Penelitian-1

Aktifitas NK Cell, CTL dan Makrofag dan Percepatan Apoptosis Berdasarkan Sekresi

TNF , Ekspresi TRAIL, Caspase-8, Caspase-3 dan Pada

Stem Cell Osteosarcoma

Penulis :

dr. Fachrizal Arfani Prawiragara

Pembimbing :

Dr. Ferdiansyah, dr.,Sp.OT(K)

DEPARTEMEN ORTHOPAEDI & TRAUMATOLOGI

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2019
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Osteosarcoma merupakan neoplasma yang didiagnosa berdasarkan

pemeriksaan histologi terhadap produksi osteoid berhubungan dengan malignant

mesenchymal cells. Osteosarcoma umumnya adalah tumor yang agresif dan cenderung

bermetastasis secara dini. Osteosarcoma memiliki beberapa tipe dengan konvensional

yang paling umum dan dibagi lagi berdasarkan tipe sel (osteoblastik, chondroblastic

dan fibroblastic).1

Di Indonesia, berdasarkan riset dasar kesehatan 2013 didapatkan prevalensi dari

penyakit kanker sebesar 1,4 per mil (%). Tumor tulang didapatkan odds ratio sebesar

4.2 Sedangkan insidens tumor tulang ganas di Indonesia didapatkan sebesar 1.6% dari

seluruh jenis tumor ganas pada manusia, dengan didapatkan kecenderungan

meningkatkannya insidens tumor tulang setiap tahunnya. Insidens tumor tulang di

RSUPN Ciptomangunkusumo sebesar 1.2%, dengan insidens tumor tulang ganas

sebesar 1.3%. Berdasarkan data sistem informasi rumah sakit tahun 2005, osteosarcoma

termasuk dalam lima besar kasus kanker pada usia 1-17 tahun. Pada evaluasi profil

tumor tulang pada anak di RSUPN Ciptomangunkusumo tahun 1995-2004, didapatkan

73.7% kasus merupakan kasus osteosarcoma. Di RSUD dr. Soetomo sendiri pada

evaluasi profil tahun 1991-1995 didapatkan tumor ganas tulang sebanyak 373 kasus,

dengan tumor ganas tulang primer sebanyak 183 kasus, dengan perbandingan pria :

wanita 1.4 : 1, dengan jumlah kasus primer 44 kasus per tahun, terutama osteosarcoma

sebesar 62.4% kasus.

 Berdasarkan data WHO, osteosarcoma adalah tumor tulang primer paling

umum dengan estimasi insidens 4-5/1.000.000 per tahun. Di eropa, didapatkan insidens

0,2-3/100.000 per tahun dalam grup usia 15-19 tahun.1 Di Indonesia, telah ada postulasi

hubungan antara masa pertumbuhan tulang yang cepat dan osteosarcoma, sehingga

memberikan gambaran lokasi tumor di metaphysical dan insidens tertinggi selama

masa remaja sampai dewasa awal dengan predominasi 60% laki-laki.3

Angka 2 tahun pada survival rate di Taiwan didaptkan sebesar 46.9%, dengan

5 tahun survival rate sebesar 37.5%.4 Sebelum adanya perkembangan kemoterapi,

amputasi dan disartikulasi merupakan terapi dominan pada osteosarcoma dengan 5

tahun overall survival hanya 10-20%. Dengan perkembangan teknik operasi dan

advanced musculoskeletal imaging, teknik limb salvage surgery meningkatkan survival

rates menjadi 90%.5

Beberapa kasus osteosarcoma di RSUD dr. Soetomo memiliki gambaran

karakteristik yang tidak sesuai dengan gambaran klinis osteosarcoma secara umum

(klasik osteosarcoma). Kondisi ini melatar belakangi penulis untuk meneliti

karakteristik klinis pasien osteosarcoma yang tidak sesuai dengan gambaran klasik

osteosarcoma secara umum (Uncommon Osteosarcoma).

