A.

Analisis Kualitatif Karbohidrat

1. Uji Molisch
Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Monosakarida, disakarida, dan polisakarida
akan memberikan hasil positif. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang
merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol
dalam pereaksi molish.
a. Prinsip
Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat.
Dehidrasi heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan
dehidrasi pentosa menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin
merah ungu yang merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil
furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish. Uji molisch adalah uji kimia
kualitatif untuk mengetahui adanya karbohidrat. Uji ini untuk semua jenis
karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan memberikan hasil positif.

b. Cara Kerja
1. 15 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2. 3 tetes pereaksi Molisch ditambahkan dan dicampur dengan baik.
3. Tabung reaksi dimiringkan lalu dialirkan dengan hati-hati 1 mL H2SO4 pekat
melalui dinding tabung agar tidak tercampur.
4. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas
antara kedua lapisan

Gambar 1. munculnya warna ungu merupakan uji positif

Sumber : maharajay.lecture.ub.ac.id

2. Uji Benedict
Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat)
pereduksi (yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas) . Gula pereduksi meliputi
semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan
maltosa. Uji benedict berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh gugus aldehid
atau keton bebas dalam suasana alkalis, biasanya ditambahkan zat pengompleks
seperti sitrat atau tatrat untuk mencegah terjadinya pengendapan CuCO3. Uji positif
ditandai dengan terbentuknya endapan merah bata, kadang disertai dengan larutan
yang berwarna hijau, merah, atau orange.
a. Prinsip : Gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan mereduksi
ion Cu 2+ dalam suasana alkalis menjadi Cu+ yang mengendap sebagai Cu2O
berwarna merah bata.
 b. Cara kerja

1. Alat dan bahan disiapkan 3 tetes sampel(dalam bentuk larutan) dimasukkan

kedalam tabung reaksi yang masih kering dan bersih
2. 2 mL pereaksi Benedict ditambahkan, kemudian dikocok.
3. Dimasukkan kedalam penangas air selama 5 menit. Amati perubahan
warna endapannya.
4. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi
positif karbohidrat.

Gambar 2. Uji positif Benedict

Sumber: nku.edu
3. Uji Seliwanoff
Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa (karbohidrat yang
mengandung gugus keton). Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl
panas menjadi asam levulinat dan 4hidroksilmetilfurfural. Jika dipanaskan
karbohidrat yang mengandung gugus keton akan menghasikan warna merah pada
larutannya. Disakarida sukrosa yang mudah dihidrolisa menjadi glukosa dan
fruktosa memberi reaksi positif dengan uji Seliwanoff. Glukosa dan karbohdrat lain
dalam jumlah banyak dapat juga memberi warna yang sama.

a. Prinsip : Dehidrasi fruktosa oleh HCl pekat menghasilkan

hodroksimetilfurfural dan dengan penambahan resorsinol akan mengalami
kondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna merah oranye.
b. Cara kerja
1. 5 tetes larutan uji dan 15 tetes pereaksi Seliwanoff dimasukkan ke dalam
tabung reaksi
2. Tabung dididihkan di atas api kecil selama 30 detik atau dalam penangas air
mendidih selama 1 menit.
3. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya larutan berwarna merah orange.
 Gamabar 3. Hasil uji Seliwanoff
Sumber: seilnacht.info

4. Uji Barfoed
Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan jalan mengontrol
kondisi-kondisi percobaan, seperti pH dan waktu pemanasan. Pada analisa ini,
karbohidrat direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil
positif bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis.

a. Prinsip Ion Cu2+ (dari pereaksi Barfoed) dalam suasana asam akan direduksi
lebih cepat oleh gula reduksi monosakarida daripada disakarida dan
menghasilkan endapan Cu2O berwarna merah bata.

b. Cara kerja

1. 1 mL larutan uji karbohidrat dimasukkan kedalam tabung reaksi yang masih

kering dan bersih.
2. 1 mL pereaksi Barfoed ditambahkan, kemudian dikocok.
3. Tabung dimasukkan kedalam penangas air selama 3 menit.
4. Dinginkan dalam air mengalir.
5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15
menit sampai terlihat adanya reduksi

