BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uji Fisiologis Bakteri

Mikroorganisme tidak mempunyai varietas dan ciri-ciri anatomi, tidak seperti halnya pada
tumbuhan atau hewan yang mudah dipelajari dalam taksonomi. Masalah yang paling mendasar
di dalam bakteriologi adalah penyembuhan, pembersihan, dan identifikasi dari kultur bakteri.
Identifikasi bakteri didasarkan pada varietas dari karakteristik yang dimiliki oleh bakteri tersebut,
tidak hanya dari morfologi tetapi juga karakteristik kultur mikroorganisme, fisiologi, dan
patogenitas (Seeley & VanDemark, 1971).
Bakteri dapat diidentifikasi dengan mengetahui reaksi biokimia dari bakteri tersebut.
Dengan menanamkan bakteri pada medium, maka akan diketahui sifat-sifat suatu koloni bakteri.
Sifat-sifat suatu koloni tersebut ialah sifat-sifat yang ada sangkut pautnya dengan bentuk,
susunan, permukaan, pengkilatan, dan sebagainya (Dwidjoseputro, D. 1989.)
Bakteri memiliki berbagai aktivitas biokimia dengan menggunakan nutrisi yang diperoleh
dari lingkungan sekitarnya. Transformasi biokimia dapat timbul didalam dan diluar dari bakteri
yang diatur oleh enzim. Setiap bakteri memiliki kemampuan dalam menggunakan enzim yang
dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino, metabolisme ini
biasanya menghasilkan produk yang dapatdigunakan untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri.
Pada prinsipnya pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang
diketahui dari kemampuanmikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang
kompleks danmolekul-molekul sederhana. Selain itu, metabolisme seringkali menghasilkan hasil
sampingan yang dapat digunakan untuk identifikasi (Ramaisyah, 2011).
Uji-uji biokimia yang biasanya dipakai dalam kegiatan identifikasi bakteri atau
mikroorganisme yang antara lain, uji TSIA, uji Voges-Proskauer, uji Merah Metil, uji Indol dan
lain-lain. Pengujian biokimia merupakan salah satu hal yang sangat pentingdalam dunia
mikrobiologi (Lim, 1998).
2.1.1 Uji Karbohidrat
Uji TSIA (triple sugar iron agar) digunakan untuk membedakan kelompok atau genus
Enterobacter, perbedaan tersebut didasarkan atas perbedaan dalam fermentasi karbohidrat dan
produksi hidrogen sulfida oleh beberapa kelompok bakteri intestinal. (Cappucino, 2001).
 Pada uji TSIA warna media slant berubah menjadi merah karena bakteri bersifat basi
menandakan bahwa bakteri ini tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Pembentukan gas
positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar.
Pembentukan H2S positif ditandai dengan adanya endapan berwarna hitam, endapan ini
terbentuk karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan
menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe+ yang terdapat pada media dan
menghasilkan endapan hitam(Anonim, 2008)
Pada media daerah butt media berubah berwarna kuning ini menandakan bakteri
memfermentasi glukosa. Untuk pengamatan pola-pola pengunaan karbohidrat. TSIA agar
mengadung laktosa dan sukrosa dalam konsentrasi 1%, glukosa 0,1% dan phenol red sebagai
indicator yang menyebabkan perubahan warna dari merah orange menjadi kuning dalam suasana
asam. TSIA juga mengandung natrium trisulfat, yaitu suatu substrat untuk penghasil H2S, ferro
sulfat menghasilkan FeS (precipitat), bewarna hitam untuk membedakan bakteri H2S dengan
bakteri-bakterinya(Anonim, 2008)
Sebagian besar mikroorganisme memperoleh energi dari substrat berupa karbohidrat yang
selanjutnya di fermentasi menghasilkan asam-asam organik (seperti asam laktat, format, asetat),
dengan disertai atau tidak disertai pembentukan gas. Organisme-organisme yang berbeda akan
menggunakan karbohidrat/gula-gula yang berbeda tergantung dari komponen enzim yang
dimilikinya. Perbenihan gula-gula digunakan untuk melihat adanya pembentukan asam yaitu
dengan adanya perubahan warna indikator (merah fenol atau biru bromtimol) yang terdapat
dalam perbenihan menjadi kuning yang sebelum ditanami berwarna merah (indikator merah
fenol) atau berwarna biru (indikator biru bromtimol) serta untuk pembentukan gas, yaitu dengan
terlihatnya udara di dalam tabung peragian/fermentasi (tabung durham). Jenis karbohidrat yang
digunakan pada uji fermentasi karbohidrat antara lain: Sukrosa, Laktosa, Maltosa, Manitol.
Glukosa dapat langsung masuk dalam jalur fermentasi tahap pertama. Sedangkan, sukrosa,
laktosa mantol, dan maltosa akan di hidrolisis terlebih dahulu menjadi monosakarida
penyusunnya. Laktosa dihidrolisis menjadi galaktosa dan glukosa. Monosakarida jenis manosa
dan galaktosa terlebih dahulu akan diubah menjadi glukosa melalui reaksi epimerisasi.