1.2.Rumusan Masalah

1. Apakah PBMC dengan penambahan sekreton dan GMCSF atau CSF dapat

meningkatkan aktifitas NK cell, CTL dan Makrofag ?

2. Apakah PBMC yang diaktifkan dengan crude sekretom dan GMCSF atau CSF

mempercepat Apoptosis ?
1.3.Tujuan

1.3.1. Tujuan Umum

Menjelaskan aktifitas NK Cell, CTL dan makrofag dan percepatan Apoptosis

berdasarkan sekresi TNF , ekspresi TRAIL, Caspase-8, Caspase-3 dan fragmentasi

DNA.

1.3.2. Tujuan Khusus

1. Analisis NK, CTL, Makrofag berdasarkan ekspresi TNF  , iL-2, iL-2, iL-6 dan CD

– 8.

2. Analisis percepatan apoptosis berdasarkan ekspresi Caspase-8, Casapase-3 dan

Anexine pada Stem Cell Osteosarcoma.

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Osteosarcoma

Osteosarcoma merupakan neoplasma yang terbentuk dari primitive bone-forming

mesenchymal stem cell.6 Berdasarkan data SERR (Survelillance, Epidemiology and End Result)

National Cancer Institute, Angka kejadian osteosarcoma sekitar 0,2% dari total neoplasma dan

merupakan keganasan terbanyak ke delapan dari seluruh keganasan pada anak dan remaja

(2,4% dari seluruh keganasan pada anak dan remaja).7 Namun dari seluruh keganasan primer

pada tulang, osteosarcoma ini adalah tumor tulang ganas dengan insiden atau angka kejadian

yang paling tinggi untuk keganasan non-hematopetik. Insiden osteosarcoma di Amerika

dilaporkan sebesar 4.0 (3.5 – 4.6) per tahun per satu juta penduduk untuk rentang usia 0-14

tahun dan 5.0 (4.6 – 5.6) per tahun per satu juta penduduk untuk rentang usia 0-19 tahun.6

Berdasarkan distribusi usia, osteosarcoma mempunyai distribusi yang khas

dibandingkan keganasan yang lain yaitu adanya dua puncak distribusi (bimodal distribution)

dengan puncak pertama pada dekade kedua kehidupan dan puncak kedua pada usia lebih dari

60 tahun.8 Puncak pertama dari insiden osteosarcoma ini terjadi pada usia sekitar 15 tahun dan

menurun secara signifikan pada dekade berikutnya. Angka kejadian ini meningkat kembali

pada usia lebih dari 60 tahun (second peak distribution) yang seringkali dihubungkan dengan

adanya preexisting conditon dari pasien tersebut misalnya adanya paget’s disease, riwayat

radiasi, bone infark, kronik osteomyelitis dan adanya kista dari degenerative joint disesase.9

Daerah yang paling sering terkena adalah metafisis tulang panjang. Klasik atau

konvensional osteosarkoma pertama kali akan muncul di dalam kavum medularis, kemudian

menyebar ke kortex tulang dan jaringan lunak di sekitarnya, lokasi tersering osteosarkoma

adalah pada daerah sendi lutut yaitu pada distal femur atau proximal tibia.10
 Osteosarkoma merupakan derivate dari sel mesenchymal primitif yang berasal dari

tulang dan jarang berasal dari soft tissue. Karakteristik yang khas dari sel osteosarkoma adalah

sel ini akan memproduksi matriks osteoid. Menurut WHO classification of Tumor, terdapat 8

tipe osteosarcoma dengan tipe terbanyak adalah konvensional osteosarcoma (80 – 90% total

kasus), osteoblastik, chondroblastik type dan fibroblastic type adalah tiga tipe yang paling

sering ditemukan dari pemeriksaan histoatologis pasien dengan konvensional osteosarcoma.8

