BAB II

PEMBAHASAN

Setelah sampel murni DNA diluar, langkah selanjutnya dalam eksperimen

kloning gena adalah pembentukan molekul DNA rekombinan (lihat Gb. 1.1).

untuk menghasilkan molekul rekombinan ini, vektor dan DNA yang akan diklon

harus dipotong pada tempat-tempat tertentu dan kemudian digabungkan menjadi

sati dengan cara yang terkontrol. Pemotongan dan penyambungan adalah dua

contoh teknik manipulasi DNA. Berbagai macam teknik ini telah dikembangkan

selama dua puluh tahun terakhir. Seperti halnya dipotong dan disambung kembali,

molekul DNA dapat diperpendek, diperpanjang, dibuat kopi menjadi molekul

RNA atau molekul DNA baru, dan dimodifikasi dengan penambahan atau

pengambilan gugus kimiawi tertentu. Manipulasi tersebut, yang semuanya dapat

dikerjakan dalam tabung percobaan, member dasar biokimia DNA, strutktur gena

dan pengaturan ekspresi gena (Sukandarrumidi, 2018).

Hampir semua teknik manipulasi DNA menggunakan enzim yang

dimurnikan. Di dalam sel enzim-enzim ini berperan-serta dalam proses-proses

yang penring seperti replikasi dan transkripsi DNA, penghancuran DNA asing

atau yang tidak dikehendaki (misalnya DNA virus yang masuk sel), reparasi DNA

yang mengalami mutasi, serta rekombinasi antara molekul-molekul DNA yang

berbeda. Setelah pemurnian dari ekstrak sel, enzim-enzim tersebut dapat dicoba

melaksanakan reaksi-reaksi dalam kondisi yang artifisial. Walaupun reaksi

enzimatik ini sering langsung dapat berjalan, tetapi kebanyakan tidak mungkin

dijalankan dengan cara-cara kimia standar. Oleh karena itu enzim yang murni

sangat penting dalam rekayasa genetic dan suatu industri yang penting telah

mengembangkan preparasi, karakterisaasi dan pemasarannya. Menipulasi

pemotongan dan penyambungan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut

endonukleasi restriksi (untuk pemotongan) dan ligase (untuk penyambungan)

(Sukandarrumidi, 2018).

2.1 Enzim-enzim untuk manipulasi DNA

Enzim-enzim ini dapat dikelompokkan menjadi lima golongan besar tergantung

pada jenis reaksi yang dikatalisis:

1. Nuklease adalah enzim yang memotong, memendekkan atau mendegradasi

molekul asam nukleat.

2. Ligase menyambung asam nukleat menjadi satu.

3. Polimerase membuat kopi dari molekul.

4. Enzim modifikasi (modifying enzymes) menghasilkan atau menambah

gugus kimiawi.

5. Topoisomerase membuat atau mengubah DNA berlilitan (supercoli) dari

DNA sirkular yang tertutup-secara-kovalen.

Sebelum membicarakan secara terperinci tiap-tiap golongan enzim harus

diperhatikan dua hal. Pertama, walaupun kebanyakan enzim dapat ditempatkan

pada golongan tertentu, beberapa enzim menunjukkan aktivitas yang bermacam-

macam sehingga dapat dimasukkan dalam dua golongan atau lebih. Banyak

polymerase mempunyai aktivitas kombinasi, yaitu membuat DNA baru diserai

aktivitas degradasi DNA (= nuklease). Hal kedua yang harus dipahami adalah

bahwa seperti halnya enzim untuk manipulasi DNA, banyak enzim serupa yang

mempunyai aktivitas pada RNA. Ribonuklease pada preparasi DNA merupakan

satu contoh dari enzim tersebut (Sukandarrumidi, 2018).

2.1.1 Nuklease
 Nuclease mendegradasi molekul DNA dengan memecah ikatan

fosfodiester yang menghubungkan satu nukleotid dengan nukleotid berikutnya

pada untai DNA. Ada dua macam nuclease yang berbeda (Gb. 4.1):

1. Eksonoklease, yang menghilangkan nukleotid satu persatu dari ujung

molekul DNA.

