Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Selasa, 28 November 2017

Biokimia Waktu : 09.00-11.00 WIB

PJP : dr.Husnawati,Msi
Asisten : Irfan Abdul Aziz
Sitti Khadijah

ISOLASI DNA KROMOSOM

Kelompok 8
Ida Rosada J3L216170
Liky Nuraini J3L116074
Noor Febryanti Dwiratih J3L116094

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

DIREKTORAT PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2017
 PENDAHULUAN

DNA atau deoxyribonucleic acid merupakan asam nukleat yang menyusun

informasi genetis pada makhluk hidup. DNA mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan
di antara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat
erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria
dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal
dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola
pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA
prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear
dan memiliki protein histon (Harrow 1954). DNA terdapat sebagai rantai ganda
(double helix) yang sangat panjang, mengandung potongan- potongan gen sebagai
satuan terkecil pengendali sifat dan ciri morfologi seperti warna kulit, jenis
rambut, bentuk jari dan sifat-sifat khusus pada manusia (Kartika 2012).
Sepanjang pita DNA berisi struktur yang terdiri dari gula pentosa
(deoksiribosa), gugus fosfat dan basa nitrogen, bersusun membentuk rantai
panjang dan berpasangan secara teratur. Semua kandungan DNA yang ada pada
sel dinamakan genom. Genom manusia terdiri dari genom inti sel (nukleus) dan
genom mitokondria. Genom mitokondria (ekstranuklear), mengandung lebih
banyak kromosom, sehingga jika pada kromosom inti, masing-masing hanya
terdiri dari 2 salinan, maka kromosom mitokondria tersusun dari ribuan salinan.
Penyakit yang disebabkan oleh mutasi pada gen di dalam mitokondria biasanya
diwariskan dari ibu ke anak karena mitokondria seorang manusia adalah hasil
pewarisan dari ibu. Hal ini disebabkan mitokondria lebih banyak ditemukan di
dalam sel telur daripada sperma. Setelah fertilisasi mitokondria dari spermatozoa
juga akan mati sehingga hanya meninggalkan mitokondria dari sel telur
(Kusnawijaya 1993).
Sifat kimia DNA Pada kondisi pH yang ekstem atau pada suhu diatas 80-
90°C, rantai ganda DNA dapat mengalami denaturasi, yakni lepasnya ikatan
hidrogen antara basa yang berpasangan. Jika suhu kembali normal (kurang dari
60° C) dan pH 7, rangkaian DNA atau RNA yang mengalami denaturasi dapat
bergabung kembali membentuk jalin ganda melalui proses annealing. Proses
denaturasi atau melting untuk masing-masing DNA mempunyai nilai tengah
temperatur yang berbeda, tergantung dan PH dan jumlah pasangan G = C. DNA
mempunyai struktur jalin ganda (double helix). Sifat-sifat spesifik dari basa
nitrogen pada DNA menentukan struktur rangkaian DNA. DNA membentuk jalin
ganda heliks yang berputar ke arah kanan pada porosnya dengan pola yang teratur
berupa 2 periode uliran (koil). Periode pertama uliran berjarak 0,34 nm,
sedangkan uliran kedua berjarak 3,6 nm. Adanya pola uliran tersebut
menyebabkan terbentuknya struktur cekungan besar (major groove) dan cekungan
kecil (minor groove). Dua rangkaian DNA yang membentuk jalin ganda tersebut
mempunyai arah ikatan fosfodiester 5’, 3’ yang benlawanan (antiparalel) yakni
5’,3’ dan 3’,5’ (Boyer 1999).
2

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip

isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung (Page 1997). Isolasi DNA diperlukan
untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah, medis, atau forensik.
Para ilmuwan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti pengenalan DNA
ke dalam sel dan binatang atau tanaman, atau untuk tujuan diagnostik. Dalam obat
aplikasi yang terakhir adalah yang paling umum. Di sisi lain, ilmu forensik perlu
memulihkan DNA untuk identifikasi individu ( kecelakaan, atau korban perang),
penentuan ayah, dan pabrik atau identifikasi hewan (Kusnawijaya 1993).
Tujuan diadakannya praktikum ialah agar mahasiswa dapat menunjukkan
sifat dan struktur DNA kromosom melalui proses isolasi.

METODE

Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum ini dilakukan di Laboratorium GG Kim 1 kampus gungung
gedhe IPB. Waktu praktikum yaitu hari Selasa tanggal 28 november 2017 pukul
09.00-11.00 WIB.

Bahan dan Alat

Alat-alat yang digunakan ialah penangas air, pipet tetes, pipet mohr, bulp
merah, mikrosentrifuse, gelas piala, neraca analitik, dan tabung reaksi.
Bahan-bahan yang digunakan ialah tris HCl, umbi bawang merah, buffer
TE, NaCl, SDS 10%, dH2O steril, larutan lisis, dan akuades .
.
Prosedur Penelitian

Pembuatan Larutan
Sebanyak 50 mM tris HCl ditambahkan larutan lisis lalu 50 mM EDTA
pada ph 8. Larutan SDS 10% dibuat dengan 10 mM tris HCl ph 8 ditambahkan
Buffer elusi TE lalu semua larutan di pendingin sampai akan digunakan.

