Penilaian toksikologis terhadap rokok kretek Bagian 1: Latar belakang, pendekatan penilaian, dan

ringkasan temuan
Penilaian toksikologis rokok kretek
Penilaian toksikologis terhadap rokok kretek Bagian 2: Rokok kretek dan campuran Amerika, kimia
asap, dan toksisitas in vitro
Penilaian toksikologis terhadap rokok kretek bagian 3: Rokok kretek dan campuran Amerika,
toksisitas penghirupan
abstrak

Publikasi ini memperkenalkan serangkaian enam publikasi lain yang menjelaskan penilaian
toksikologis dari rokok kretek, yaitu, rokok yang ditandai terutama dengan penggunaan sejumlah
besar cengkeh sebagai bahan yang ditambahkan ke tembakau. Makalah ini menyajikan informasi latar
belakang tentang rokok kretek, menjelaskan pendekatan umum penilaian toksikologi in vitro dan in
vivo dari asap rokok kretek utama, menyajikan metodologi yang digunakan, dan merangkum hasil
dari program penilaian. Ringkasnya, asap dari rokok kretek memunculkan efek khas yang terkait
dengan asap rokok yang dikenal dari rokok campuran Amerika, tidak mengungkapkan toksisitas baru,
dan menunjukkan redaman berbeda yang tak terduga dari peradangan paru-paru. Berdasarkan jumlah
yang sama dari total partikel asap (TPM), rokok kretek menghasilkan lebih sedikit racun jika
dibandingkan dengan rokok campuran Amerika; ketika dinilai in vitro, asap dari rokok kretek kurang
sitotoksik (fase gas / uap) dan kurang mutagenik (TPM). Ketika dinilai in vivo, asap rokok kretek
menunjukkan toksisitas yang lebih rendah di saluran pernapasan. Ketika didasarkan pada dasar
nikotin yang sama, beberapa titik akhir toksisitas dalam rokok kretek menjadi setara dengan rokok
campuran Amerika. Data tersebut tidak menunjukkan potensi bahaya kretek yang meningkat
dibandingkan dengan rokok campuran Amerika.

Dua rokok kretek komersial yang tipikal untuk pasar Indonesia dan referensi rokok kretek
dibandingkan dengan rokok referensi Amerika 2R4F dengan karakterisasi kimia asap dan penilaian
sitotoksisitas dan mutagenisitas in vitro. Meskipun desain dan pengiriman rokok kretek yang dipilih
sangat beragam, komposisi asap dan data toksisitasnya secara in vitro menunjukkan pola yang
konsisten ketika data dinormalisasi menjadi pengiriman total partikel (TPM). Ini menegaskan
penerapan kesimpulan penelitian untuk berbagai produk rokok kretek. Setelah normalisasi ke
pengiriman TPM, hasil asap nikotin dari rokok kretek adalah 29-46% lebih rendah dibandingkan
dengan 2R4F. Hasil senyawa nitrogen lainnya juga jauh lebih rendah, kurang dari yang diharapkan
dari hanya penggantian sepertiga dari pengisi tembakau dengan bahan cengkeh. Hasil senyawa
pirolitik berat molekul ringan, terutama aldehida dan hidrokarbon, berkurang, sementara hasil
hidrokarbon aromatik polisiklik tidak berubah dan hasil fenol meningkat. Toksisitas in vitro yang
dinormalisasi diturunkan sesuai dengan itu, mencerminkan pengurangan hasil dalam senyawa
sitotoksik fase-gas dan beberapa senyawa mutagenik fase-partikulat. Hasil ini tidak mendukung
toksisitas yang lebih tinggi dari asap rokok kretek dibandingkan dengan rokok campuran Amerika.