2. Endonuklease, yang memecah ikatan fosfodiester interbal pada molekul

DNA.

Perbedaan utama di antara bermacam-macam eksonuklease terletak pada jumlah

untai yang didegradasi dalam DNA untai ganda. Suatu enzim yang disebut Bal 31

(yang dimurnikan dari baketeri Alteromonas espejiana) adalah contoh

eksonuklease yang memecah nukleotid pada kedua untai molekul DNA beruntai-

ganda (Gb. 4.2a). Semakin lama waktu yang dipakai Bal 31 untuk bekerja pada

molekul DNA semakin pendek fragmen DNA yang dihasilkan. Sebaliknya, enzim

seperti eksonuklease III E.coli hanya mendegradsi satu untai dari molekul DNA

untai-ganda,yang menghasilkan DNA untai tunggal (Sukandarrumidi, 2018).

Kriteria yang sama dapat dipakai untuk klarifikasi endonuklease.

Endonuklease S1 (dari jamur Aspergillus oryzae) hanya akan memotong untai

tunggal, sedangkan deoksiribonuklease (DNAsel), yang dihasilkan dari pancreas

sapi, memotong baik molekul untai ganda maupun untai tunggal. DNase I adalah

nonspesifik, dalam arti bahwa enzim ini memotong DNA pada sembarang tempat

ikatan fosfodiester internal; oleh karena itu hasil akhir kerja DNase I yang lama

adalah campuran mononukleotid dan oligonukleotid yang sangat pendek.

Sebaliknya kelompok enzim khusus yang disebut endonuklease restriksi

memotong DNA untai-ganda hanya pada tempat pengenal spesfik yang jumlahnya

terbatas (Gb. 2.3c) (Sukandarrumidi, 2018).

 Gambar 2.1 Reaksi yang dikatalisis oleh dua jenis nuclease yang berbeda

2.1.2 Ligase

Di dalam sel fungsi ligase DNA adalah untuk mereparasi tempat putusnya

untai tunggal (“disontinyuitas”) yang terjadi pada molekul DNA untai-ganda yang

mungkin terjadi pada waktu replikasi DNA. Ligase DNA yang berasal dari

kebanyakan organism juga akan menyambung dua fragmen DNA untai-ganda

(Sukandarrumidi, 2018).

Gambar 2.2 Reaksi-reaks yang dikatalisis oleh jenis nuclease yang berbeda
2.1.3 Polimerase

DNA polimerase adalah enzim yang mensintesis untai baru DNA yang

komplemente terhadap cetakan (template) DNA atau RNA (Gb. 4.5a).

kebanyakan polymerase hanya dapar berfungsi jika cetakan mempunyai daerah

untai-ganda yang berlaku sebagai primer untuk permulaan polimerisasi. Tiga

macam polymerase DNA digunakan secara rutin dalam rekayasa genetic. Pertama

adalah polymerase DNA I yang biasanya dihasilkan dari E.coli. enzim ini melekat

pada daerah untai-tunggal pendek (daerah putus nick) pada molekul DNA yang

terutama beruntai-ganda dan kemudian mensintesis untai yang sama sekali baru

dengan mendegradasi untai yang telah ada ketika proses berlangsung. oleh karena

itu polymerase DNA I adalah contoh enzim dengan aktivitas ganda, yaitu

polymerase dan degradasi DNA (Sukandarrumidi, 2018).

 Gambar 2.3 Reaksi-reaksi yang dkatalisi oleh jenis endonuclease yang berbeda

Pada kenyataan aktivitas polimerase dan nuklease pada polimerase DNA I

dikontrol oleh bagian-bagian yang berbeda pada molekul enzim, dan bagian-

bagian ini dapat dipisahkan jika enzim dipotong dengan cara tertentu (Gb. 4.5c).

bagian enzim yang masih mempertahankan fungsi polymerase disebut fragmwn

Klenow. Karena fragmen Klenow tidak memiliki aktivitas nuklease maka enzim

ini dapat mensintesis untai DNA komplementer hanya pada suatu cetakan untai

tunggal. Penggunaan utama enzim ini adalah pada pergurutan DNA (DNA

sequencing) (Sukandarrumidi, 2018).