Sedangkan fruktosa akan diubah terlebih dahulu menjadi fruktosa 6-fosfat dan kemudian
fruktosa 6-fosfat diubah menjadi glukosa 6-fosfat. Glukosa 6-fosfat dan glukosa hasil epimerisasi
galaktosa dan manosa akan masuk dalam tahap awal proses fermentasi untuk menghasilkan asam
piruvat, asam asetat dan CO2 dan kemudian pada tahap kedua fermentasi asam piruvat dan asam
asetat di reduksi kembali oleh atom hidrogen yang dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk
asam laktat dan etanol (Volk dan Wheeler, 1993).
2.1.2 Uji Sitrat
Dengan manggunakan medium citrate menurut Simmon, merupakan medium padat yang
terdiri dari mono ammonium fosfat, Na citrate, NaCl, air , agar-agar, dan indicator Bromtymol
blue. Pada uji ini medium yang tadinya berwarna hijau kebiruan, bila bereaksi positif maka akan
berubah menjadi berwarna biru terang. Bila rekasi negative, maka akan tetap berwarna hijau
kebiruaan (Dwijoseputro, 1989)
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat
sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini digunakan medium Simmon’s
citrate agar yang merupakan medium sintetik dengan trinatrium sitrat sebagai satu-satunya
sumber karbon, amonium (NH4+) sebagai sumber nitrogen dan brom timol biru sebagai
indikator pH. Bila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat, maka asam akan dihilangkan
dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan mengubah warna medium dari
hijau menjadi biru. Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa
mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, sedangkan
pada medium sitrat koser kemampuan menggunakan sitrat ditunjukkan oleh kekeruhan yang
menandakan adanya pertumbuhan mikroba.(Anonim,2012)
Pada uji citrat menggunakan enzim sitrat sintase. Penanaman dalam medium Simmon’s
citrate agar (SCA) dimaksudkan untuk mengetahui apakah senyawa sitrat dapat dipakai sebagai
satu-satunya sumber karbon bagi mikorganisme. Dalam medium ini digunakan trinatrium sitrat
sebagai sumber karbon. Bila trinatrium sitrat ini dapat diuraikan maka amonium dihidrogenfosfat
turut teruraikan dan akan melepaskan NH4+ sehingga menyebabkan medium menjadi alkalis,
dan indikator brom timol biru berubah dari hijau menjadi biru. .(Anonim,2012)
2.1.3 Uji SIM
Hasil yang diperoleh pada uji SIM adalah positif, hal ini terlihat adanya penyebaran yang
berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini menunjukan adanya pergerakan dari
bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri ini memiliki flagella. Dari uji juga
terlihat ada warna hitam, yang berarti bakteri ini menghasilkan Hidrogen Sulfit (H2S) (Anonim,
2008)
2.1.4 Uji Katalase
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui
apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat dan
digunakan untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme untuk menguraikan hidrogen
peroksida dengan menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang memerlukan oksigen
manghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun
mereka dapat tetap hidup dengan adanya anti metabolit tersebut karena mereka menghasilkan
enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen. Enzim
merupakan katalisator sejati, dimana molekul ini meningkatkan dengan nyata kecepatan reaksi
kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat lambat. Enzim tidak dapat mengubah
titik keseimbangan reaksi yang dikatalisnya, enzim juga tidak akan habis dipakai atau diubah
secara permanen oleh reaksi-reaksi ini. Enzim merupakan biokatalis yang berfungsi untuk
membantu proses metabolisme. Enzim memiliki kemampuan untuk mengkatalisis suatu reaksi.
Suatu enzim adalah suatu katalis biologis. Hampir tiap rekasi biokimia dikatalis oleh enzim.
Enzim merupakan katalis yang lebih efisien daripada kebanyakan katalis laboratorium atau
industri. Enzim juga memungkinkan suatu selektivitas pereaksi-pereaksi dan suatu pengendalian
laju reaksi yang tidak dimungkinkan oleh kelas katalis lain. Kespesifikan enzim disebabkan oleh
bentuknya yang unik dan oleh gugus-gugus polar (atau nonpolar) yang terdapat dalam struktur
enzim tersebut. Beberapa enzim bekerja bersama suatu kofaktor non protein, yang dapat berupa
senyawa organik maupun anorganik. Hidrolisis Gelatin terdapat enzim-enzim yang menguraikan
golongan potein disebut protenase/protease, kedua nama ini dianggap sinonim. Contoh pada
hidrolisis gelatin dimana protein diperoleh dari hidrolisis kalogen, yaitu zat pada jaringan
penghubung dan tendon dari hewan. Gelatin akan terurai oleh mikrobia yang mensintesis enzim
proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair pada suhu ruang atau suhu kamar dan padat apabila
berada di dalam refrigerator. Dan apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikroba, maka akan
tetap bersifat cair (Hadioetomo, 1993).
