PERCOBAAN 7

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

Disusun oleh :
Ala Ahdiyani 3311171003
Anita Yulianti Karini 3311171004
Gita Aisha Puspita 3311171010
Bella Dewinta S. 3311171012
Fikri Muhammad Pratama 3311171030
Ranti Indah Hastuti 3311171041
No. Telp :089673980600

Farmasi A 2017
Kelompok 1
Jam Praktikum 10.00 - 13.00
Asisten Pembimbing :
Ririn Puspadewi, S.Si., M.Si., Apt

LABORATORIUM KIMIA FARMASI

PROGRAM STUDI SARJANA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI

CIMAHI

2019
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Prinsip Percobaan

Pemisahan berdasarkan adsorbsi senyawa pada fase diam dan migrasinya oleh fase
gerak

1.2 Tujuan Percobaan

1. Memperkenalkan cara analisis senyawa obat dengan KLT
2. Melatih kemampuan untuk melakukan KLT dan menerapkannya dalam
analisis senyawa obat
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Teori Umum

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan
perambatankomponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-
komponennya akan dipisahkanantara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase
diam akan menahan komponen campuransedangkan fase gerak akan melarutkan zat
komponen campuran. Komponen yang mudah tertahanpada fase diam akan tertinggal.
Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.
(Imam Haqiqi, Sohibul,2008)
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang berdasarkan kecepatan
perambatankomponen dalam medium tertentu. Uraian mengenai kromatografi pertama
kali dijelaskan olehMichael Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas
Warsawa Pada saat itu,Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmen-
pigmen lain dari ekstrak tanamanmenggunakan kromatografi kolom yang berisi dengan
kalsium karbonat. Pada kromatografi,komponen- komponen yang akan dipisahkan berada
diantara dua fase yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam adalah
fase yang akan menahan komponen campuransedangkan fase gerak adalah fase yang akan
melarutkan zat komponen campuran. Komponen yangmudah tertahan pada fase diam akan
tertinggal atau tidak bergerak sedangkan komponen yangmudah larut dalam fase gerak
akan bergerak lebih cepat. (Sudarmadji, 2007)
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik yang sederhana dan banyak
digunakan. Metode inimenggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi
penyerap untuk lapisan tipis dankering bentuk silika gel, alomina, selulosa dan polianida.
Untuk menotolkan larutan cuplikan padalempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro
pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah darilempeng dicelup dalam larutan pengulsi
di dalam wadah yang tertutup (Chamber) (Rudi, 2010)
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada
tahun 1938. KLTmerupakan bentuk kromatografi planar, selain kromatografi kertas dan
elektroforesis. Berbedadebgan kromatografi kolom yang mana fase diamnya diisikan atau
dikemas di dalamnya, padakromatografi lapis tipis, fase diamnya berupa lapisan yang
seragam (uniform) pada permukaanbidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat
aluminium atau pelat plastik. Meskipundemikian, kromatografi planar ini dapat dikatakan
sebagai bentuk terbuka dari kromatografi kolom. (Rohman, 2007)
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponennya, misalnya senyawa Flavonoida dan isoflavonoida yang terdapat
pada tahu, tempe,bubuk kedelai dan tauco serta Scoparia dulcis, Lindernia anagalis, dan
Torenia violacea. Yang padasenyawa isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa
kelebihan senyawa isoflavon yang potensialbagi kesehatan manusia, di antaranya adalah
sebagai antioksidan, antitumor / antikanker,antikolesterol, antivirus, antialergi, dan dapat
mencegah osteoporosis. Fase gerak yang dikenalsebagai pelarut pengembang akan
bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler padapengembangan secara menaik
(ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangansecara menurun
(descending). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan lebihmurah
dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan yang digunakan.
Dalamkromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih sederhana dan dapat
dikatakan hampirsemua laboratorium dapat melaksanakan setiap saat secara cepat
(Rohman, 2007).
Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas
dasar perbedaanadsorpsi atau partisi oleh pase diam dibawah gerakan pelarut pengembang.
Pada dasarnya KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas , terutama pada cara
pelaksanaannya. Perbedaan nyatanyaterlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya,
yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagaipengganti kertas. Bahan adsorben sebagai
fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbukselulosa. Partikel selika gel
mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentukikatan hidrogen
dengan molekul polar air. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali
jugamengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase
gerakmerupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. (Rudi, 2010)
Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis
tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan
komponen-komponen pada KLTdengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk
memisahkan komponen kimia tersebutdengan menggunakan kolom kromatografi dan
sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel daneluen yang digunakan berdasarkan basil
yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalaukepolaraan eluen pada kolom
kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT (Lenny, 2006)
 Pada hakekatnya KLT merupakan metoda kromatografi cair yang melibatkan dua
fasa yaitu fasa diamdan fasa gerak. Fasa geraknya berupa campuran pelarut pengembang
dan fasa diamnya dapat berupa serbuk halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap
(kromatografi cair-padat) atauberfungsi sebagai penyangga untuk lapisan zat cair
(kromatografi cair-cair). Fasa diam pada KLTsering disebut penyerap walaupun berfungsi
sebagai penyangga untuk zat cair di dalam sistemkromatografi cair-cair. Hampir segala
macam serbuk dapat dipakai sebagai penyerap pada KLT,contohnya silika gel (asam
silikat), alumina (aluminium oksida), kiselgur (tanah diatomae) danselulosa. Silika gel
merupakan penyerap paling banyak dipakai dalam KLT (Iskandar, 2007).