Jenis polymerase DNA ketiga yang penting dalam rekayasa genetik adalah

transkriptase reversi, suatu enzim yang terlibat dalam replikasi beberapa jenis
virus. Transkriptase reversi adalah khas karena enzim ini menggunakan RNA

sebagai cetakan dan bukan DNA (Gb. 4.5b). kemampuan enzim ini untuk

mensintesis DNA komplementer terhadap cetakan RNA sangat penting dalam

teknik yang disebut kloning DNA (Sukandarrumidi, 2018).

Enzim-enzim yang memdofikasi DNA

Ada banyak enzim yang memodifikasi molekul NA dengan cara penambahan atau

pengambilan gugus kimiawi tertentu. Di antara enzim-enzim ini yang paling

penting adalah (Sukandarrumidi, 2018) :

1. Fosfatase alkali (dari E.coli atau jaringan usu sapi) yang menghilangkan

gugus fosfat pada ujung 5 molekul DNA (Gb. 4.6a).

2. Polinukleotid kinase (dari E.coli yang diinfeksi oleh fag T4), yang

mempunyai efek kebalikan dari fosfatase alkali yaitu menambah gugus

fosfat pada ujung 5! yang bebas (gb. 4.6b).

3. Deoksinukleotidil transferase terminal (dari jaringan thymus anak sapi),

yang menambah satu atau lebih deoksinukleotid pada ujung 3’ molekul

DNA (Gb. 4.6c).

Topoisomerase

Golongan terakhir enzim untuk manipulasi DNA adalah topoisomerase

yang mampu mengubah bentuk DNA sirkular yang tertutup-secara-kovalen

(misalnya molekul DNA plasmid) dengan membentuk atau menghilangkan bentuk

lilitan (supercoil). Walaupun penting dalam penelitian replikasi DNA,

penggunaan topoisomerase dalam rekayasa genetik masih harus diteliti

(Sukandarrumidi, 2018).

Enzim-enzim untuk memotong DNA endonuklease reteriksi.

Dalam kloning gena perlu bahwa molekul DNA dapat dipotong dengan cara yang

sangat tepat dan dapat diulang. Hal ini digambarkan dengan cara vektor dipotong

pada pembentukan molekul DNA rekombinan (Gb. 4.7a). tiap vektor harus

dipotong pada posisi tunggal untuk membuka lingkaran sehingga molekul DNA

baru dapat diinsersikan. Molekul yang terpotong lebih dari satu kali akan terpecah

menjadi dua fragmen atau lebih yang terpisah dan akan menjadi tidak berguna

sebagai wahana kloning. Lagi pula tiap molekul vektor harus dipotong pada posisi

yang benar-benar sama, karena pemotongan secara random tidak memuaskan.

Untuk melakukan manipulasi ini harus jelas bahwa dibutuhkan jenis nuklease

yang sangat khusus (Sukandarrumidi, 2018).

DNA yang akan diklon sering juga perlu dipotong (Gb. 4.7b). Untuk ini

ada dua alasa. Pertama, jika tujuannya adalah untuk melakukan klon gen aunggal

yang mungkin terdiri atas hanya 2 atau 3 kb DNA, maka gena ini harus dipotong

dari molekul DNA yang besar (sering kali lebih dari 80kb) dengan memakai

teknik preparsi yang diuraikan pada Bab 3. Kedua, molekul DNA yang besar

harus dipecah hanya untuk menghasilkan fragmen yang cukup kecil untuk dibawa

oleh vektor. Kebanyakan vektor kloning lebih cocok terhadap fragmen DNA

dengan kisaran ukuran tertentu. Sebagai contoh, vektor M13 sangat tidak efisien

untuk kloning molekul DNA yang panjangnya lebih dari 3 kb (Sukandarrumidi,

2018).