2.1.5 Uji MR
Uji MR dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah ditambahkan
methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses
fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada
media akan menurunkan pH sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil
ditambahkan pada biakan tersebut dengan pH serendah itu maka indikator tersebut menjadi
merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran.
Pada kaldu gula yang berisi tabung Durham, dapat diketahui kemampuan
mikroorganisme untuk memfermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi fermentasi tidak
diketahui. Dalam praktikum digunakan media MR-VP untuk mengetahui fermentasi asam
campuran atau fermentasi butanadiol.
Uji methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran.
Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat
asam sehingga akan menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah.
Penambahan indikator pH ”methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam.
Methyl Red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam
lingkungan dengan pH 6.2.
Fermentasi asam campuran ditentukan dengan cara menumbuhkan mikroorganisme
dalam kaldu yang mengandung glukosa, dan setelah masa inkubasi menambahkan reagens
methyl red ke dalam kaldu. Bila terjadi fermentasi asam campuran kaldu biakan akan tetap
berwarna merah. Bila tidak terjadi fermentasi asam campuran maka kaldu biakan berubah
menjadi kuning setelah penambahan reagens methyl red. Uji ini sangat berguna dalam
identifikasi kelompok bakteri yang menempati saluran pencernaan.
2.1.6 Uji VP
Uji VP dengan hasil negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah
ditambahkan α-napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini bukan asetil metil
karbinol (asetolin) (Anonim2, 2008).
Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang melaksanakan fermentasi
2,3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3-butanadiol sebagai produk
utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40%
KOH dan 5% larutan alphanaphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin
(asetilmetilkarbonil), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2,3-butanadiol. Pada penambahan
KOH, adanya asetoin ditunjukan adanya perubahan warna kaldu menjadi merah muda.
Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alpha-naphtol. Perubahan warna
kaldu biakan lebih jelas pada bagian yang berhubungan dengan udara, karena sebagian 2,3-
butanadiol dioksidasikan kembali menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi.
Berdasarkan hal ini tabung yang berisi kaldu dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup
tabungnya dan dimiringkan di atas meja.
Uji Voges-Proskauer sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk mengetahui
adanya 2,3-butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga uji VP absah untuk
menentukan adanya 2,3-butanadiol.

2.2 Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling
penting dan luas di gunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri
yang sudah terfiksasi di kenai larutan-larutan berikut zat pewaraan Kristal violet, larutan yodium,
larutan akohol(bahan pemucat) dan zat pewarnaan tandinganya berupa zat warna safranin atau
air fucshin. Metode ini di beri nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian
Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri Klebsiela, pneumonia. Bakteri yang telah diwarnai dengan metode ini
dibagi menjadi dua kelompok yaitu, bakteri gram positf dan bakteri gram negatif. Bakteri garam
positif akan memprtahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna
ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna Kristal
violet setelah dicuci dengan alkohol dan sewaktu diberi zat pewarna tandingnya yaitu dengan zat
pewarn air fucshin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini di sebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya (Pelczar, 2007).
Bakteri gram positif adalah bakeri yang mempertahankan zat warna metal ungu sewaktu
proses pewarnaan gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop
sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi
antara kedua jenis bakteri ini terutama berdasarkan pada perbedaan struktur dinding sel
bakteri .Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat metal ungu pada
metode pewarnaan gram. Bakteri gram-positif akan mempertaahankan warna ungu gelap setelah
di cuci dengan alkohol. Sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan gram suatu
pewarnaan penimbal (conterstain)di tambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri
gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini perbedaan struktur dinding selnya. Banyak spesies
organisme inang, sifat pathogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding
sel gram-negatif terutama lapisan lipopolisakarida (Pelczar, 2007).

DAFTAR PUSTAKA
Anonim,2008:http://hafizluengdaneun.multiply.com/journal/item/1/Laporan_Koasistensi_Mikro
biologi_ Diakses hari selasa, Pukul 11.45, Samarinda
Anonim, 2012:http://indigoe-99.blogspot.com/2012/05/uji-citrat-citrat-permiase.html
Dwidjoseputro, D. 1989. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
Hadioetomo. 1993. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika, Jakarta.
Lim, D. 1998. Microbiology. WCB Mcgraw-Hill. Missouri.
Pelczar, M.J.2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta : UI Press
Ramaisyah. Aktifitas Biokimia Mikroorganisme .http://rgmaisyah.wordpress.com/2009/05/10/
aktivitas-biokimia mikroorganisme/.
Seeley, H. W., dan P. J. VanDemark. 1971. Microbes in Action A Laboratory
Manual Of Microbiology. W. H. Freeman and Company: San Fransisco
Volk and Wheleer. 1993. Analisis Praktikum Mikrobiologi Umum untuk Perguruan Tinggi. UGM
Press, Yogyakarta.