
4) Letakkan tabung common biochemistry, common susceptibility dan
well TDR STR 64 di alat TDR J-100, maka alat akan memipet
suspense dari tabung common biochemistry secara otomatis pada
wel identifikasi kuman dan tabung common susceptibility untuk wel uji
sensitivitas masing-masing sebanyak 150 µl.
 5) Ditambahkan mineral oil sebanyak 3-4 tetes pada well no. A1, B1, C1,
dan A3, A7.
6) Diinkubasi 1x24 jam.
7) Dibaca pada alat TDR-300 B.

g. Jika koloni yang tumbuh di media MCA menunjukkan hasil oksidase positif
(+) maka dilanjutkan ke TDR NF 64.

E. Gambar

Biosafety Cabinet Inkubator

TDR J-100 TDR 300-B