Sebagian besar kasus osteosarcoma, jika tidak di terapi dengan baik akan cepat

mengalami metastase, sebelum ditemukan polikemoterapi, lebih dari 90% penderita

osteosarcoma meninggal akibat metastase pada paru-paru.2

2.1.1. Diagnosis Osteosarcoma

Gejala klinis pada osteosarcoma seringkali tidak spesifik. Nyeri dan diikuti oleh

pembengkakakn lokal pada daerah yang terserang serta terbatasnya pergerakan sendi yang

terkena merupakan gejala yang sering dikeluhkan oleh pasien dengan osteosarcoma. Lokasi

yang tersering adalah distal femur, proximal tibia dan proximal humerus.11

Diagnosis pasti untuk osteosarcoma ditegakkan dengan kombinasi pemeriksaan

radiologis dan histoplatologis. Pemeriksaan radiologis yang baik akan menentukan lokasi,

ukuran tipe matriks dan adanya periosteal reaction. Gambaran secara umum dari pemeriksaan

radiologis osteosarcoma adalah adanya lesi pada daerah metaphyseal tulang panjang dengan

gambaran periosteal reaction khas untuk osteosarcoma yaitu sunburst apperance pada foto

polos.9

Diagnosis secara pasti membutuhkan pemeriksaan histologi dan patologi anatomi yang

sediannya didapat dari open biopsi tumor. Secara histopatologis, sel malignant tumor harus

dapat memproduksi osteoid-osteoid baru untuk dapat diklasifikasikan sebagai osteosarcoma,

osteosarcoma konvensional merupakan keganasan tertinggi dari semua jenis osteosarkoma,

sub tipe yang lain antara lain telengectasic, small cell osteosarcoma, low grade osteosarcoma,
secondary osteosarcoma, parosteal osteosarcoma, periosteal osteosarcoma dan high grade

surface osteosarcoma.8

2.1.2. Staging dan Penilaian Risiko

Tumor primer harus dievaluasi secara radiologis melalui 2 proyeksi, dimana hal ini

sangat membantu untuk menjelaskan perubahan yang terjadi pada osseus, pemeriksaan MRI,

kedua pemeriksaan ini harus dilakukan sebelum pemeriksaan biopsy. MRI dipertimbangkan

sebagai pemeriksaan yang paling tepat dalam mengevaluasi osteosarcoma intramedular dan

menilai terlibatnya jaringan lunak, nerve dan pembuluh darah di sekitarnya. Distribusi dan

metastasis osteosarcoma dapat dilihat pada gambar 2.1. dan dinilai oleh MRI harus meliputi

semua tulang yang mengenai dan sendi – sendi sekitarnya.3

Gambar 2.1. Distribusi dan metastasis pada Osteosarcoma.

Penyebaran secara sistemik difokuskan pada paru dan tulang lainnya, dimana tempat

tersebut merupakan tempat yang paling sering terjadinya metastasis dari osteosarcoma dengan

menggunakan foto thoraks, ct scan serta pemeriksaaan bone scan. Semua pemeriksaan tersebut

harus dilakuakn sebelum dilakukan pembedahan.

 Tidak ada test laboratorium yang spesifik untuk osteosarcoma, alkaline phosphatase

dan lactat dehydrogenase tidak spesifik untuk osteosarcoma akan tetapi peningkatan keduanya

berkaitan dengan perburukan penyakit.

Berbagai maam tes laboratorium diperlukan sebelum terapi multidisiplin dimulai, test

laboratorium yang direkomendasikan adalah pemeriksaan darah lengkap, serum elektrolit,

golongan darah, pembekuan darah, fungsi hati, dan fungsi ginjal serta tes HIV dan hepatitis

serta pemeriksaan echocardiogram dan fungsi jantung karena terapi kemo akan mempengaruhi

fungsi jantung pada penderita osteosarcoma. Penyimpanan sperma direkomendasikan bagi

penderita laki – laki pada usia reproduktif.

Faktor – faktor yang mempegaruhi perburukan antara lain lokasi tumor yang berada

pada proximal tulang, volume tumor yang besar, serta peningkatan serum LDH.11

2.1.3. Terapi

Penderita osteosarcoma harus diterapi di Rumah sakit dengan perawatan multidisplin.