Gambar 4. Uji positif Barfoed

Sumber: http://www.medbiochemistry.com
 5. Uji Osazon
Untuk membedakan bermacam-macam karbohidrat dari gambar kristalnya.
a. Prinsip
Suatu aldosa atau ketosa dengan fenil hidrazin akan membentuk Kristal osazon. Kristal
osazon yang terbentuk khas sesuai dengan jenisnya.
b. Cara kerja
1. 2 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi
2. Seujung spatel fenilhidrazin-hidroklorida dan kristal natrium asetat
ditambahkan ke dalam tabung.
3. Tabung dipanaskan dalam penangas air mendidih selama beberapa menit.
4. Didinginkan perlahan dibawah air keran.
5. Perhatikan kristal yang terbentuk dan diidentifikasi dibawah mikroskop.

6. Uji Tollens

Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan
heksosa. Aldehida dapat mereduksi pereaksi Tollens sehingga membebaskan unsur
perak (Ag). Pereaksi tollens, pengoksidasi ringan yang digunakan dalam uji ini, adalah
larutan basa dari perak nitrat. Larutannya jernih dan tidak berwarna. Untuk mencegah
pengendapan ion perak sebagi oksida pada suhu tinggi, maka ditambahkan beberapa
tetes larutan amonia. Amonia membentuk kompleks larut air dengan ion perak.

a. Prinsip Aldehid dioksidasi menjadi anion karboksilat, ion Ag+ dalam reagensia
Tollens direduksi menjadi logam Ag. Uji positf ditandai dengan terbentuknya cermin
perak pada dinding dalam tabung reaksi.

b. Cara kerja
1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang
telah diisi 2 mL pereaksi Tollens.
2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna
yang terjadi.
3. Hasil dicatat

7. Uji Bial
Uji bial untuk menguji adanya gula pentose. Pemanasan pentose dengan HCl pekat
akan menghasilkan furfural yang berkondensasi dengan orcinol dan ion feri. Hasil
pemanasan akan menghasilkan warna biru hijau yang menunjukkan adanya gula
pentosa.

a. Prinsip
Dehidrasi pentosa oleh HCl pekat menghasilkan furfural dengan penambahan
orsinol (3.5-dihidroksi toluena) akan berkondesasi membentuk senyawa
kompleks berwarna biru.
 b. Cara kerja
1. 5 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi.
2. 10 tetes peraksi Bial dan 2 tetes HCl pekat ditambahkan
3. Campurlah dengan baik, lalu dipanaskan di atas api kecil sampai timbul
gelembung-gelembung gas dipermukaan larutan.
4. Perhatikan warna atau endapan yang terbentuk. Terbentuknya warna biru
menunjukan adanya pentose

Gambar 5. Hail uji Bial

Sumber: http://www.medbiochemistry.com
8. Uji Iodium
Uji iod bertujuan untuk mengidentifikasi polisakarida. Uji iod juga dapat
membedakan amilum dengan nitrogen. Reaksi antara polisakarida dengan iodin
membentuk rantai poliiodida. Polisakarida umumnya membentuk rantai heliks
(melingkar), sehingga dapat berikatan dengan iodin, sedangkan karbohidrat berantai
pendek seperti disakarida dan monosakaraida tidak membentuk struktur heliks
sehingga tidak dapat berikatan dengan iodin.
a. Prinsip Polisakarida dengan penambahan iodium akan membentuk kompleks
adsorpsi berwarna yang spesifik. Amilum atau pati dengan iodium menghasilkan
warna biru , dekstrin menghasilkan warna merah anggur, sedangkan glikogen dan
sebagian pati yang terhidrolisis bereaksi dengan iodium membentuk warna cokelat.
b. Cara kerja
1. 3 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi
2. Ditambahkan 2 tetes larutan iodium
3. Diamati perubahan warna yang terjadi

