TEKNOLOGI

DNA REKOMBINAN
oleh
Isna Rahma Dini
 DNA dan RNA
DNA atau Asam deoksiribonukleat
(Deoxyribonucleic Acid) terdiri dari molekul gula
pentosa (deoksiribosa), gugus posfat, dan basa
nitrogen.
RNA atau asam ribonukleat (Ribonucleic Acid)
terdiri dari gula pentosa (ribosa), gugus fosfat,
dan basa nitrogen.
Basa nitrogen terdiri dari purin (Adenin &
Guanin), dan Pirimidin (Citosin & Timin pada
DNA), (Citosin & Urasil pada RNA)
Perbedaan struktur gula DNA dan RNA
 Tabel Perbedaan DNA dan RNA
Sifat yang DNA RNA
membedakan
Gula penyusun Deoksiribosa Ribosa
Bentuk Ikatan ganda Ikatan tunggal
Ikatan tunggal
Basa Purin Guanin Adenin Guanin, Adenin
Basa pirimidin Citosin, Timin Citosin, Urasil
Jenis/ macam Hanya 1 macam Terdapat 3 macam :
mRNA, tRNA, rRNA
Tempat Inti sel Inti sitoplasma dan
ribosom
Kadar Tetap Berubah, tergantung
sintesis protein
Basa Nitrogen
Ujung 5’P Rantai Polinukleotida
DNA

Basa Nitrogen

Gula Posfat

Ikatan posfodiester
Ujung 3’OH
Untai ganda DNA
 Teknologi DNA Rekombinan atau Rekayasa Genetika

Teknologi DNA rekombinan adalah suatu teknik yang

memungkinkan penggabungan dua molekul DNA yang berbeda
dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor
sehingga dapat terintegrasi dan mengalami perbanyakan di
dalam suatu organisme lain yang berperan sebagai inangnya.

Manfaat dilakukan DNA rekombinan

1. Memberikan pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme
kontrol dalam mengisolasi dan segmen gen yang diperoleh
sehingga nantinya dapat membantu dalam pemetaan genom
dari organisme tersebut.
2. Melalui teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen
tertentu seperti enzim, antibiotik, dan hormon dalam waktu
lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara
konvensional sehingga dapat memecahkan masalah biologis
dalam kehidupan.
LANGKAH DALAM REKAYASA GENETIKA
• Isolasi gen target yang akan diklon
• Isolasi DNA vektor
• Manipulasi DNA
- Pemotongan molekul DNA
- Penggabungan molekul DNA
• Penyisipan fragmen DNA untuk menghasilkan
DNA rekombinan
• Transformasi ke bakteri
• Seleksi bakteri rekombinan
 KLONING DNA
Sumber DNA Vektor kloning