Merek rokok kretek khas Indonesia dan rokok referensi kretek eksperimental dibandingkan dengan
rokok referensi 2R4F dalam dua studi inhalasi 90 hari. Tikus jantan dan betina terpapar pada hidung
saja terhadap asap utama selama 6 jam setiap hari, selama 90 hari berturut-turut. Titik akhir biologis
dinilai menurut pedoman OECD 413, dengan penekanan khusus pada histopatologi saluran
pernapasan dan pada peradangan paru-paru (kadar cairan lavage broncho-alveolar dari neutrofil,
makrofag, dan limfosit). Perubahan histopatologis meliputi: di hidung, hiperplasia, dan metaplasia
skuamosa dari epitel pernapasan dan metaplasia skuamosa serta atrofi epitel penciuman; di laring,
metaplasia skuamosa epitel dan hiperplasia; di paru-paru, akumulasi makrofag di alveoli dan
hiperplasia sel piala di epitel bronkial. Temuan ini secara kualitatif konsisten dengan pengamatan dari
studi serupa sebelumnya pada rokok konvensional. Dibandingkan dengan rokok 2R4F, paparan asap
rokok kretek dikaitkan dengan atenuasi inflamasi paru yang nyata dan perubahan histopatologis yang
kurang parah pada saluran pernapasan. Peradangan neutrofilik juga secara signifikan lebih rendah (>
70%). Hasil ini konsisten dengan pengamatan yang dilakukan pada kimia asap dan toksikologi in
vitro. Mereka tidak mendukung peningkatan toksisitas asap rokok kretek dibandingkan dengan rokok
campuran Amerika konvensional.

1. Latar Belakang
1.1. Umum
Publikasi ini memperkenalkan serangkaian enam publikasi lain yang menggambarkan penilaian
toksikologi in vitro dan in vivo rokok kretek. Penilaian ini dimaksudkan untuk mengisi kekosongan
dalam karakterisasi bahaya menggunakan data yang diperoleh di lingkungan Good Laboratory
Practice (GLP) yang ketat menggunakan Konferensi Internasional tentang Harmonisasi (ICH) dan
Organisasi untuk Uji Kerja Sama Kerangka Kerja Berbasis Ekonomi dan Pengembangan (OECD).
Makalah ini memberikan informasi latar belakang, menjelaskan pendekatan umum, kemudian
menyajikan metode dan merangkum hasil penilaian yang diuraikan secara rinci dalam publikasi lain
dari seri ini.
1.2. Sejarah rokok kretek
Rokok kretek adalah jenis rokok yang berasal dari Indonesia. Rokok ini terutama ditandai dengan
penggunaan asejumlah besar cengkeh dipotong, kuncup bunga kering dari pohon cengkeh (Syzygium
aromaticum, syn. Eugenia aromaticum), ditambahkan untuk tembakau sejak awal 1880-an.
Penambahan cengkeh itu dianggap membantu menyembuhkan sakit tenggorokan dan meringankan
asma dengan transfer dari eugenol hingga asap utama (MS). Eugenol dikenal untuk itu antiseptik
(Hemaiswarya dan Doble, 2009), antiinflamasi (Rodrigues et al., 2009; Yogalakshmi et al., 2010), dan
anestesi (Jual dan Carlini, 1976; Guenette et al., 2006) properti. Dengan demikian, rokok kretek dapat
dibeli di apotek setempat. Awalnya, rokok kretek juga merupakan produk linting dibungkus kertas
atau dibungkus dengan sekam jagung disetrika, dan menjadi jenis rokok yang disukai untuk perokok
dengan penghasilan lebih rendah. Itu mungkin tidak rata lintir tangan, penampilan minyak esensial
terlihat ditambahkan ke ketidaksukaan populasi kaya untuk merokok produk ini. Ketidaksukaan ini
tetap sampai akhir 1960-an. Pada pertengahan 1970-an produksi sebagian berubah menjadi produk
buatan mesin, tetapi itu baru pada pertengahan 1980-an produksi mesin terlampaui proses linting
tangan. Saat ini rokok kretek lebih disukai jenis rokok di Indonesia dengan pangsa pasar sekitar 92%
(WHO, 2009). Negara lain dengan beberapa pangsa pasar adalah Malaysia (2,9%), Singapura (4,4%),
Brunei (9,9%), India (0,3%), dan Brasil (0,5%).