Gambar 6. Hasil uji Iodine

Sumber: http://www.sciencephoto.com
 9. Uji Asam Muktat
Dilakukan untuk membedakan antara glukosa dan galaktosa.
a. Prinsip Larutan uji dicampurkan dengan HNO3 pekat kemudian dipanaskan.
Karbohidrat dengan asam nitrat pekat akan menghasilkan asam yang dapat larut.
Namun, laktosa dan galaktosa menghasilkan asam musat yang dapat larut.
b. Cara kerja
1. 10 tetes larutan uji dan 2 tetes HNO3 pekat dimasukkan di dalam tabung reaksi.
2. Selanjutnya dipanaskan dalam penangas air mendidih sampai volumenya kira-
kira tinggal 2-3 tetes.
3. Lalu didinginkan perlahan-lahan, dan perhatikan terbentuknya kristal-kristal
keras seperti pasir.
4. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop

B. Analisis Kuantitatif Karbohidrat

Ada beberapa macam metode yang dapat kita gunakan untuk analisa kadar gula reduksi
secara kuantitatif yaitu :

1. Metode Fisika
Ada dua (2) macam, yaitu :
a. Berdasarkan indeks bias

Gambar 7. Rerfaktometer
Cara ini menggunakan alat yang dinamakan refraktometer, Refraktometer adalah alat
yang digunakan untuk mengukur kadar/ konsentrasi bahan terlarut. Misalnya gula,
garam, protein, dsb. Prinsip kerja dari refraktometer sesuai dengan namanya adalah
memanfaatkan refraksi cahaya. Refraktometer ditemukan oleh Dr. Ernest Abbe seorang
ilmuan dari German pada permulaan abad 20 (Anonim, 2010). Pengukurannya
 didasarkan atas prinsip bahwa cahaya yang masuk melalui prisma-cahaya hanya bisa
melewati bidang batas antara cairan dan prisma kerja dengan suatu sudut yang terletak
dalam batas-batas tertentu yang ditentukan oleh sudut batas antara cairan dan alas.
yaitu dengan rumus :

X = [(A+B)C - BD)]
dimana :
X = % sukrosa atau gula yang diperoleh
A = berat larutan sampel (g)
B = berat larutan pengencer (g)
C = % sukrosa dalam camp A dan B dalam tabel
D = % sukrosa dalam pengencer B –ut batas antara cairan dan alas.

Cara Kerja:
 Refraktometer dibersihkan terlebih dahulu dengan tisu ke arah bawah
 Refraktometer ditetesi dengan aquadest atau larutan NaCl 5% pada bagian prisma
dan day light plate
 Refraktometer dibersihkan dengan kertas tissue sisa aquadest / NaCl yang tertinggal
 Sampel cairan diteteskan pada prisma 1 – 3 tetes
 Skala kemudian dilihat ditempat yang bercahaya dan dibaca skalanya
 Kaca dan prisma dibilas dengan aquades / NaCl 5% serta dikeringkan dengan tisu,
dan
 Refraktometer disimpan di tempat kering

b. Berdasarkan rotasi optis

Gambar 8. Mekanisme polarimeter

Cara ini digunakan berdasarkan sifat optis dari gula yang memiliki struktur asimetrs
(dapat memutar bidang polarisasi) sehingga dapat diukur menggunakan alat yang
dinamakan polarimeter atau polarimeter digital (dapat diketahui hasilnya langsung)
yang dinamakan sakarimeter. Menurut hokum Biot; “besarnya rotasi optis tiap
individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan tebal cairan” sehingga dapat
dihitung menggunakan rumus :
2. Metode Kimia
Metode ini didasarkan pada sifat mereduksi gula, seperti glukosa, galaktosa, dan fruktosa
(kecuali sukrosa karena tidak memiliki gugus aldehid). Fruktosa meskipun tidak memiliki
gugus aldehid, namun memiliki gugus alfa hidroksi keton, sehingga tetap dapat bereaksi.
Dalam metode kimia ini ada dua (2) macam cara yaitu :