Terapi kuratif untuk penderita ostosarcoma meliputi pembedahan dan kemoterapi. Terapi

multimodal jika dibandingkan dengan hanya melakukan terapi pembedahan saja dapat

meningkatkan angka probabilitas disease free survival selama 5 tahun dari hanya 10-20%

meningkat hingga diatas 60%.4,5

Tujuan dari pembedahan adalah untuk membuang tumor sebanyak mungkin tetapi

sedapat mungkin tetap mempertahankan fungsi penderita, penderita osteosarcoma harus dapat

dipertimbangkan untuk menjalani terapi limb salvage.12,13 Saat ini doxorubicin, cisplatin dan

metotrexat dosis tinggi diperhitungkan sebagai agen aktif untuk melawan osteosarcoma

meskipun demikian kombinasi ideal dari terapi tersebut tetap harus di definisikan secara lebih

lanjut di kemudian hari. Waktu yang diperlukan dalam menjalani terapi biasanya sekitar 6 – 12

bulan. Penggunaan Growth Factor teryata tidak meningkatkan angka survival menjadi lebih

tinggi seperti yang diharapkan. Protokol kemoterapi saat ini telah dimulai sejak sebelum
operasi, meskipun hal ini belum dapat dibuktikan dapat menambah angka survival bila

dibandingkan dengan kemoterapi yang dimulai setelah operasi.

Multimodal terapi dapat berlaku untuk penderita anak – anak, remaja, dewasa muda

hingga penderita dewasa sampai yang berumur 60 tahun.9 Terapi pada osteosarcoma yang

mengalami metastasis dan osteosarcoma yang berulang adalah hampir sama pada kasus

osteosarcoma yang terlokalisir, dengan penambahan pembedahan untuk membuang tumor –

tumor yang bermetastasis di tempat – tempat tertentu seperti melakukan trakotomi untuk

eksplorasi paru.

Terapi pada kasus osteosarcoma berulang adalah pembedahan meskipun prognosisnya

buruk, tumor yang dibuang dan telah bermetastase harus dilakukan pembuangan. Secara

kesuluruhan penggunaan CT Scan untuk menilai adanya metastase pada paru bisa saja

menghasilkan suatu hasil yang salah, oleh karena itu pembedahan thorakotomi lalu eksplorasi

paru serta palpasi paru – paru secara langsung sangat direkomendasikan.

Terapi kemoterapi lini kedua belum ada regimen yang disepakati, pilihannya bisa saja

ditambah dengan ifosfamide, etoposide dan carboplatin. Terapi radioterapi untuk daerah yang

tidak dapat dioperasi direkomendasikan untuk dilakukan meskipun sebenernya osteosarcoma

merupakan tumor yang radioresistan.12,13

2.2. Biomarker pada Osteosarcoma

Secara umum biomarker atau tumor marker didefinisikan sebagai protein yang

disekresikan atau dihasilkan oleh jaringan neoplasma. Saat ini istilah tumor marker mencakup

semua substansi atau molekul yang membantu dalam proses diagnosis atau terapi terhadap

neoplasma. Tumor marker yang ideal adalah molekul yang berasal dari sel tumor dalam jumlah

yang secara mudah bisa dideteksi pada sirkulasi atau cairan tubuh penderita dan tidak muncul

pada penyakit lain. Berdasarkan asal pengambilannya, tumor marker dibagi menjadi : 1. Serum

tumor marker, 2. Urinary marker, 3. Genetic marker.

 Saat ini serum biomarker memegang peranan penting dalam monitoring proses

patogenesis neoplasma karena hubungan antara biomarker yang dilepaskan dari jaringan tumor

dan distribusi cairan tubuh dan eksresinya. Kadar serum biomarker tidak selalu berhubungan

dengan kadar jaringan tumor.14 Pada kasus osteosarcoma belum terdapat biomarker yang

spesifik untuk proses penegakan diagnosa. Namun terdapat beberapa biomarker yang dapat

digunakan untuk menunjang diagnosa dan kepentingan evaluasi terapi atau prognosa dari

osteosarcoma.15 Biomarker tersebut antara lain :

2.2.1. Lactat Dehydrogenase (LDH)

Lactat dehydrogenase (LDH) adalah enzim yang terlibat dalam metabolisme anerob

neoplasma. Proliferasi yang tidak terkontrol menyebabkan peningkatan volume tumor

sehingga terdapat ketidakcukupan penyediaan nutrisi dan oksigen di jaringan neoplasma.