2.2 Prosedur Kerja (Anonim, 2015)

1. Sejumlah larutan yang mengandung logam diasamkan dengan asam asetat sehingga
pH 5. Kemudian ditambahkan sejumlah volume sama larutan dithizone dalam
kloroform kemudian kocok di dalam corong pisah. Pisahkan lapisan kloroformnya
dan cuci dengan larutan asam nitrat untuk menghilangkan kelebihan dithizonenya.
2. Totolkan sebanyak 10 mikro liter ekstrak kloroform di atas keeping kromatografi lapis
tipis yang telah diaktivir. Sejulah 2 cm ujung bawah dan jarak antara titik totolan kira-
kira 1,5 cm satu sama lainnya.
3. Camber kromatografi telah dijenuhkan dengan pelarut selama 2 jam. Penjenuhan
dapat dipercepat dengan menggunakan kertas saring yang dimasukkan kedalam
chamber.
4. Masukkan kromatografi yang telah ditotoli zat, biarkan selama bebrapa menit
sehingga larutan mencapai kira-kira 20 cm dari bawah. Angkat dan keringkan.
5. Hitung Rf tiap-tiap totolan dengan membagi jarak yang ditempuh oleh zat dengan
jarak yang ditempuh pelarut. Kemudian bandingkan dengan Rf pembanding.
 BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Alat
1. Bejana kecil
2. Pelat KLT yang berupa silika gel yang dilekatkan kertas alumunium
3. Pipa kapiler
3.2 Bahan
 Eluen A : n-heksan-kloroform-butanol = 1:1:1
 Eluen B : metanol-kloroform = 5:95
 Sampel
 Pembanding yang terdiri dari : sulfadiazin, sulfametoksazol, dan sulfadimidin
 Pelarut penampak bercak : larutan p-DAB HCL
3.3 Prosedur Percobaan
1. Setiap bejana kromatografi harus di jenuhkan terlebih dahulu dengan satu jenis eluen
(eluen A atau eluen B), dengan cara memasukan eluen kedalam bejana kemudian
didiamkan selama 24 jam ( bejana besar ) atau 30 menit ( untuk bejana kecil/ mikro ).
Hitunglah jumlah eluen yang di butuhkan
2. Pelat KLT di siapkan, dengan ukuran tertentu
3. Tentukan garis awal penotolan zat pada pelat KLT seperti pada gambar. Garis ini
berguna sebagai acuan untuk tempat penotolan zat, garis ini tidak boleh terendam dalam
eluen. Untuk KLT mikro jarak garis batas ( awal dan akhrir ) dengan tepi pelat KLT
sekitar 0,5-1,0 cm. Garis awal dan batas akhir eluen diperjelas dengan pensil (tidak
boleh dengan tinta pulpen ).
4. Lakukan penotolan zat ( sampel atau pembanding) dilakukan pada garis awal sebanyak
3 kali menggunakan pipa kapiler. Setiap menotolkan zat, harus dikeringkan dengan
bantuan pengering agar diameter bercak penotolan kurang dari 3 mm. Untuk setiap jenis
pembanding atau sampel menggunakan pipa kapiler yang berbeda.
5. Sampaikan proses elusi sampai eluen membasahi seluruh permukaan fasa diam menuju
garis batas akhir.
6. Setiap garis akhir tercapai , kromatogram dikeluarkan dari bejana , kemudian di
keringakan dengan di angin-angin.
7. Kromatogram yang sudah dikeringkan diamati dengan cara :
a. Pengamatan bercak di bawah lampu UV
b. Pengamatan bercak dengan penampak bercak yang disediakan
8. Nilai Rf setiap bercak ( pembanding dan sampel ) dihitung, kemudian dianalisis jenis
sampelnya.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

4. Fasa gerak :
-Eluen A: n-heksane, butanol, kloroform (1:1:1)
-Eluen B: metanol, kloroform (5:95)
5. Fasa diam :
-Plat KLT (Silika gel, Alumunium)
6. Sampel
7. Pembanding :
-Pembanding I : Sulfadiazin
-Pembanding II : Sulfametoksazol
-Pembanding III: Sulfadimidin