 Titrasi
Untuk cara yang pertama ini dapat melihat metode yang telah distandarisasi oleh BSN
yaitu pada SNI cara uji makanan dan minuman nomor SNI 01-2892-1992.
 Spektrofotometri
Adapun untuk cara yang kedua ini menggunakan prinsip reaksi reduksi CuSO4 oleh
gugus karbonil pada gula reduksi yang setelah dipanaskan terbentuk endapan kupru
oksida (Cu2O) kemudian ditambahkan Na-sitrat dan Na-tatrat serta asam fosfomolibdat
sehingga terbentuk suatu komplek senyawa berwarna biru yang dapat diukur dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 630 nm.
 Cara Luff Schoorl
Prinsip: Monosakarida dioksidasi oleh CuO dari reagen Luff Schoorl menjadi
Cu2O.kemudian kelebihan CuO dari reagen luff Schoorl akan bereaksi dengan KI
suasana asam membentuk I2 yang akan bereaksi dengan cara dititrasi dengan Na-
tiosulfat dengan indikator amilum .

Cara Kerja:

Persiapan Sampel
Pada prosedur kerja dalam praktikum ini, sampel yang ingin dilakukan pengujian
telah tersedia sehingga dalam praktikum ini kami tidak melakukan proses persiapan
sampel.
Prosedur Kerja Analisa
Berikut prosedur kerja pengujiannya:
  Pipet sample sebanyak 5 ml ke dalam erlenmeyer kemudian tambahkan 35 ml
aquades dan 10 ml larutan luff.
 Panaskan sampai mendidih
 Dinginkan dalam wadah berisi air.
 Tambahkan 10 ml larutan KI 25% dan 17 ml H2SO4 6N perlahan-lahan lewat
dinding.
 Tambahkan 2 ml amilum, amati perubahan warna yang terjadi (biru tua).
 Titrasi dengan larutan Natrium tiosulfat 0,005N sampai warna biru tua hilang.
 Catat volume titrasi.

3. Metode Nelson-Somogyi
Metode ini dapat digunakan untuk mengukur kadar gula reduksi dengan menggunakan pereaksi
tembaga arseno molibdat. Kupri mula-mula direduksi menjadi bentuk kupro dengan
pemanasan larutan gula. Kupro yang terbentuk selanjutnya dilarutkan dengan arseno molibdat
menjadi molibdenum berwarna biru yang menunjukkan ukuran konsentrasi gula dan
membandingkannya dengan larutan standar sehingga konsentrasi gula dalam sampel dapat
ditentukan. Reaksi warna yang terbentuk dapat menentukan konsentrasi gula dalam sampel
dengan mengukur absorbansinya. (Sudarmadji.S.1984)
Cara Kerja :
 Diambil 1 ml larutan sampel.
 Ditambahkan 1 ml reagen Nelson pada tiap-tiap tabung reaksi dan dipanaskan dalam
air mendidih selama 20 menit, kemudian didinginkan 5 menit dalam air mengalir.
 Ditambahkan 1 ml reagen arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung reaksi, dikocok
sampai homogen dan larut sempurna.
 Ditambahkan 7 ml aquadest pada tiap-tiap tabung reaksi, kemudian dikocok.
 Ukur absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
 Kadar gula reduksi sampel ditentukan dengan menggunakan persamaan kurva
standard.

4. Metode enzimatis
Untuk metode enzimatis ini, sangat tepat digunakan untuk penentuan kagar suatu gula secara
individual, disebabkan kerja enzim yang sangat spesifik. Contoh enzim yang dapat digunakan
ialah glukosa oksidase dan heksokinase Keduanya digunakan untuk mengukur kadar glukosa.
Glukosa oksidase
D- Glukosa + O2 oleh glukosa oksidase à Asam glukonat dan H2O2
H2O2 + O-disianidin oleh enzim peroksidase à 2H2O + O-disianidin teroksdasi yang
berwarna cokelat (dapat diukur pada l 540 nm).
Heksokinase
D-Glukosa + ATP oleh heksokinase à Glukosa-6-Phospat +ADP
Glukosa-6-Phospat + NADP+ oleh glukosa-6-phospat dehidrogenase à Glukonat-6-Phospat +
NADPH + H+ Adanya NADPH yang dapat berpendar (memiliki gugus kromofor) dapat diukur
pada l 334 nm dimana jumlah NADPH yang terbentuk setara dengan jumlah glukosa.
Menggunakan enzim spesifik untuk karbohidrat yan g akan diuji. Contoh enzimnya
yaitu glukosa oksidase dan heksokinase.

