OUTLINE

PENGHAMBATAN FAKTOR VIRULENSI Pseudomonas aeruginosa OLEH FRAKSI

PARTISI DAUN MENGKUDU (Morinda citrifolia L.)

M. Rizky Muzakki / M0416027

I. LATAR BELAKANG
Infeksi bakteri merupakan salah satu penyebab munculnya penyakit pada
banyak makhluk hidup. Pengobatan penyakit akibat infeksi bakteri tersebut adalah
dengan antibiotik. Sebagai lini pertama dalam mengobati infeksi, antibiotik yang
biasanya digunakan adalah ampisilin, amoksisilin, dan kotrimksazol. Namun,
penggunaan antibiotik yang tidak tepat justru dapat mengembangkan kemampuan
resistensi bakteri terhadap antibiotik. Mekanisme resistensi bakteri terhadap
antibiotik dapat terjadi karena adanya mutasi gen dan penularan resistensi dari
bakteri lain melalui konjugasi. Mutasi gen menyebabkan suatu bakteri mensekresi
enzim untuk menginaktifkan antibiotik, melisiskan organel sel yang menjadi
sasaran antibiotik, memblokade tempat masuknya antibiotik, dan menghasilkan
sistem pemompa untuk mengeluarkan antibiotik yang sudah masuk (Mustika,
2009).
Seiring dengan menyebarnya sifat resistensi bakteri terhadap antibiotik, usaha
pengembangan penanggulangan dan pengobatan infeksi di luat antibiotik terus
dilakukan. Salah satunya terobosan tersebut adalah dalam pengembangan
penghambatan sistem quorum sensing bakteri. Quorum sensing merupakan suatu
sistem komunikasi dan koordinasi bakteri dalam berekspresi, di mana sistem ini
bersifat dependen terhadap populasi. Quorum sensing berperan dalam mengontrol
virulensi bakteri terhadap organisme lain melalui kemampuannya dalam merasakan
besar populasi bakteri dengan molekul pensinyalan atau autoinducer. Molekul-
molekul ini diproduksi dan diterima pada tingkat basal sel bakteri. Dengan densitas
populasi bakteri yang tinggi, maka molekul autoinducer yang dikeluarkan ke
lingkungan juga lebih banyak. Molekul pensinyalan tersebut lalu masuk kembali ke
dalam sel di mana akan terjadi regulasi terhadap ekspresi gen yang berkaitan dengan
virulensi bakteri tersebut. Berdasarkan sistem tersebut, mulai banyak peneliti yang
mengembangkan metode yang dapat menghambat sistem quorum sensing yang
 diharapkan dapat merusak komunikasi antar sel bakteri dan mencegah massa
bakteri untuk berkumpul, sehingga faktor-faktor virulensi bakteri pun tidak
terekspresi (Adonizio, 2008).
Pseudomonas aeruginosa merupakan bakteri patogen oportunis yang mampu
mengekspresikan faktor virulensi di bawah pengontrolan sistem quorum sensing.
Bakteri P. aeruginosa merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit, khususnya
penyakit infeksi nosokomial. Bakteri ini memanfaatkan kerusakan pertahanan
tubuh inang yang rendah untuk memulai infeksinya. Beberapa infeksi yang
disebabkan P. aeruginosa adalah infeksi saluran pencernaan, infeksi tulang, infeksi
saluran kencing, dan infeksi sistemik (Mayasari, 2005).
Dalam pengembangan sistem anti quorum sensing, dapat dikembangkan dari
berbagai senyawa aktif yang diperoleh dari bahan alam. Berdasarkan skrining awal
dari ekstrak etanol daun talok, diketahui bahwa ekstrak tanaman tersebut
mempunyai aktivitas anti quorum sensing dari P. aeruginosa (Kuntidewi, 2011).
Selain daun talok, daun mengkudu juga diduga memiliki aktivitas anti quorum
sensing. Daun mengkudu (Morinda citrifolia L.) mengandung 5 glikosida flavonol
yaitu: kuersetin-3-O-β-D-glukopiranosida; kaemperol-3-O-α- L-ramnopirosil-
(1→6)-β-D-glukopiranosida; kuersetin-3-O- α-L-ramnopirosil(1→6)-β-D-
glukopiranosida; kuersetin-3- O-β-D-glukopiranosil-(1→2)-[α-L-ramnopiranosil-
(1→6)-β- D-glukopiranosida; dan kaemperol-3-O-β-D-glukopiranosil (1→2)- [α-
L-ramnopiranosil-(1→6) β-D-galakopiranosida (Sang dkk., 2005). Senyawa-
senyawa polifenol seperti senyawa-senyawa flavonoid (termasuk flavonol) mampu
menghambat autooksidasi melalui mekanisme penangkapan radikal (radical
scavenging) dengan cara menyumbangkan satu elektron dari elektron yang tidak
berpasangan dalam radikal bebas sehingga banyaknya radikal bebas menjadi
berkurang (Pokorny dk., 2001). Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian in
bertujuan untuk mengetahui pengaruh fraksi partisi daun mengkudu (Morinda
citrifolia L.) terhadap ekspresi faktor virulensi bakteri P. aeruginosa berbasis
sistem quorum sensing.