Endonuklease retrksi murni memungkinkan ahli biologi molekular

memotong molekul DNA dengan cara yang tepat dan dapat diulang, yang

diperlukan untuk kloning gena. Penemuan enzim-enzim tersebut mengantaar

W.Arber, H. Smith dan D. Nathans untuk memperoleh hadiah Nobel pada tahun
1978 dan penemuan ini merupakan terobosan dalam perkembangan rekayasa

genetik (Sukandarrumidi, 2018).

Penemuan dan manfaat endonuklease retriksi

Observasi permulaan yang mengantarkan pada penemuan endonuklease

retriksi telah dilakukan sejak awal tahun 1950-an ketika terlihat bahwa beberapa

strain bakteri kebal terhadap infeksi bakteriofag, suatu fenomena yang disebut

retriksi diatur-tuan rumah (host-controlled restriction) (Sukandarrumidi, 2018).

Mekanisme retriksi tidak terlalu rumit, walaupun demikian diperlukan

waktu lebih dar 20 tahun untuk memahami mekanisme ini sepenuhnya. Retriksi

terjadi karena bakteri menghasilkan enzim yang menghancurkan DNA fag

sebelum fag ini sempat mengadakan replikasi dan mengarahkan sintesa partikel

fag baru (Gb. 4.8a). DNA bakteru sendiri telindung dari serangan enzim tersebut

karena DNA ini mempunyai gugus metil tambahan yang menghalangi kerja

degradatif enzim (gb. 4.8b). enzim-enzim degradatif ini disebut endonuklease

retriksi dan disintesis oleh banyak spesies bakteri; lebih dari lima ratus macam

enzim ini sekarang telah dikarakterisasi. Telah dikenal tiga jenis endonuklease

retriksi yang masing-masing dibedakan oleh cara kerjanya yang agak berbeda.

Tipe I dan III agak kompleks dan hanya mempunyai peran yang sangat terbatas

dalam rekayasa genetk. Di lain pihak, endonuklease retriksi tipe II adalah enzim

pemotong yang begitu penting dalam kloning gena (Sukandarrumidi, 2018).

Endonuklease retriksi tipe II memotong DNA pada urutan nukleotid yang

spesifik

Ciri utama endonuklease retriksi tipe II (yang selanjutnya akan disebut

endonuklease retriksi saja) ialah bahwa tiap enzim mengenal urutan spesifik pada

molekul DNA yang akan dipotong. Enzim tertentu akan memotong DNA paa
urutan pengenal dan tidak pada tempat lain. Sebagai contoh, endonuklease yang

disebut PvuI (diisolasi dari Proteus vulgaris) memotong DNA hanya pada

heksanukleotid CGATCG. Sebaliknya enzim kedua dari bakteri yang sama, yang

disebut PvuII, memotong pada hekanukleotid yang berbeda, yaitu CAGCTG

(Sukandarrumidi, 2018).

Banyak endonuklease retriksi mengenai tempat-tempat target

heksanukleotid, tetapi enzim-enzim lain memotong pada empat atau lima urutan

nukleotid. Sau3 A (dari Staphylococcus aereus strain 3 A) mengenal target

GATC, dan Alu (Arthrobacter luteus) memotong pada AGCT (Sukandarrumidi,

2018).

Terdapat juga contoh-contoh endonuklease retriksi dengan degenerasi

urutan pengenalan, yang berarti bahwa enzim ini dapat memotong DNA pada

tempat-tempat urutan dnegan jenis nukleotid yang berkaitan. Hinf I (Haemophilus

influenza strain Rf) mengenal urutan GANTC sehingga dapat memotong GAATC,

GATTC, GAGTC dan GACTC (Sukandarrumidi, 2018).

Urutan retriksi bagi endonuklease retriksi yang paling sering digunakan dpat

dilihat Tabel 4.1

Tabel 4.1 Urutan pengenal untuk beberapa endonuklease retriksi yang paling

sering digunakan

Urutan* Ujung tumpul

Enzim Organisme
pengenal lengket

EcoRI Eschericia coli GAATTC Lengket

BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC Lengket

Bgl I Bacillus globigii AGATCT Lengket

PvuI Proteus vulgaris CGATCG Lengket

PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Tumpul

HindIII Haemophilus influenza Rd AAGCTT Lengket

HinfI Haemophilus influenza Rf GANTC Lengket

Sau 3A Staphylococcus aureus GATC Lengket

AluI Arthrobacter luteus AGCT Tumpul

TaqI Thermus aquaticus TCGA Lengket

HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC Tumpul

Urutan yang ditunjukkan adalah urutan pada satu untai dengan arah 5’ ke 3.

