Teknik Dasar Pada Biologi Molekuler

BAB 1

Teknik Dasar Pada Biologi Molekuler

1.1 Penggunaan Enzim pada Biologi Molekuler

Penemuan dan sejumlah karakterisasi dari beberapa enzim telah membuat

pengembangan berbagai teknik analisis dan manipulasi DNA. Secara khusus, enzim
endonuclease restriksi tipe II telah memainkan peran kunci pada seluruh aspek biologi
molekuler. Enzim-enzim ini mengenali sekuens DNA spesifik, biasanya 4-6 base pairs (bp)
panjangnya, dan enzim ini membelah DNA dengan cara yang sesuai. Urutan yang dikenali
adalah palindromik atau sebuah sifat berulang yang terbalik, yaitu, mereka sama-sama
membaca di kedua arah pada setiap untai. Ketika dibelah mereka akan meninggalkan
fragmen flush-ended atau tak erat (juga disebut akhir kohesif) tergantung pada enzim
tertentu yang digunakan
Hal yang penting dari ujung yang tak erat adalah produk yang dihasilkan dari
molekul berbeda oleh enzim yang sama akan saling melengkapi (atau 'berikatan') dan
akhirnya mempererat satu sama lain (Tabel 1.1). Untaian yang erat akan disatukan oleh
ikatan hidrogen dengan dasar pelengkap pada helai yang berlawanan. Penggabungan kovalen
dari ujung pada masing-masing helai dapat melibatkan enzim DNA ligase. Hal ini banyak
dimanfaatkan dalam biologi molekuler untuk pengembangan rekombinan DNA, yaitu
penggabungan fragmen DNA dari berbagai sumber.
Gambar 1.1 Contoh pemisahan DNA dengan restriksi endonuclease. Panel bagian atas
menunjukkan hasil dari pembatasan pemisahan yang membentuk fragmen tumpul dengan
enzim HindIII. Panel bawah menunjukkan keterpaduan fragmen yang dihasilkan dari
pemisahan dengan enzim EcoR1.
Sekitar 500 enzim yang direstriksi telah ditemukan yang dikenali lebih dari 100
target sekuens yang berbeda. Beberapa dari enzim ini disebut isoschizomers, yang mengenali
sekuens target yang berbeda tetapi menghasilkan hal yang sama dari ujung yang tak kuat
(staggered ends) atau yang masih tergantung. Sejumlah enzim lain telah terbukti menjadi hal
yang bermakna dalam manipulasi DNA, seperti yang dirangkum dalam Tabel 1.2, dan
ditunjukkan pada poin-poin yang sesuai dalam teks tersebut.

Tabel 1.1 Contoh restriksi endonucleases yang mengenali sekuens terget yang berbeda dan
fragmen yang dihasilkan dari pemisahan
Tabel 1.2 Perbandingan berbagai metode pelabelan untuk DNA.

1.2 ISOLASI DAN PEMISAHAN ASAM NUCLEAT

1.2.1 Isolasi DNA

Penggunaan DNA untuk analisis atau manipulasi biasanya membutuhkan
DNA yang telah terisolasi dan dimurnikan sampai batas tertentu. DNA diambil dari sel
dengan metode yang paling lembut/ringan untuk pemecahan sel agar mencegah DNA tidak
terpotong atau robek secara mekanis.

EDTA yang mengikat ion Mg2+ yang dibutuhkan untuk enzim yang mendegradase
dari DNA menjadi DNAse. Idealnya, dinding sel, jika ada, harus dicerna secara enzimatik
(mis. pengobatan lisozim dari bakteri) dan membran sel harus dilarutkan menggunakan
deterjen. Jika dibutuhkan gangguan fisik, harus dibuat seminimal mungkin dan harus
melibatkan pemotongan atau penghimpitsn sel, daripada menggunakan cara robekan.
Gangguan sel (dan sebagian besar langkah selanjutnya) harus dilakukan pada suhu 4°C,
menggunakan glassware dan larutan yang telah diautoklaf untuk menghancurkan aktivitas
DNase (Gambar 1.2).
 Gambar 1.2 Diagram dari tahapan terkait ekstraksi DNA

Setelah melepaskan asam nukleat dari sel, RNA dapat dihilangkan melalui
perawatan dengan ribonuklease (RNase) yang telah dipanaskan untuk menonaktifkan
kontaminan DNase; RNase relatif stabil terhadap panas sebagai hasil dari ikatan disulfida
sehingga memastikan renaturasi molekul terjadi dengan cepat saat pendinginan. Kontaminan
utama lainnya seperti protein, dihilangkan dengan mengocok larutan dengan lembut bersama
fenol yang telah disaturasi dengan air atau dengan campuran aphenol-chloroform, yang
keduanya akan mengubah sifat protein selain asam nukleat.
Sentrifugasi emulsi yang dibentuk oleh pencampuran ini menghasilkan fase organik
yang lebih rendah yang terpisah dari bagian atas, yaitu fase aqueous pada permukaan protein
yang terdenaturasi. Larutan aqueous dipulihkan dan dideproteinisasi berulang kali, hingga
tidak ada lagi bahan yang terlihat di permukaan. Tahap akhir yaitu persiapan DNA yang
dideproteiniasi dicampur dengan dua volume etanol absolut dan DNA dibiarkan mengendap
di dalam freezer.