Pada awal 1980-an, rokok kretek menjadi agak populer di Indonesia Amerika Serikat di antara kaum
muda, khususnya di sekolah menengah dan universitas California. Tren ini memuncak pada 1984,
ketika impor ke AS berjumlah 150 juta rokok kretek / tahun (CDC, 1985). Namun, impor menurun
tajam pada tahun 1985 menjadi 50 juta, dilaporkan karena publikasi tentang dugaan merugikan acara
(Guidotti et al., 1987, 1989). Selain itu, organisasi kesehatan masyarakat di AS dan di tempat lain
prihatin dengan keduanya hasil tar dan nikotin per rokok yang lebih tinggi bila dibandingkan dengan
rokok non-kretek dipasarkan dan inisiasi merokok sebelumnya meskipun data tentang lintasan
penggunaan kretek sebenarnya tidak ada. Di 2009, AS melarang rokok dengan citarasa yang khas
selain tembakau atau mentol, yang secara eksplisit mencakup larangan pada rokok dengan cengkeh
(FDA, 2009). Larangan ini telah ditantang oleh Indonesia di Organisasi Perdagangan Dunia. Brazil,
dengan pangsa pasar kecil rokok kretek, telah diberlakukan luaslarangan bahan pada tahun 2012, yang
mencakup larangan mentol dan rokok kretek. Namun, larangan bahan saat ini tidak masuk berlaku
karena perintah pengadilan dalam litigasi yang tertunda.
1.3. Karakteristik produk
Nama kretek adalah onomatopoeia, mis., Kata untuk sebuah objek yang meniru suara yang dihasilkan
objek; di sini berderak kebisingan yang dihasilkan siung saat dibakar: 'kretek kretek'. Inklusi cengkeh
memberi rasa dan aroma khas rokok inidapat menyebabkan kehalusan asap yang dirasakan (Guidotti
et al., 1989). Kandungan cengkeh rokok kretek bervariasi antara 20% dan 40% (b / b). Cengkeh
kering mengandung hingga 20% senyawa penyedap yang mudah menguap, fraksi yang mudah
menguap terutama (85%) terdiri dari fenol eugenol (2-metoksi-4- (2-propenil)). Dengan demikian,
pengisi (tembakau dan zat tambahan) rokok kretek dapat mengandung hingga 7% (b / b) eugenol.
Volatilitas utama lainnya pada cengkeh adalah eugenol asetat, caryophyllene, a-humulene, dan methyl
eugenol (Stanfill et al., 2003; Jirovetz et al., 2006; Musenga et al., 2006; Chaieb et al., 2007). Lebih
jauh, tidak seperti rokok buatan Amerika, rokok kretek di Indonesia lebih banyak dibuat dari
tembakau domestik. Kebanyakan dari mereka berasal dari Jawa, Sumatra, Bali, dan Lombok,
memasok ratusan industri jenis tembakau, berbagai varietas dan kadar. Selain itu keragaman, daun
tembakau hijau mungkin telah dipotong-potong sebelum dijemur (Rajangan) atau dibiarkan utuh
seperti daun utuh (Krosok). Hampir semua tembakau ini dijemur. Biasanya ada lebih banyak dari 20
varietas tembakau dalam campuran kretek. Selain tembakau dan cengkeh tanah, ada komponen ketiga
dari rokok kretek: saus (Polzin et al., 2007). Saus adalah campuran zat yang menjaga tembakau tetap
lembab, membantu memfasilitasi pembuatan mengolah, dan memberikan rasa dan aroma tembakau
yang khas dalam keadaan menyala rokok kretek setelah merokok. Secara historis, banyak petani
tembakau menerapkan saus komposisi yang dirahasiakan pada tembakau sebelumnya pengiriman ke
pabrik rokok. Hari ini, sebagian besar lebih besar produsen menambahkan bahan sendiri ke tembakau
di pabrik, yang memungkinkan perusahaan untuk mengevaluasi bahan digunakan untuk memastikan
bahwa mereka tidak meningkatkan toksisitas yang melekat pada asap pada tingkat penggunaan.
Rokok kretek dijual bersama dan tanpa filter. Karena konstruksi dan berat pengisi potong, hasil tar,
nikotin dan karbon monoksida (CO) sering lebih tinggi di rokok kretek dibandingkan dengan rokok
yang dipasarkan lainnya. TPM hasil 60 mg / rokok ketika dihisap sesuai standar Organisasi
Internasional untuk merokok mesin Standardisasi rejimen (IARC, 1985) berada di ujung yang tinggi.
1.4. Aspek sosial ekonomi
Sebagian besar rokok kretek diproduksi dan dikonsumsi di dalam negeri di Indonesia. Menariknya,
karena sistem perpajakan itu pajak rokok kretek buatan mesin pada tingkat yang jauh lebih tinggi dari
linting rokok kretek tangan, sekitar sepertiga dari rokok kretek masih hari ini digulung tangan di
pabrik, menyediakan pekerjaan untuk sekitar 200.000 orang Indonesia, sebagian besar dari mereka
perempuan. Tambahan 4–17 juta orang diperkirakan masuk pekerjaan di Indonesia yang secara tidak
langsung terkait dengan pembuatan rokok kretek. Dengan demikian industri kretek terbentuk pemberi
kerja terbesar kedua setelah Pemerintah Indonesia (Arnez, 2009).