Perhatikan bahwa hampir semua urutan pengenal adalah “polindrum” yaitu bila

mengenai kedua untai maka pada tiap untai akan terbaca dalam arah yang sama,

misalnya:

EcoRI

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

Ujung tumpul dan ujung lengket

Sifat yang tepat hasil pemotongan oleh endonuklease retriksi sangat

penting dalam mendisain eksperimen kloning gena. Banyak endonuklease retriksi

membuat potongan untai-ganda yang sederhana pada pertengahan urutan pengenal

(Gb. 4.9a), sehingga menghasilkan ujung tumpul. PvuII dan AulI adalah contoh

pemotong dengan hasil ujung tumpul (Sukandarrumidi, 2018).

Meskipun demikian sejumlah besar endonuklease retriksi memotong

DNA dengan cara yang agak berbeda. Pada enzim-enzim tersebut kedua untai

DNA tidak dipotong pada posisi yang tepat sama, tetapi pemotongannya
berbentuk zigzag atau dengan belok tajam melampaui dua atau empat nukleotid,

sehingga fragmen DNA yang dihasilkan mempunyai tonjolan untai-tunggal

pendek pada tiap ujung (Gb. 4.9b). ini disebut ujung lengket atau ujung kohesif

karena pasangan basa antara ujung-ujung ini dapat melekatkan kembali molekul

DNA. Satu ciri penting enzim-enzim yang mengahilkan ujung lengket adalah

bahwa endonuklease retriksi dengan urutan pengenal yang berbeda dapat

menghasilkan ujung lengket yang sama. BamHI dengan urutan pengenal

GGATCC dan BglII dengan urutan pengenal AGATCT adalah contoh-contoh

yang menghasilkan ujung lengket GATC (Gb. 4.9c). Ujung lengket yang sama

juga dihasilkan Sau3A yang hanya mengenal tetranukleotid GATC. Fragmen

DNA hasil pemotongan oleh salah satu enzim tersebut dapa saling disambung,

karena tiap fragmen akan mempunyai ujung lengket yang komplementer

(Sukandarrumidi, 2018).

Frekuensi urutan pengenal pada suatu molekul DNA

Jumlah urutan pengenal bagi endonuklease retriksi tertentu pada molekul

DNA yang panjangnya diketahui dapat dihitung secara matematik. Suatu urutan

tetranukleotid (misalnya GATC seharusnya terdapat satu kali setiap 44 = 256

nukleotid, dan suatu heksanukleotid (misalnya GGATCC) satu kali setiap 46 =

4096 nukleotid. Dengan kalkulasi ini dianggap bahwa nukleotid-nukleotid

tersusun berurutan secara acak dan bahwa keempat nukleotid yang bersama

terdapat dalam proporsi yang sama (kandungan GC = 50%). Dalam praktek ini

tidak satu pun dari anggapan ini berlaku sepenuhnya. Sebagai contoh, molekul

DNA λ dengan panjang 49 kb seharusnya mengandung 12 tempat pemotongan

bagi endonuklease retriksi yang urutan pengenalnya merupakan heksanukleotid.

Pada kenyataannya terdapat tempat-tempat pengenalan yang kurang jumlahnya (6

tempat bagi BglII, 5 tempat untuk BamHI dan hanya 2 untuk SalI). Hal ini

mencerminkan bahwa kandungan GC fag λ kurang dari 50% (Gb. 4.10a)

(Sukandarrumidi, 2018).

Disamping itu tempat-tempat retriksi biasanya tidak berjarak sama

sepanjang molekul DNA. Jika jarak antara tempat-temoat retriksi sama, maka

digesti dengan endonuklease retriksi tertentu akan menghasilkan fragmen-

fragmen hasil pemotongan DNA dengan BglII, BamHI dan SalI. Pada masing-

masing kasus terdapat penyebaran ukuran-ukuran fragmen yang luas, yang

menandakan nukelotid pada DNA tidak tersusun secara acak (Sukandarrumidi,

2018).