Pemotongan
DNA target Pemotongan
enzimatik
dengan enzim

Vektor DNA

Penyisipan DNA target

pada vektor

Konstruksi DNA

DNA kloning dimasukkan ke sel inang

Isolasi sel yang membawa DNA kloning

Sel inang

Protein yang dihasilkan dari DNA Produksi protein dari DNA kloning
kloning
 Enzim restriksi
• Enzim restriksi merupakan enzim yang akan
spesifik memotong DNA beradasarkan urutan
tertentu, endonuklease “blunt end (ujung
tumpul)” vs. “sticky end (ujung lancip)”
• Pemotongan terbatas pada sekuen yang
spesifik, 4-6 bp (base phair = pasang basa)
dan palindrom
• Terdapat lebih 800 enzim restriksi yang telah
diketahui
Penggolongan enzim restriksi ;
 Tipe I
- Dapat mengenali urutan pasangan nukleotida secara
spesifik
- random/tidak tepat tempat pemotongannya
- Tidak efektif untuk aplikasi rDNA
 Tipe II
- Dapat memotong untai DNA pada tempat pengenalan yang
spesifik
- Digunakan secara luas untuk prosedur biologi molekular
- Urutan DNA = simetris
 Type III
- Multisubunit, endonuklease dan methylase sekitar 25 bp dari
urutan yang diakui
- Membaca sama dalam arah 5„ 3' pada kedua urutan untai
= palindrom
- Beberapa enzim menghasilkan "ujung tumpul" (dipotong di
tengah) dan menghasilkan “ujung lancip"
Situs pemotongan DNA oleh Enzim Restriksi
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
 Sekuen pengenal enzim restriksi
Enzim Situs pengenal Tipe pemotongan
EcoRI G↓A-A-T-T-C 5‟ phosphate extension
C-T-T-A-A↑G
BamHI G↓G-A-T-C-C 5‟ phosphate extension
C-C-T-A-G↑G
PstI C-T-G-C-A↓G 3‟ hydroxyl extension
G↑A-C-G-T-C
Sau3AI ↓G-A-T-C 5‟ phosphate extension
C-T-A-G↑
PvuII G-T-T↓A-A-C Blunt end
C-A-A↑T-T-G
HpaI G-T-T ↓A-A-C Blunt end
C-A-A↑T-T-G
HaeIII G-G ↓C-C Blunt end
C-C↑G-G
NotI G↓C-G-G-C-C-G-C 5‟ phosphate extension
C-G-C-C-G-G-C↑G
 Enzim Ligase
Enzim ligase merupakan enzim yang dapat
menggabungkan dua fragmen DNA secara kovalen
dengan membentuk ikatan fosfodiester dari fosfat-gula
pada tulang punggung DNA.
Terdapat 2 sumber enzim DNA ligase
1. Enzim yang dihasilkan oleh bakteri Escherichia coli
yang terinveksi virus T4 disebut T4 DNA ligase
2. Enzim yang dihasilkan oleh bakteri E.coli sendiri
disebut E.coli DNA ligase
Perbedaan dari kedua enzim tersebut adalah kofaktor
yang digunakan untuk reaksi pembentukan tersebut.
T4 DNA Ligase  ATP (Adenosine Triphosphate)
E.Coli DNA ligase  NADH (Nicotinamide Adenine
Dinucleotide)
 Vektor
Terdiri dari beberapa macam dan kemampuan
dalam membawa gen target
1. Plasmid  1,2 – 3 KB (KB = kilo basa)
2. Virus Lambda Bakteriofage  15 KB
3. Cosmid  45 KB
4. YAC (Yeast Artificial Chromosome) dan BAC
(Bacterial Artificial Chromosome ) 100 KB – 10
MB (MB = mega basa)

1 KB = 1.000 pasang basa

1 MB = 1.000.000 pasang basa
 Vektor Plasmid
Plasmid yaitu molekul DNA ekstra
kromosom berukuran kecil dan
berbentuk sirkular yang terdapat
pada bakteri atau yeast.
Syarat suatu plasmid sebagai vektor:
• Berukuran kecil
• Susunan DNA diketahui
• Harus mempunyai jumlah kopi
yang banyak di dalam sel inang
• Memiliki titik Ori
• Memiliki marker seleksi
• Memiliki marker seleksi kedua
yang berguna untuk tanda bila
plasmid disisipkan gen asing.
• Memiliki situs restriksi yang unik
sebagai tanda untuk menyisipkan
gen asing.
Contoh konstruksi vektor plasmid
 Gen Lac-Z
“Gen Lac-Z merupakan salah satu gen yang terdapat
pada plasmid bakteri. Apabila bakteri tersebut
ditumbuhkan pada media yang mengandung X-gal
dan IPTG maka akan membentuk koloni bakteri
berwarna biru. Ketika gen Lac-Z rusak karena
adanya penyisipan gen target maka koloni bakteri
yang tumbuh pada media yang mengandung X-gal
dan IPTG berwarna putih.”
Hal inilah yang menjadi dasar kloning DNA pada
plasmid
 Transformasi ke Bakteri
Transformasi merupakan proses masuknya
molekul DNA ke dalam sel bakteri yang
kompeten.
Teknik transformasi yang dilakukan :
• Sel kompeten dan DNA diinkubasi bersama di
CaCl2 pada 0oC, kemudian di heat shock pada
42oC
• Hanya sedikit DNA yang dapat diambil
Keunggulan menggunakan Prokariot dalam
transformasi gen