Lingkungan yang hipoksik dan hiperproliferasi dari sel kanker akan meningkatkan

metabolisme anaerobic dalam rangka untuk mendapatkan suplai energi yang adekuat.14 Pada

osteosarcoma LDH ini lebih berperan sebagai faktor prognostik pada osteosarcoma belum

menunjukkan hasil yang konsisten dan meyakinkan. Beberapa penelitian menunjukkan hasil

yang lebih buruk pada pasien dengan kadar LDH yang tinggi, sebaliknya sebagian yang lain

tidak.16

2.2.2. Alkaline phospathase (ALP)

Alkaline phospathase (ALP) adalah anggota dari zinc metaloproteinase yang diproduksi

dan berlokasi di membrane cell osteoblast. ALP mengkatalis proses defosfolirisasi dari

pyrophosphate inorganic extracelluer yang mengatur maturasi matrix dan mineralisasi tulang.

Transformasi sel osteoblast pada osteosarcoma mengganggu kontrol yang ketat dari proliferasi

dan secara progresif menyebabkan kadar ALP meningkat secara konstan.14,16,17 Hubungan

antara aktifitas total ALP dan kondisi klinis pasien osteosarcoma telah dikenal selama leih dari
50 tahun. Tetapi, sama dengan LDH, pnelitian terkait peranan kadar ALP terhadap prognostic

osteosarcoma masih tidak konsisten.17

2.3. Osteosarcoma dan Metastasis pada Paru

Paru – paru merupakan organ tersering yang menjadi tempat metastasis dari

osteosarcoma. Pada tahun 1970 disebutkan semua penderita anak maupun remaja

osteosarcoma yang bermetastasis ke paru dinyatakan meninggal dunia dalam rentang waktu 5

tahun. Saat ini meskipun sudah digunakan kemoterapi multiagent, 76-85% relaps masih

muncul di paru-paru akan tetapi lebih dari 25% penderita yang telah menjalani thorakotomi

berhasil survive lebih dari 5 tahun. Reseksi dari paru yang telah terkena metastasis telah

membuat peningkatan outcome pada penderita osteosarcoma yang mengalami metastasis ke

paru.18

Reseksi metastase paru untuk mengurangi massa tumor pada paru ini dilakukan dengan

bedah thorakoskopi. Teknik ini dikatakan sebagai suatu teknik bedah yang bermanfaat untuk

pasien yang mengalami metastasis paru dari osteosarcoma karena tekniknya yang minimal

infasif bila dibandingkan dengan bedah thorakotomi mekskipun demikian reseksi tersebut

membutuhkan keakuratan yang tinggi apakah lesinya terlihat jelas di permukaan paru atau

hanya menduga – duga dari gambaran imaging CT Scan.18,19

Pemeriksaan melalui CT Scan sering dijadikan untuk mengambil keputusan apakah

terjadi metastasis ke paru atau belum dan juga penetuan jika sudah bermetastasis ke paru,

berapa banyak lesi yang metastasis ke paru – paru dibandingkan perabaan langsung pada

eksplorasi paru ketika melakukan bedah thorakotomi.20

Studi saat ini mengatakan bahwa adanya karakteristik ekspresi dari tingginya sitokrom

p450, ekspresi dari Her-2/neu dan ekspresi dari telomerase dikaitkan dengan prognosa

ostersarcoma yang buruk. Saat ini bedah thoraskopi lebih disukai oleh para ahli sebagai cara
pengambilan sample biopsi, sedangkan untuk bedah thorakotomi dipilih sebagai teknik

pembedahan untuk pembuangan lesi tumor pada paru – paru.18

2.4. Klasifikasi Osteosarcoma

2.4.1. Konvensional Osteosarcoma

Konvensional atau klasik osteosarcoma adalah keganasan primer tulang intramedullary

dengan sel yang memproduksi osteoid matriks. Tipe ostersarcoma ini adalah tipe yang paling

sering didapatkan. Diperkirakan angka kejadian konvensional osteosarcoma adalah sekitar 4-