5. Metode Dinitrosalisilat (DNS)

Prinsip:
Metode ini digunakan untuk mengukur gula pereduksi dengan teknik kolorimetri. Teknik ini
hanya dapat mendeteksi satu gula pereduksi, misalnya glukosa. Glukosa memiliki gugus
aldehida, sehingga dapat dioksidasi menjadi gugus karboksil. Gugus aldehida yang dimiliki
oleh glukosa akan dioksidasi oleh asam 3,5-dinitrosalisilat menjadi gugus karboksil dan
menghasilkan asam 3-amino-5-salisilat pada kondisi basa dengan suhu 90-100oC. Senyawa ini
dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm.
Cara membuat pereaksi DNS :
 Sebanyak 5 g asam 3,5-dinitrosalisilat dan 5 g NaOH 2 N dilarutkan dalam 100 mL
aquades (larutan A).
 Sebanyak 150 g natrium kalium tartarat dilarutkan dalam 200 mL aquades (larutan B).
Larutan A dan B dicampur, lalu ditera dalam labu takar dengan aquades hingga
volume akhirnya menjadi 500 mL, kemudian diaduk dengan pengaduk magnetik
selama satu malam.
Cara kerja :
 Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 200, 400, 800,
1200, 1600, dan 2000 ppm.
 Masing-masing larutan diambil 1 mL, lalu tambahkan 3 mL pereaksi DNS.
 Kemudian, masing-masing larutan divorteks dan dipanaskan dalam air mendidih
selama 5 menit.
 Setelah dingin, masing-masing larutan diencerkan 5 kali dan divorteks kembali.
 Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm,
kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar.
 Pengukuran kadar gula pereduksi pada sampel dilakukan dengan cara mengambil 1
mL sampel kemudian ditambahkan 3 mL pereaksi DNS.
 Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai
pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

6. Metode Asam Fenol Sulfat

Prinsip:
Metode ini disebut juga dengan metode TS (total sugar) yang digunakan untuk mengukur total
gula. Metode ini dapat mengukur dua molekul gula pereduksi. Gula sederhana, oligosakarida,
dan turunannya dapat dideteksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat yang akan menghasilkan
warna jingga kekuningan yang stabil.
Cara Kerja:
 Buat larutan glukosa standar dengan konsentrasi masing-masing 0, 100, 200, 300,
400, dan 500 ppm.
 Masukkan 0,5 mL dari masing-masing larutan ke dalam tabung yang terpisah,
kemudian rendam dalam air, lalu tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5 mL
H2SO4 pekat dengan hati-hati melalui dinding tabung.
  Biarkan selama 10 menit, lalu vorteks dan biarkan kembali selama 20 menit.
 Ukur absorbannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm,
kemudian buat persamaan liniernya sebagai kurva standar.
 Pengukuran sampel dilakukan dengan cara memasukkan 0,5 mL larutan sampel ke
dalam tabung, lalu rendam dalam air, kemudian tambahkan 0,5 mL fenol 5% dan 2,5
mL H2SO4 secara hati-hati.
 Proses selanjutnya sama seperti pada larutan glukosa standar, kemudian nilai
pengukuran yang diperoleh diplot pada kurva standar.

Referensi
 Achmad, M dan Abdul, R.(Editor), 2006,Pengantar Kimia Farmasi Analisis : Volumetri
dan Gravimeteri, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.

 Sumantri, AbdulR,2007,Analisis Makanan,Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

 Rosnah, dkk. 2011. Pedoman Praktikum Ilmu Kimia Makanan. Kendari: Politeknik
Kesehatan Kendari Jurusan Gizi

 Winarno. 1997. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utama

 Bintang, Maria Prof. (2010) Biokimia: Teknik Penelitian. Jakarta: Penerbit Erlangga