II. METODE
1. Ekstraksi daun mengkudu
Sebanyak 1 kg daun mengkudu yang telah diserbuk ditambah 5 liter etanol, lalu
dicampur homogen sambil sesekali diaduk. Proses selanjutnya yaitu didiamkan
 4 hari, disaring, kemudian diuapkan, dan ekstrak etanol dilarutkan dalam
akuades. Lalu, dari ekstrak etanol yang ada dibagi dua dan dilakukan partisi
dengan kloroform dan etil asetat. Partisi dengan kloroform akan menghasilkan
fraksi larut dan fraksi tidak larut, begitu pula pada partisi dengan etil asetat yang
menghasilkan fraksi larut dan fraksi tidak larut.
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Noda dibuat dari ekstrak kasar sebanyak 1 µl pada plat kromatografi lapis tipis
fasa terbalik. Pemisahan untuk visualisasi dari tiga pita dari tiap noda dilakukan
dengan fase gerak 80:20 ACN/H2O yang mengandung 0,1% asam format. Noda
besi (III) klorida 1% diaplikasikan pada setengah plat sebagai indikator fenolik.
Sisi lainnya dilapisi dengan agar yang mengandung strain biomonitor untuk
mengindikasikan aktivitas anti quorum sensing.
3. Persiapan kultur Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa diinokulasikan pada media LA miring sebagai kultur
stok dan disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 5oC . Selanjutnya kultur
P. aeruginosa dari LA miring ditumbuhkan secara aseptis ke dalam LA plate
pada suhu 37 0C selama 24 jam. Sebanyak 1 koloni bakteri dari LA plate
diinokulasikan ke dalam media LB broth dan diinkubasi pada suhu 37 0C
selama 12 jam.
4. Pengukuran pertumbuhan bakteri P.aeruginosa
Pengujian ini bertujuan untuk mengukur pertumbuhan bakteri dengan metode
spektrofotometri pada panjang gelombang 600 nm. Tahapan ini diawali dengan
meresuspensi kultur bakteri yang berusia 12 jam ke dalam media LB Broth
dengan pengenceran 100 kali. Pengukuran pertumbuhan P.aeruginosa
dilakukan mulai jam ke-0 sampai dengan jam ke-24 dengan interval waktu 2
jam. Setelah OD 1,7, media LB dibagi menjadi 3 perlakuan yaitu kontrol,
kontrol dengan CMC, dan penambahan ekstrak daun talok 1 mg/ ml. Saat
masuk jam ke -18 setelah pengenceran, kultur bakteri dalam media LB maupun
AB disentrifugasi dengan kecepatan 5000 xg (3750 rpm) sehingga diperoleh
supernatan. Supernatan dari media LB digunakan untuk pengujian aktivitas
protease dan kadar protein. Sedangkan supernatan dari media AB digunakan
untuk pengujian aktivitas elastase.
5. Uji Penghambatan Faktor Virulensi dari P. aeruginosa
Pada fraksi terpilih, dilakukan uji-uji berikut:
a. Penentuan kadar protein
Pengukuran total protein ditentukan melalui metode Bradford (1976)
dengan menggunakan Bovine Serum Albumin (BSA) sebagai larutan
standar protein. Konsentrasi awal larutan BSA adalah 0,3 mg/ml. Kemudian
larutan BSA dibuat menjadi beberapa konsentrasi yaitu 0.06, 0.12, 0.18,
0.24, dan 0.30 mg /ml. Sebanyak 100 μL sampel atau larutan BSA ditambah
3 ml pereaksi Bradford, selanjutnya dihomogenkan dan diinkubasi selama
5 menit pada suhu 37oC dan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 595 nm.
b. Penentuan total aktivitas protease
Pada uji ini, dibutuhkan 4 botol vial 15 ml, satu sebagai blanko dan tiga
lainnya untuk tiga pengenceran protease. Larutan kasein 0,65 % sebanyak 5
ml ditambahkan pada tiap vial, lalu dimasukkan dalam water bath pada 37oC
selama 5 menit. Kemudian, pada tiga vial ditambahkan variasi volume
larutan enzim dan diinkubasi pada 37oC selama 10 menit. Setelah itu reagen
TCA 5 ml ditambahkan pada tiap tube, kemudian diinkubasi pada 37oC
selama 30 menit. Pada 6 vial lain, larutan standard tirosin ditambahkan
dengan volume 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; dan 0,5 (kecuali blanko) dan aquades
hingga volume masing-masing menjadi 2 ml. Setelah 30 menit inkubasi,
larutan uji difiltrasi. Kemudian, 5 ml sodium karbonat dan 1 ml reagen Floin
ditambahkan, lalu diinkubasi kembali pada 37oC selama 30 menit. Tiap
larutan sebanyak 2 ml kemudian difiltrasi dan absorbansinya diukur pada
panjangan gelombang 660 nm. Aktivitas enzim diekspresikan dalam
units/ml enzim.
c. LasA protease
Aktivitas protease LasA ditentukan dengan mengukur kemampuan kultur
supernatan untuk melisiskan sel S. auereus yang telah dididihkan. Sebanyak
100 µl dari LB kultur supernatan P. aeruginosa dengan atau tanpa ekstrak
tumbuhan ditambahkan pada 900 µl suspensi S. aureus yang telah didihkan.
OD600 ditentukan setelah 0, 5, 10, 20, 30, 45, dan 60 menit. Aktivitas
dieskpresikan sebagai ∆OD600 / jam per μg protein.
d. LasB elastase
Sebanyak 100 µl dari LB kultur supernatan P. aeruginosa ditambahkan ke
dalam 900 µl ECR buffer (100 mM Tris, 1 mM CaCl2, pH 7,5) yang
 mengandung 20 mg ECR (elastin Congo red). Kemudian diuinkubasikan
selama 3 jam pada 37oC. ECR yang tidak larut dihilangkan dengan
sentrifugasi, dan absorpsi dari supernatan diuur pada 495 nm. Medium AB
tanpa sel, sendiri, dan dengan ekstrak tumbuhan digunakan sebagai kontrol
negatif. Aktivitas dieskpresikan sebagai ∆OD495 per µg protein.
e. Biofilm
Efek ekstrak tumbuhan pada pembentukan biofilm diukur dengan PVC
biofilm formation assay. Kultur P. aeruginosa yang didiamkan semalaman
diresuspensi pada medium AB segar dengan atau tanpa kehadiran ekstark
tumbuhan. Setelah 10 jam masa inkubasi pada 30oC, biofilm diinkubasi
pada microtiter plate dengan pewarnaan menggunakan larutan kristal violet.
Plat lalu dicuci untuk menghilangkan sel planktonik, dan sel yang
menempel dengan permukaan dikuantifikasi dengan dilarukan pada etanol,
kemudian absorbansi diukur pada OD650 nm.