5 kejadian per tahun per satu juta populasi.8

Lokasi tumor yang paling sering didapatkan pada konvensional osteosarcoma adalah

pada metafisis tulang panjang (91%) dan (<9%) pada diaphysis. Epifisis pada osteosarcoma

konvensional ini sangat jarang ditemukan (<1%).8

Gambaran klinis dari konvensional osteosarcoma tidak terrlalu spesifik, dengan

keluhan nyeri, peradangan dengan keterbatasan gerak serta biasanya didapatkan adanya massa

pada daerah yang terkena. Fraktur patologis didapatkan sebesar 5 – 10% dari osteosarcoma

tipe ini.8 Gambaran radiologis dari osteosarcoma konvensional ini sangat bervariasi dengan

lesi osteoblastik, litik atau mixed.2122

2.5. Cancer Stem Cells

Teori Cancer Stem Cells dijelaskan bahwa ada beberapa kecil sub-populasi dari sel

dengan jenis tumornya, Cancer Stem Cells dibedakan secara asimetris, diproduksi dan

diidentifikasi seperti sel anak dari stem cell dan beberapa jenis sel, dimana setelahnya secara

umum sebagian besar adalah tumor dalam jumlah yang besar, yang pada dasarnya adalah tumor

jinak. Stem Cell seperti ini dianggap bertanggung jawab untuk menginisiasi dan pertumbuhan

dari tumor dan jika lengkap diberantas dengan pembedahan ekstipasi atau lokal kemoterapi 23.
 Cancer Stem Cells pertama kali diperkenalkan oleh Bonnet dan Dick pada studi yang

meneliti tentang Acute Myeloid Leukemia (AML).24 Mereka mengidentifikasi populasi langka

dari human Severe Combined Immunodeficiency (SCID) leukemia yang menginisiasi sel yang

mampu merambat pada AML pada sistem transplant xenograft. Graft dari pasien yang

mengalami leukemia biasanya mereprensentasikan genotip dari penyakit asal pasien. Mereka

mendemonstrasikan bahwa AML stem cells pada manusia berasal dari sample pasien yaitu

CD34+ CD38-, menyerupai fenotip normal hematopoetic stem cell. Pendapat lain

mengungkapkan bahwa implikasi dari stem cell pada patogenesis dari otak, payudara, colon,

pankreas, prostat dan tulang dan beberapa lainnya yang menunjukkan keterlibatan yang lebih

luas dari stem cell pada carciogenesis. 23,25

Di sisi lain, bukti menunjukkan bahwa Cancer Stem Cells resistant terhadap terapi

kanker seperti kemoterapi dan radiasi. Cancer Stem Cells mempunyai beberapa properti yang

membuat mereka menjadi resistant terhadap tradisoonal terapi dari kanker, yang meliputi

kemampuan peningkatan DNA untuk memperbaiki, ketenangan, peningkatan ekspresi

pengankutan obat ke tempat tujuan, dan meningkatnya resisten terhadap apoptosis 25.

2.6. Cancer Stem Cells in Osteosarcoma

Studi baru menunjukkan identifikasi dari eksistensi Cancer Stem Cells (CSC) pada

osteosarcoma. Gibbs et al. adalah yang pertama kali mengisolasi CSC subpopulasi dari 9 biopsi

dari osteosarcoma yang tidak diterapi dan sel osteosarcoma MG-63 menggunakan sphere

formation assay. Sel tumbuh beberapa koloni, disebut sebagai sarcospheres, dimana pada

waktu pengkulturan dengan epidermal growth factor dan basic fibroblast growth factor

dibawah serum starvation dan tergantung kondisi.