Tabel jarak yang ditempuh bercak

Sampel 1 Sampel 2 Pembanding 1 Pembanding 2 Pembanding 3

Eluen A 2,9 cm 4.2 cm 2,2 cm 4,1 cm 3,5 cm

Eluen B 0,5 cm - 0,4 cm 0,9 cm 0,7 cm

 Perhitungan Rf
Nilai Rf eluen A
2,9
Sampel 1 : = 0,52
5,5
4,2
Sampel 2 : = 0,76
5,5
2,2
Pembanding 1 : = 0,4
5,5
4,1
Pembanding 2 : = 0,74
5,5
3,5
Pembanding 3 : = 0,63
5,5

 Nilai Rf eluen B
0,5
Sampel 1 : = 0,09
5,5
 0,4
Pembanding 1 : = 0,07
5,5
0,9
Pembanding 2 : = 0,16
5,5
0,7
Pembanding 3 : = 0,12
5,5

 Nilai Rg sampel 1 eluen A

0,52
Pembanding 1 : = 1,30
0,4
0,52
Pembanding 2 : = 0,70
0,74
0,52
Pembanding 3 : = 0,82
0,63

 Nilai Rg sampel 2 eluen A

0,76
Pembanding 1 : = 1,9
0,4
0,76
Pembanding 2 : = 1,02
0,74
0,76
Pembanding 3 : = 1,2
0,63

 Nilai Rg sampel 1 eluen B

0,09
Pembanding 1 : = 0,12
0,7
0,09
Pembanding 2 : = 0,56
0,16
0,09
Pembanding 3 : = 0,75
0,12

4.2 Pembahasan
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk mengidentifikasi senyawa apa saja yang
terkandung pada obat tradisional dan dapat memilih fase gerak yang sesuai untuk pemisahan
senyawa dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Kromatografi
merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan suatu senyawa menjadi beberapa
komponen dengan menggunakan dua fase yaitu fase gerak dan fase diam. Pada KLT,
digunakan fase diam berupa lapisan tipis yang berada pada permukaan datar diatas pendukung
yang sesuai, biasanya digunakan silika yang mana sifatnya polar, sedangkan pada fase gerak
berupa cairan yang mana akan menaiki fase diam.

Pada praktikum yang kami lakukan, kami menganilisis sampel x dengan menggunakan

pembanding berupa Sulfadiazin, Sulfametoksazol, dan Sulfadimidin. Fase gerak yang digunakan

berupa Eluen A ( kloroform : n-heksane : butanol) (1:1:1) dan Eluen B (kloroform dan metanol) (5:95),
digunakan campuran dua pelarut organik karena campuran dari kedua pelarut ini mempunyai daya elusi

yang mudah diatur. Eluen A dan Eluen B dijenuhkan selama 30 menit sehingga didapatkan

pemisahan yang optimal. Fasa diam yg berupa Plat KLT di beri tanda garis awal setinggi 1 cm dari

bawah permukaan plat KLT dan garis akhir pada atas permukaan plat KLT setinggi 0,5 cm.

Prinsip KLT adalah adsorbsi dan partisi dimana adsorbsi adalah penyerapan pada

pemukaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu zat yang ada dalam

larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan. Kecepatan gerak senyawa-senyawa

ke atas pada lempengan tergantung pada :

a. Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut, hal ini bergantung pada bagaimana besar

atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.

b. Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya gel silika. Hal ini tergantung pada

bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan gel silika.

Setelah Eluen A dan Eluen B jenuh, dilakukan penotolan pada plat KLT sesuai pada titik yg

sudah di tandai (sampel, pembanding I, pembanding II, pembanding III), dilakukan pentolan

masing masing zat sebanyak 2-3 totol. Saat melakukan penotolan di pastikan secepat mungkin

pipa kapiler menyentuh plat KLT, agar dimeter noda tidak lebih dari 3,3 mm. Kemudian

dikibas kibas kan agar zat cepat kering. Plat KLT kemudian di masukkan ke dalam chamber

berisi Eluen A dan Chamber yg berisi Eluen B. Saat elusi terjadi perbedaan kecepatan pada

plat dengan perbedaan pada eluen yang digunakan hal ini disebabkan adanya perbedaan

kepolaran yang ada pada Eluen A dan Eluen B. Eluen B lebih cepat mengelusi plat

Kromatogram karena lebih polar sedangkan Eluen A sedikit lebih lambat mengelusi plat

kromatogram karena bersifat nonpolar

Dilakukan pengamatan proses elusi yg terjadi, setelah terelusi plat kromatogram di angkat dan

diamati bercak dan fluorosensi di bawah sinar Uv 254 nm Terlihat noda pada plat kromatogram

dan memberikan fluorosensi. Perubahan warna yang terjadi adalah pada saat diberi sinar UV.

Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yg ditambahkan
kedalamnya supaya menghasilkan pendaran flour ketika di berikan sinar UV . Sehingga pada

saat dilihat dibawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm terdapat beberapa spot yang

berfluorosensi dan sampel terpisah pada plat kromatogram yang di elusi menggunakan Eluen

A. Sampel dapat terpisah dikarenakan eluen A memiliki daya nonpolar sehingga elusi yang

terjadi sangat optimal. Terdapat fluorosensi hijau kekuningan pada bercak sampel dan bercak

pembanding II. Sedangkan pada Eluen B sampel tidak terpisah dan jarak spot dengan garis

awal sangat dekat. Dikarenakan eluen B bersifat sedikit polar. Setelah itu di beri tanda spot

spot yang terlihat pada plat kromatogram A dan plat kromatogram B.

Di hitung nilai Rf, Rf merupakan perbandingan jarak yang ditempuh solut

dengan yang ditempuh fase gerak. Nilai Rf merupakan derajat retensi suatu

komponen dalam fase diam. Nilai Rf yang besar menandakan bahwa senyawa tersebut
memiliki daya pisah zat terhadap solvent pada kondisi maksimum, sedangkan nilai Rf

yang kecil menandakan bahwa solvent memiliki daya pisah zat yang minimum. Bila
nilai Rf sama maka senyawa tersebut memiliki ciri yang sama, sedangkan jika nilai Rf

berbeda maka senyawa tersebut berbeda.

Didapati nilai Rf pada plat kromatogram A

Sampel 1 = 0,52
Sampel 2. = 0,76
Pembanding 1= 0,4
Pembanding 2= 0,74
Pembanding 3= 0,63
Dapat di lihat bahwa nilai Rf yg di miliki sampel 2 dan pembanding 2 hampir mendekati sama.
Bisa disimpulkan bahwa kemungkinan sampel x mengandung zat yang ada pada pembanding
2 yaitu sulfametoksazol.
Di hitung juga nilai Rf pada plat kromatogram B

Sampel 1 = 0,09
Pembanding 1 = 0,07
Pembanding 2= 0,16
Pembanding 3 = 0,12
Dapat dilihat bahwa nilai Rf pada plat kromatogram tidak ada yg memiliki kesamaan, jadi sulit
di simpulkan bahwa sampel mengandung zat apa.
Oleh karena itu untuk memastikan sampel mengandung zat apa dapat di lihat juga dari nilai
Rg, nilai Rg tidak boleh lebih dari 1
 Nilai Rg sampel 1 eluen A
Pembanding 1 = 1,30
Pembanding 2= 0,70
Pembanding 3 = 0,82
 Nilai Rg sampel 2 eluen A
Pembanding 1 = 1,9
Pembanding 2= 1,02
Pembanding 3 = 1,2
 Nilai Rg sampel 1 eluen B
Pembanding 1 = 0,12
Pembanding 2 = 0,56
Pembanding 3 = 0,75
Dapat disimpulkan bahwa nilai Rg yg mendekati 1 ada pada pembanding 2 dan pembanding 3,
maka dari itu sampel di duga mengandung senyawa sulfametoksazol dan sulfadimidin.
 BAB V
PENUTUP

5.1. Kesimpulan
1. Kromatografi dapat diartikan sebagai teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Kromatografi
lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin
dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran.
2. Kromatografi lapis tipis dapat diterapkan untuk menganalisis adanya senyawa
campuran golongan sulfonamida.
3. Hasil yang didapat setelah melakukan praktikum yaitu sampel nomer 2 mengandung
sulfametoksazol dan sulfadimidin.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2015, Penuntun Praktikum Kimia Organik, Fakultas Farmasi Universitas Muslim
Indonesia : Makassar.

Haqiqi, Sohibul Himam. 2008. Kromatografi Lapis Tipis. nadjeeb.files.wordpress

.com/2009/10/kromatografi.pd

Iskandar, Yusuf. 2007. Karakteristik Zat Metabolit Sekunder Dalam Ekstrak Bunga
Krisan(Chrysanthemum cinerariaefolium) Sebagai Bahan Pembuatan Biopestisida.
FMIPA. Semarang.

Khopkar, S,M. 2009. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia.

Rudi, L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Kendari: Universitas Haluoleo.

Sofia, Lenny. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merah
denganMetoda Uji Brine Shrimp. Sumatera Utara: USU Repository.
 LAMPIRAN

Plat Kromatografi lapis tipis Sampel senyawa Chamber eluen A

Chamber eluen B Hasil fluoresensi eluen A Hasil fluoresensi eluen B