III. BIBLIOGRAFI

Adonizio, A.L. 2008. Anti-Quorum Sensing Agents from South Florida Medicinal
Plants and their Attenuation of Pseudomonas aeruginosa Pathogenicity.
Florida: Florida International University.

Kuntidewi, N. 2011. Pengaruh Ekstrak Etanolik Daun Talok (Muntingia calabura

L.) terhadap Ekspresi Faktor Virulensi Bakteri Pseudomonas aeruginosa
Berbasis Sistem Quorum Sensing. Surakarta: Universitas Sebelas Maret.

Mayasari, E. 2005. Pseudomonas aeruginosa: Karakteristik, Infeksi, dan

Penanganan. Medan: USU Repository.

Mustika, F. 2009. Isolation and Screening of Biofilm Forming Bacteria for

Optimation of Biofilm Production by Addition of Sugar and Antibiotics
Variation and its Concentration in Nile Tilapia Oral Vaccines Development
(Oreochromis Niloticus L.). Bandung: School Of Life Science And
Technology ITB.

Pokorni, J., Yanishlieva, N. dan Gordon, M. (2001). Antio- xidant in Food:

Practical Application. New York: CRC Press.
Rohman, A., S. Riyanto dan N.K. Hidayati. 2007. Aktivitas Antioksidan,
Kandungan Fenolik Total dan Flavonoid Total Daun Mengkudu (Morinda
citrifolia L.). Agritech. 27(4): 147-151.

Sang, S., Cheng, X., Zhu, N., Stark, R.E., Badmaev, V., Ghai, G., Rosen, R.T. dan
Ho, C.T. (2005). Flavonol glycosides and novel iridoid glycoside from the
leaves of Morinda citrifolia. Journal of Agriculture and Food Chemistry.
49: 4478-4481.