Selain osteosarcoma, sel mirip CSC juga telah dicirikan pada sarkoma lain, termasuk

Ewing’s Sarcoma dan rhabdomyosarcoma, dengan menggunakan formasi bola dan analisis

penanda CD133 dan ALDH.26 Sarkoma Ewing adalah tumor tulang ganas kedua yang paling
umum dan serupa dengan osteosarcoma. Dikaitkan dengan prognosis buruk dan tingkat

kelangsungan hidup yang rendah. Suva et al. Mengisolasi subpopulasi sel tumor CD133 + dari

tumor sarkoma Ewing primer.26 Mereka menunjukkan bahwa sel – sel ini mampu memulai dan

mempertahankan pertumbuhan tumor melalui transplantasi serial pada tikus dengan kekebalan

tubuh. Sel CD133 + juga mengekspresikan tingkat penanda sel induk Oct4 dan Nanog yang

lebih tinggi daripada sel CD133.25

2.6.1. Isolasi dan karakterisasi Fungsional Cancer Stem Cell dari Osteosarcoma

Sebagian besar teknik untuk isolasi CSC (Cancer Stem Cells) dari osteosarcoma

bergantung pada metode yang memanfaatkan perbedaan antara CSC dan sebagian

besar populasi tumor. Perhatian utama dari metode tersebut yaitu asumsi bahwa

perbedaan tersebut tidak dapat diubah dan itu terutama ada satu jenis populasi CSC.

Ulasan lebih jelas dari berbagai metode yang digunakan untuk isolasi dan

identifikasi sel induk osteosarcoma telah disediakan. Studi memanfaatkan metode

yang berbeda untuk pengayaan CSC osteosarcoma.27

2.6.2. Isolasi berdasarkan Permukaan Marker

Strategi isolasi pada dasarnya bergantung kepada perbedaan ekspresi pada

permukaan marker yaitu pada sel CSC tumor. Di dalam tumor asal mesenchymal

marker yang biasanya diekspresikan sel mesenchymal telah digunakan untuk

mengisolasi osteosarcoma CSCs. Dari jumlah tersebut, hanya sedikit yang berguna

untuk mengisolasi sebagian kecil sel dengan karakteristik CSC. Normal sel induk

pada jaringan mesenchymal tidak memiliki defiisi yang jelas, urutan sel seperti pada

folikel rambut, usus atau sistem hematopoetik dan tidak adanya konsensus yang jelas

mengenai marker sel meschymal yang digunakan.27 Selanjutnya, subpopulasi yang

berbeda pada sel cenderung dikenali dengan berbeda permukaan marker yang bisa

menunjukkan bahwa lebih dari satu jenis Stem Cell ada pada populasi massal.
 2.6.3. Isolasi berdasarkan sifat seluler intrinsik

2.6.3.1. Dye retension

Secara umum pedoman yang dipegang bahwa CSC relatif tenang, dengan tingkat

proliferasi lambat dan menjalani sel asimetris. PKH26 dan PKH67 adalah pewarna

lipofilik yang labelnya seragam dimana membran sel dan dibagi rata ke anak sel

setelah sel yang diberi label telah mengalami pembelahan sel. Sejak CSC berada

pembagian dilakukan secara asimetris, diartikan bahwa CSC mempertahankan label

membran untuk periode yang lebih lama dibandingkan ke sel anak yang

terdiferensiasi yang membelah dengan cepat dan membentuk sebagian populasi

tumor.27

2.6.3.2. Dye exclution dan Side population

Beberapa melaporkan bahwa CSC menunjukkan mereka resistant terhadap obat

karena ekspresi yang tinggi pada pengantaran obat seperti ABC penggunaan obat

yang berlebihan. Kejadian seperti ini telah diketahui mengisolasi CSC osteosarcoma

dari sel yang berasal dari keduanya dan biopsi dari osteosarcoma manusia,

berasarkan kemampuan untuk mengeluarkan pewarnaan fluorescent DNA-bindings

seperti chst33342. Populasi tambahan berasal sejak tulang sarcoma mengandung

populasi pembentuk, dan dapat juga secara cepat menginisiasi tumor pada frekuensi