Kesimpulan yang dapat diambil dari Gb. 4.10 adalah bahwa walaupun

matematik dapat memberi gambaran tentang banyaknya tempat retriksi yang

diharapkan pada molekul DNA tertentu, tetapi hanya analisis eksperimental yang

dapat memberikan gambaran yang benar.

Melaksanakan digesti restriksi didalam laboratorium

Sebagai suatu contoh, kita akan meninjau bagaimana melakukan digesti

pada sampel DNA (konsentrasi 125 ug/mL) dengn BglII.

Pertama, semua jumlah DNA yang diperlukan harus diambil dengan pipet

dan dimasukkan tabung percobaan. Banyaknya DNA yang akan digesti tergantung

pada sifat eksperimen; dalam hal ini kita akan mendigesti 2 mikrogram DNA λ

yang terkandung dalam 16 mikroliter sampel (Gb. 4.11a). Oleh karena itu

diperlukan pipet mikro yang sangat akurat (Sukandarrumidi, 2018).

Unsur utama lain yang dibutuhkan untuk melakukan reaksi adalah

endonuklease restriksi yang diperoleh secara komersial sebagai larutan murni

dengan konsentrasi yang diketahui. Tetapi sebelum penambahan enzim, larutan

yang mengandung DNA harus disesuaikan agar memberikan kondisi yang tepat

untuk aktivitas enzim dengan maksimal. Kebanyakan endonuklease restriksi akan

berfungsi secara memadai pada pH 7,4, tetapi enzim-enzim yang lain bervariasi

dalam kekuatan ionik (biasanya dari NaCl) dan konsentrasi Mg2+ (semua

endonuklease tipe II membutuhkan Mg2+ untuk berfungsi) yang dibuthkan. Juga

disarankan untuk menambahkan senyawa pereduksi, seperti ditiotreitol, yang akan

menstabilkan enzim dan mencegah nonaktivitasnya. Membuat kondisi yang tepat

untuk aktivitas enzim adalah penting karena konsentrasi NaCl atau Mg2+ yang

tidak tepat dapat menyebabkan tidak saja penurunan aktivitas, tetapi dapat juga

mengubah spesifikasi enzim, sehingga pemotongan DNA terjadi pada urutan

pengenal tambahan yang tidak baku (Sukandarrumidi, 2018).

Komposisi buffer yang sesuai untuk BglII ditunjukkan pada tabel 4.2

buffer ini adalah sepuluh kali konsentrasi kerja dan dapat diencerkan dengan

menambahkan campuran reaksi. Pada contoh ini volum akhir campuran reaksi

menjadi 20 ul sehingga untuk itu kita tambah ul 10X buffer BglII pada 16 ul DNA

yang telah ada (Gb. 4.11b) (Sukandarrumidi, 2018).

Endonuklease restriksi sekarang dapat ditambahkan. Secara konvensional,

1 unit enzim sebagai kuantitas yang diperlukan untuk memotong 1 ug DNA dalam

waktu 1 jam, sehingga kita memerlukan 2 unit Bgl II untuk memotong 2 ug DNA

λ. Bgl II sering didapatkan dengan konsentrasi 4 unit / ul sehingga 0,5 ul akan

mencukupi untuk memotong DNA. Reagen dan bahan akhir dalam campuran

reaksi adalah 0,5 ul Bgl II + 1,5 ul air, sehingga dicapai volume akhir 20 ul/Gb

(Sukandarrumidi, 2018).

Faktor terakhir yang perlu dipertimbangkan adalah temperatur inkubasi.

Kebanyakan endonuklease restriksi bekerja paling baik pada 30oC, tetapi beberapa
memerlukan persyaratan yang berbeda. Sebagai contoh, TaqI harus dimurnikan

dari bakteri yang disebut Thermus Aquaticus yang biasanya hidup pada

temperatur yang sangat tinggi pada habitat seperti sumber air panas. Digesti

restriksi TaqI harus diinkubasi pada 65oC untuk memperoleh aktivitas enzim yang

maksimum (Sukandarrumidi, 2018).