Isolasi DNA Kromosom

Sebanyak 50gr bawang digerus, ditambahkan larutan lisis 80 mL dan 3 gr
NaCl lalu diblender sampai halus. Hasil blender di masukan kedalam gelas piala
dan ditambahkan 10 mL SDS 10%, diinkubasi pada suhu 60oc selama 20 menit.
Selanjutnya hasil inkubasi disaring diatas penangas es, setelah dingin 1 gr kristal
protease ditambahkan ke tabung reaksi dan diaduk selama 15menit, dan dibiarkan
selama 5 menit. Lalu ditambahkan 20 mL etOH melalui sisi tabung, ditempatkan
pada penangas es selama 2-5menit terdapat benang2 putih pada tabung reaksi
yang menandakan DNA kromosom. Selanjutnya benang putih dipindahkan
 3

kedalam eppendof sebanyak 1.5 mL dan di sentrifuse dan dibuang lapisan atas.
Setelah itu disentrifuse lagi selama 1 menit pada mikrosentrifuse. Hasil sentrifuse
ditambhakn 1mL buffer TE dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemekatan larutan DNA yang diperoleh (Albert 1994) .

Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang merah

[DNA] [RNA]
Larutan A260 A280 [DNA]/[RNA]
(µg/mL) (µg/mL)

Blanko 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

Sampel 0.119 0.138 416.5 386.4 1.0778

[DNA] = A260 x 50 µg/mL x faktor pengenceran

= 0.119 x 50 µg/mL x 70
= 416.5 µg/mL
[RNA] = A280 x 40 µg/mL x faktor pengenceran
= 0.138 x 40 µg/mL x 70
= 386.4 µg/mL
Selain itu ada 2 prinsip lagi dalam melakukan isolasi DNA, yaitu
sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya
sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan
substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut
dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan
kecepatan yang bervariasi.
Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni
dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan
pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing
dan iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.
Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen yang
dapat melarutkan lipid pada membrane sel, sehingga terjadi destabilisasi membran
sel. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K seperti untuk
4

melisiskan membran sel pada darah serta mendegradasi protein globular maupun
rantai polipeptida dalam komponen sel ( Kusnawijaya 1993).
Proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan
sodiumdodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen
tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam
mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA.
Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti tri trimethylammonium bromide
(CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membrane sel pada isolasi DNA
tumbuhan. Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada
beberapa hal. Pertama, konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah
terbentuknya kompleks CTAB-DNA, karena jumlah air dalam pelet sel sulit
diprediksi, maka penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus
dengan NaCl dengan konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel
yang mengandung CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks
CTAB-DNA bersifat insoluble pada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan
CTAB dengan kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang
didapatkan dan dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah
ditambahkan CTAB, sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini
adalah untuk mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada
suhu 15°C. Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB
banyak digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak
polisakarida seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti
Pseudomonas,Agrobacterium, dan Rhizobium.
Penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen lain seperti
NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk
menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol befungsi untuk
menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan. 2-
mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman dengan cara
membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang kemudian akan
terpisah dengan DNA. Senyawa polifenol perlu dihilangkan agar diperoleh
kualitas DNA yang baik. Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim
Taq polimerase pada saat dilakukan amplifikasi. Disamping itu, polifenol akan
mengurangi hasil ektraksi DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA.
Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi
protein yang mengkontaminasi DNA (Page 1997).
Konsentrasi dan pH dari buffer yang digunakan harus berada dalam
rentang pH 5 sampai 12. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan
mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk
menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga
memudahkan dalam menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas
enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk
mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion,
dan penambahan inhibitor DNAase dan detergen (Page 1997).
Tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim
DNase yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi
enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium
yangdibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse. DNA yang telah diekstraksi dari
 5

dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel
lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki
kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai pendenaturasi
protein,ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein
kehilangankelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi, penggunaan sentrifus ini untuk
memisahkan suatu isolasi DNA yang terbentuk dari larutan induknya, hal ini
menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni
fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas,
sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah sentrifugasi.
Protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan berada pada
fase organik. Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform
atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein.
Ekstrak DNAyang didapat seringkali juga terkontaminasi oleh RNA sehingga
RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak dengan cara pemberian RNAse (Setiadi
2001).
Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganisme, atau sel
manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk
membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease,
seharusnya (yang berfungsi mendegradasi protein) tetapi digunakan kristal NaCl,
sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan
sampai suhu 60°C untuk menginaktifasi enzim yangmendegradasi DNA (Yuwono
2009). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan
lagi dengan air. Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada
praktikum kali ini.Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian
DNA kromosom disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA
akan terlihat akan lebih jelas dan mudah diisolasi. Beberapa pereaksi digunakan
dalam proses isolasi DNA kromosom dari umbi bawang merah, diantaranya
garam untuk melarutkan DNA, larutan lisis yang berfungsi melisis dinding sel,
SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan
protein merusak interkasi polar pada membran sel, penambahan alkohol dingin
berfungsi unutk mengikat DNA dan membentuk suatu matriks kental seperti lem
putih akibat pemekatan DNA dan larutan buffer TE berfungsi untuk melarutkan
DNA kromosom. Garam yang digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat
menyebabkan menyebabkan DNA menjadi larut karena ion Na+ mampu
memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA yaitu kutub
yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain,
sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA.
Hal ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Murray 2000).
Penambahan alkohol dingin pada ekstrak sel melalui dinding tabung akan
membentuk gumpalan putih. Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand
DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam. Hal ini
karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol
akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. DNA yang terikat oleh
alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung diatas
filtrat. Benang -benang DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil
dan dimasukkan dalam tabung effendof 1.5 mL untuk selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rpm. Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA
6

kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun RNA. Pemisahan dengan
sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA kromosom yang memiliki
bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah disentrifugasi. Pada
tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA
kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril.

Gambar 1 DNA kromosom

Berdasarkan hasil percobaan yang didapatkan nilai absorbansi DNA dan
nilai absorbansi RNA. DNA memiliki berat molekul yang lebih tinggi dan
penyusun yang lebih lengkap daripada RNA dan mengarahkan sintesis RNA
untuk penyimpan dan penyalur informasi genetik. Sedangkan DNA pengemban
kode genetik dan dapat mereproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan
membentuk sel-sel baru untuk reproduksi organisme itu, dalam sebagian besar
organisme, sehingga nilai konsentrasi DNA pun lebih besar dibandingkan dengan
RNA yatitu nilai konsentrasi DNA sebesar 416.5 µg/mL, sedangkan nilai
konsentrasi RNA sebesar 386.4 µg/mL. Hal ini sesuai dengan teori kemurnian
suatu DNA atau RNA dari hasil isolasi DNA pada tanaman, bahwa DNA
memiliki absorbansi dan konsentrasi lebih tinggi dibandingkan dengan RNA.
Berdasarkan tabel 1, sampel isolasi DNA hanya 1 sampel. A260 adalah
absorbansi DNA, sedangkan A280 adalah absorbansi protein maka dari itu
pengukuran digunakan pada kedua panjang gelombang tersebut. Pada perhitungan
[DNA] yaitu dipakai A260 terkoreksi, karena perhitungan konsentrasi DNA hanya
memerlukan absorbansi DNA, bukan absorbansi protein / kontaminan lain. Rasio
A260 : A280 merupakan gambaran tingkat kemurnian DNA (Murray 2000).
 7

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa konsentrasi [DNA]

yaitu 416.5 µg/mL sedangkan konsentrasi [RNA] yaitu 386.4 µg/mL. Isolasi DNA
kromosom dari umbi bawang adalah murni (bebas dari RNA dan Protein) karena
masih mencakup range/nilai ambang batas kemurnian dengan rasio 0,852 µg/mL.

Saran

Pada saat praktikum seharusnya setiap pereaksi maupun larutan uji, tidak
boleh kontaminasi agar hasil yang diperoleh baik, pada saat pemipetan larutan
dipastikan volume larutan yang dipipet sesuai praktikum, agar komposisi
seimbang dan hasil yang di dapatkan tidak menyimpang. Saat praktikum
seharusnya waktu yang disediakan untuk mengamati proses pemisahan DNA
lebih lama agar DNA dapat lebih jelas terlihat. Dalam proses pengamatan
usahakan untuk memanfaatkan waktu sebaik mungkin dalam kegiatan agar kerja
lebih efektif.

DAFTAR PUSTAKA

Albert. 1994. Biologi Molekular Sel. Jakarta (ID) : Gramedia.

Boyer R. 1999. Concept in Biochemistry. Brooks Cole : Publishing Company.
Harrow.1954. Textbook Of Biochemistry 6th Edition. U.S.A: Saunders Company.
Kartika R dan Paramita C. 2012. Hereditas Manusia Buku Satu. Yogyakarta (ID) :
Jurdik Biologi FMIPA UNY.
Kusnawijaya. 1993.Biokimia. Bandung (ID): Exact Ganeca.
Murray. 2000. Biokimia Kedokteran. Andry Hartono, penerjemah. Jakarta (ID) :
Erlangga. Terjemahan dari : Medical Biochemistry.
Page D. 1997. Prinsip-Prinsip Biokimia. Jakarta (ID) : Erlangga.
Setiadi, Rahmat. 2001. Biokimia. Jakarta (ID) : Universitas Terbuka Indonesia
Press.
Yuwono T. 2009. Biologi Molekuler. Jakarta (ID) : Erlangga.