yang tinggi.27

2.6.4. Limiting Dilution Assay (LDA)

Ini adalah gold satndart pemeriksaan sejak mengidentifikasi sel seperti CSC. Pengujian

ini tergantung dari kemampuan dari CSCs merubah tumor dalam dosis tergantung dari

cara menunjukkan hubungan secara linear. Dengan kata lain, sel tumor di desain CSC

jika dapat menginisiasi tumor sebanyak mungkin frekuensi tinggi dan terendah dari

jumlah sel, sebagai perbandingan ke tumor yang besar atau ke sel tumor yang lainnya.27
 Pengujian Limiting Dilution Assay (LDA) dapat diaplikasikan untuk menilai formasi

secara in vitro. Bagaimanapun juga mekanisme dimana stem cells secara istimewa

membentuk klonal yang kebanyakn tidak diketahui asalnya, pengujian ini berdasarkan

penilai terhadap kemampuan memperbaiki diri pada populasi sel tumor yang dapat

tumbuh dibawah serum dan tekanan berbagai kondisi.

2.6.5. Multipotency

Tidak seperti fraksi tumor yang besar, CSCs menjalani secara simetris dan asimetris

untuk membedakan menjadi beberapa tipe sel yang dapat ditemukan pada jaringan asal

dan oleh karena itu dianggap multipotent. Seperti MSCs, seperti pada gambar 2.2.

skematik dari Mesechymal Stem Cell (MSCs) differentiation to another soft tissue

osteosarcoma CSCs dapat juga berdeferensiasi menjadi osteoblasts, adipocytes dan

chondrocytes dibawah rangsangan yang tepat.28,29

Gambar 2.2. Skematik dari Mesenchymal Stem Cell (MSCs) differentiation to

another, soft tissue.

2.7. Faktor signaling yang mempengaruhi Osteosarcoma CSCs

Komponen penting dari program diferensiasi osteoblas adalah bentuk sel induk dari

sumsum tulang. Sumsum tulang (Bone Marrow) adalah sel induk hematopoetik dan sel
mesenchymal dan dapat dibedakan berdasarkan fenotip dan pengujian secara assay.30

MSCs dapat mempertahankan sel osteosarcoma dalam keadaan yang tidak berdiferensiasi

melalui sekresi sitokin sebagai interleukin-6.31 Pendapat terbaru dari Brune dkk,

menyarankan bahwa mesenchymal stem cells (MSCs) yang diisolasi dari osteosarcoma

manusia secara genetis berbeda dari sel tumor, menunjukkan secara genetis berbeda dari

sel tumor, hal itu dikarenakan MSC yang terpisah karena dalam ruang lingkup sebenarnya

sel osteosarcoma dalam tidak berdiferensiasi.32

Selain sel induk mesenchymal, sumsum tulang kaya beberapa faktor yang mempengaruhi

program diferensiasi tulang.33,34 Pada gambar 2.3. dapat dilihat skematik dari Mesenchymal

Stem Cell (MSCs) dan Progressi dari linear sel l Fibroblast Growth Factor (FGF) telah

terlibat dalam perawatan CSC26 dan berfungsi sebagai pengembangan mekanistik dari sel

induk osteosarcoma. Fungsi FGFs adalah mengikat pertumbuhan fibroblast secara kognitif

yaitu faktor reseptor (FGFRs).35 FGF merangsang proliferasi dan menghalangi diferensiasi

pada osteoblast yang belum matang dan menginduksi ekspresi Sox2. FGF stimulasi

meningkatkan proliferasi sel osteosarcoma manusia, dan FGFRs dilaporkan terlalu banyak

diekspresikan sel osteosarcoma pada manusia. Pengobatan dengan inhibitor FGF

menyebabkan penurunan ekspresi Sox2 dan proliferasi sel menurun pada penilitian yang

dilakukan pada tikus.36

Gambar 2.3. Skematik dari Mesenchymal Stem Cell (MSCs) dan Progressi dari linear sel.