Sesudah 1 jam, restriksi harus sudah sempurna. Jika fragmen yang

dihasilkan akan dilakukan dalam eksperimen kloning, maka enzim harus dirusak

agar enzim ini tidak mendigesti DNA lain yang mungkin ditambahkan pada tahap

kemudian. Ada beberapa cara untuk dalam “mematikan” enzim. Untuk

kebanyakan kasus, inkubasi pada 70oC dalam waktu yang pendek sudah memadai;

untuk yang lain digunakan ekstraksi fenol atau penambahan EDTA (yang

mengikat ion Mg2+ sehingga mencegah kerja endonuklease restriksi)

(Sukandarrumidi, 2018).

Menganalisis hasil pemotongan endonuklease restriksi

Digesti retriksi akan menghasilkan sejumlah fragmen DNA dengan ukuran

yang tergantung pada posisi urutan pengenal yang tepat pada molukel DNA mula-

mula. Jelas bahwa diperlukan cara untuk menentukan jumlah dan ukuran fragmen

jika digunakan endonuklease retriksi dalam kloning gena. Apakah molukel DNA

dipotong atau tidak dipotong sama sekali dapat ditentukan secara mudah dengan

mengamati viskositas larutan. Pada larutan yang lebih kental molekul DNA yang

lebih besar akan menyebabkan daripada molekul yang lebih kecil, sehingga

pemotongan dihubungkan dengan penurunan viskositas. Meskipun demikian,

menentukan jumlah dan ukuran hasil-hasil pemotongan secara individual lebih

sukar. Pada kenyataannya selama bertahun tahun hal ini merupakan salah satu

aspek yang melelahkan dalam eksperimen yang melibatkan DNA. Akhirnya pada
tahun awal tahun 1970-an masalah ini dapat dipecahkan ketika dikembangkan

teknik elektroforesis gel (Sukandarrumidi, 2018).

(1) Pemisahan molekul dengan elektroforesis gel

Molekul DNA, seperti protein dan banyak senyawa biologic lain,

membawa muatan listrik (muatan listrik DNA adalah negatif). Akibatnya bila

molekul DNA ditempatkan pada medan listrik maka molekul DNA ini akan

migrasi menuju kutub positif. Kecepatan migrasi molekul bergantung pada dua

faktor, yaitu bentuknya dan muatan listriknya. Sayang bahwa kebanyakan

molekul DNA memiliki bentuk yang sama dan semua mempunyai muatan listrik

yang sangat mirip. Oleh karena itu, fragmen-fragmen dengan ukuran yang

berbeda tidak dapat dipisahkan dengan elektroforesis standar (Sukandarrumidi,

2018).

Meskipun demikian, ukuran molekul DNA merupakan suatu faktor dalam

pemisahan jika elektroforesis dikerjakan dalam suatu gel. Suatu gel yang biasanya

terbuat dari agarose, poliakrilamid atau campuran keduanya, membentuk

kerangka lubang-lubang yang kompleks untuk dilewatkan molekul DNA menuju

elektorde positif. Makin kecil molekul DNA makin cepat migrasinya melwati gel.

Oleh karena itu elektroforesis gel akan memisahkan molekul DNA sesuai dengan

ukurannya (Sukandarrumidi, 2018).

Dalam praktek, komposisi gel menentukan ukuran molekul DNA yang

dapat dipisahkan. Lempeng 0,3% agarose dengan tebal 0,5 cm yang memunyai

lubang relative besar digunakan untuk molekul dengan ukuran 5-60 kb, sehingga

memungkinkan misalnya, molekul 30 dan 35 kb dapat dibedakan dengan jelas.

Untuk memisahkan molekul yang jauh lebih kecil (1-300 pasangan basa)

digunakan gel poliakrilamid 40% yang sangat tipis (0,3 mm). Dengan gel ini
dapat dibedakan molekul-molekul dengan perbedaan panjang hanya 1 nukleotid

(Sukandarrumidi, 2018).