1. Pertumbuhannya cepat
2. Mudah dimanipulasi
3. Masih sedikit teknologi eukariot khususnya
mengenai fase Embryonic

Kelemahan menggunakan prokariot

1. Tidak dapat menyambungkan intron dari luar

2. Intron dibutuhkan untuk ekpresi yang baik
3. Ukuran DNA yang dapat diletakkan pada bakteri
terbatas
4. Prokariot bukan protein glikolisat
 SELEKSI BAKTERI PEMBAWA DNA
REKOMBINAN
2 cara seleksi bakteri
rekombinan:
a. Resistensi terhadap
antibiotik
Antibiotics: molekul yang
dihasilkan oleh
mikroorganisme yang dapat
membunuh mikroorganisme
lain. Cth : peniciline,
tetracycline, ciplroflaxine

b. Menggunakan substansi
kromogenik
Salah satunya screaning
koloni putih biru
 SELEKSI BAKTERI REKOMBINAN

Terdapat tiga kemungkinan yang terjadi pada sel

bakteri kompeten setelah transformasi untuk
dilakukan seleksi bakteri rekombinan :
1. Sel kompeten tidak kemasukan molekul DNA
apapun
2. Sel kompeten kemasukan DNA vektor yang
tidak membawa gen X
3. Sel kompeten kemasukan DNA vektor yang
membawa gen X (yaitu DNA rekombinan)
 Cara mengidentifikasi 3 kemungkinan tersebut
Cawan B
Cawan C
Cawan A Berisi NA dan
Berisi NA, antibiotik,
Berisi NA antibiotik, X-gal, dan
X-gal dan IPTG
IPTG

. . . . . .
. . . . . . . . .
. . . .. .
..
Jumlah koloni cawan B Gen Lac-Z yang disisipi
dan C sama akan oleh gen X rusak
Koloni bakteri tumbuh tetapi koloni biru karena bereaksi
banyak karena tidak menandakan bahwa dengan X-gal dan
ada antibiotik gen X tidak tersisipi di IPTG sehingga koloni
dalam vektor berwarna putih
 Koloni Biru (Tidak
ada gen target
yang tersisipi
dalam vektor
plasmid)

Koloni putih (ada

gen target
tersisipi dalam
vektor plasmid)
Regulasi Operon gen Lac- Z Pada Bakteri
 BAHAYA HAYATI TEKNOLOGI
DNA REKOMBINAN
DNA-rekombinan pada sumber beragam
(virus, bakteri) dapat mengarah pada
penciptaan bentuk DNA baru yang dapat
menular pada sifat hayati yang tidak dapat
diperkirakan sebelumnya.
Pada proses industri, DNA rekombinan
dengan bentuk DNA baru kurang diketahui
ciri-ciri khasnya
PENCEGAHAN BAHAYA HAYATI
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
 Menghindari kontaminan yang disebakan
oleh konstruksi plasmid bakteri baru yang
memiliki sifat mampu mereplikasi diri secara
otonom yang dapat menyebabkan munculnya
perbedaan genetik bagi resistensi
antibiotik/pembentukan toksin bakteri.
 Menghindari penyambungan segmen DNA
virus onkogenik (penginduksi kanker) pada
fragmen DNA rekombinan yang dapat
mereplikasi secara otonom sehingga mudah
disebarkan pada populasi bakteri yang ada
dalam tubuh manusia maupun spesies lain
 Definisi
Ikatan Fosfodiester adalah ikatan yang
menghubungkan antara gula pada suatu
nukleotida dengan gula pada nukleotida
berikutnya.
Ikatan hidrogen adalah ikatan yang
menghubungkan antara dua atom hidrogen
Operon adalah sekelompok gen yang
berdampingan yang membentuk satu molekul
tunggal mRNA