3.

8 Metode Penelitian
3.8.1 Pengambilan
Pengambilan sampel daun belimbing wuluh diperoleh dari Kampung Maspatih Asri RT
03 RW 05 Kelurahan Bubutan Kecamatan Bubutan Kota Surabaya oleh tim peneliti agar didapat
daun belimbing wuluh yang segar. Sampel daun belimbing wuluh diambil sekaligus dengan
tangkainya untuk menjaga kesegarannya kemudian dicuci sampai bersih. Sampel disimpan di
box kedap udara yang didalamnya dimasukkan es batu.
3.8.2 Proses dan Prosedur Ekstraksi Daun Belimbing Wuluh
Daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi L.) dicuci bersih dengan air dan dipotong kecil-
kecil kemudian dikeringkan dengan dijemur menggunakan sinar matahari selama lebih kurang
satu bulan dan diblender sampai diperoleh serbuk. Serbuk sampel daun belimbing wuluh
(Averrhoa bilimbi L.) sebanyak 100 gram dimaserasi dengan 2 L metanol 50% selama 72 jam,
disaring kemudian difraksinasi dengan n-heksana 1 L menggunakan corong pisah. Fraksi
methanol dievaporasi sehingga diperoleh ekstrak kasar porfirin. Selanjutnya dilarutkan dalam air
hangat, kemudian disaring dan dievaporasi kembali sehingga didapatkan residu yang
mengandung senyawa porfirin.
3.8.3 Pembuatan Nanopartikel
Nanopartikel yang dibuat dengan metode top – down synthesis, daun belimbing wuluh
dikeringkan dengan pengeringan alami sehingga diperoleh sampel dalam bentuk serbuk. Sampel
kering kemudian dikarakterisasi menggunakan SEM ( Scanning Electro Microscopy ) untuk
memperoleh morfologi ukuran partikel. Uji antioksidan menggunakan metode DPPH yang akan
didapatkan ekstrak daun belimbing wuluh.
3.8.4 Pemnbuatan dan Induksi Kanker dengan DMBA
Pembuatan larutan karsinogen dilakukan dengan melarutkan sejumlah tertentu
serbuk DMBA ke dalam larutan minyak jagung sesuai dengan volume tertentu sehingga
diperoleh konsentrasi yang dibutuhkan. Selanjutnya dilakukan proses homogenasi diaduk
dengan pengaduk vortex selama lebih kurang 15 menit sampai larutan terlihat homogen
(Wongso, 2013 ). Dosis induksi yang diberikan adalah DMBA 10 mg/kg BB pada tikus putih
(Mus musculus) berusia 4 minggu 2 minggu sekali selama 8 minggu. Pemberian DMBA
dilakukan dengan peroral dengan memberikan sejumlah volume (mL) DMBA sesuai dosis ke
bagian mulut hingga menyusuri esofagus menggunakan alat sonde. Selanjutnya tikus yang telah
diinduksi dipelihara selama 4-6 bulan untuk mengetahui perkembangan nodul kankernya.
Mula mula tikus putih ditimbang untuk mengetahui volume larutan DMBA. Berat tikus
rata-rata yang digunakan adalah 16 gram, sehingga perhitungan volume larutan DMBA yang
diberikan pada tikus adalah :
10 mg d
=
1000 g 16 g
10 mg x 16 g
=d
1000 g
0.16 mg = d
Kemudian 0.16 mg DMBA ini dilarutkan dalam 1 ml minyak jagung untuk diberikan secara
peroral dengan menggunakan sonde.
3.8.5 Perlakuan
Tikus putih ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat ram dan
dialasi sekam, pakan berupa pelet dan air minum diberikan ad libitum. Lingkungan kandang
dibuat agar tidak lembab, ventilasi yang cukup serta penyinaran yang cukup dimana lamanya
terang 14 jam dan lama gelap 10 jam. Sebelum melakukan percobaan tikus putih diadaptasi
dalam kandang selama 7 hari untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya,. Kesehatan
tikus putih dipantau setiap hari, dan berat ditimbang setiap minggu.
Sebelum diberi perlakuan, tikus putih ditandai dengan ditindik untuk membedakan tiap
perlakuan. Setiap perlakuan dilakukan dengan cara injeksi intralesi secara langsung ekstrak
antioksidan dari daun belimbing wuluh dengan dosis yang berbeda sesuai kontrol eksperimen
mulai hari pertama hingga hari ketujuh.
3.8.6 Pembedahan Hewan Uji
Dilakukan pengorbanan pada semua kelompok pada minggu kesembilan setelah
dinyatakan sampel terkena kanker dan telah diberi ekstrak antioksidan daun belimbing wuluh
dengan ketamin sebagai bahan anestesi. Kemudian mukosa bukal dilakukan biopsi insisi,
kemudian potongan jaringan diletakkan pada kertas saring yang sudah dipersiapkan dan ditutup
sedemikian rupa agar jaringan mukosa bukal tidak terlipat ketika direndam buffer formalin 10%
selama 24 jam. Selanjutnya diproses dengan metode parafin hinggal didapatkan blok parafin dan
dibuat preparat untuk pewarnaan imunohistokimia.
3.8.7 Pengamatan Jumlah Sel Karsinoma
Pengamatan sel yang mengalami displasia menggunakan metode imunohistokimia dan
digunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000x. Deparafinasi preparat dengan xylene
sebanyak 3 kali. Rehidrasi preparat dengan mengggunakan etanol 100%, 95% dan etanol 70%
masing masing selama dua menit, dua menit, satu menit dan terakhir dengan air selama satu
menit. Rendam dalam peroxidase blocking solution pada suhu kamar dan dilakukan prosedur
operasional pewarnaan imunohistokimia menggunakan bahan Phospate Buffer Saline,
peroksidase, Diaminobenziniddine, dan mounting media. ( CCRC, 2009 ).