Tiga produsen rokok kretek terbesar adalah Gudang Garam, Djarum, dan H.M. Sampoerna. Bersama-
sama, perusahaan-perusahaan ini memiliki andil di pasar Indonesia sebesar 65%. Produsen lain adalah
Bentoel International dan Saritoga dan sejumlah besar lokal penyedia dengan pangsa pasar marjinal.
Volume signifikan rokok kretek kini diekspor ke banyak negara di seluruh Indonesia dunia. Ekspor
rokok kretek dari Indonesia berjumlah Rp 500 juta USD / tahun (Yulisman, 2012).
2. Studi yang ada tentang risiko kesehatan
Meskipun dampak kesehatan dari merokok kretek di Indonesia belum diteliti secara sistematis,
kemungkinan itu merugikan efek tambahan untuk yang terkait dengan rokok konvensional akan
diidentifikasi di pasar tradisional Indonesia, yang mewakili populasi lebih dari 85 juta orang dewasa
kretek perokok (WHO, 2013). Misalnya, dalam ulasan yang berjudul 'Laporan tentang Tembakau di
Indonesia' tidak ada efek samping selain yang biasanya dikelompokkan sebagai 'penyakit yang
berhubungan dengan merokok' telah dilaporkan (Djutaharta dan Surya, 2003). Ulasan lain tentang
'produk tembakau nonkigaret' yang termasuk rokok kretek melaporkan tidak ada temuan baru selain
dari yang dilaporkan sebelumnya (Prignot et al., 2008; O'Connor, 2012). Dalam sebuah studi tentang
Bahasa Indonesia pekerja kayu, tidak ada hubungan antara peningkatan pernapasan gejala dan rokok
kretek bisa ditemukan, tetapi ada adalah hubungan terbalik antara obstruksi jalan napas dan merokok,
meskipun perbedaannya tidak signifikan secara statistik. Itu penulis menyarankan bahwa perilaku
merokok khusus perokok kretek mungkin menjadi penyebab kurangnya hasil yang merugikan, yaitu,
‘‘ yang mungkin dijelaskan oleh jenis rokok (kretek), di mana asap biasanya tidak dihirup '(Borm et
al., 2002).
4. Pendekatan umum
Selain publikasi ikhtisar ini, toksikologis penilaian asap rokok kretek seperti yang disajikan dalam seri
ini publikasi mencakup 3 topik utama:
(1) Karakterisasi (Bagian 2 (Piadé et al., 2014a) dan Bagian 3 (Piadé et al., 2014b)): tujuannya
adalah komparatif penilaian terhadap tolok ukur toksisitas asap rokok kretek dibandingkan
dengan rokok campuran Amerika: Dua tinggi menjual rokok kretek dari pasar Indonesia
termasuk yang terletak di dekat setiap akhir pengiriman TPM dari jenis kategori produk ini,
yaitu, satu di 16 dan yang lainnya pada 46 mg / rokok, ketika mesin dihisap menurut Rejimen
merokok ISO. Selain itu, rokok kretek ‘rujukan’ dengan pengiriman 34 mg TPM telah
dibangun dan termasuk yang merupakan rokok kretek khas dengan karakteristik konstruksi
itu, untuk parameter khas (mis., berat pengisi, komposisi pengisi, efisiensi filter, kertas
porositas) dekat dengan bagian tengah rentang paramete ditemukan untuk rokok kretek di
pasar Indonesia. Sebagai demikian, rokok referensi kretek ini (Kretek-R) dapat dianggap
sebagai rokok representatif untuk perbandingan rokok kretek dengan kategori produk
tembakau lainnya. Itu referensi rokok 2R4F dari University of Kentucky dimasukkan sebagai
rokok campuran Amerika. Rokok ini umumnya dianggap mewakili 12 mg segmen TPM ISO
dari campuran Amerika (Counts et al., 2006).
(2) Mekanisme (Bagian 4 (Roemer et al., 2014b) dan Bagian 5(Roemer et al., 2014c)): studi
mekanistik berusaha untuk mengungkap alasan perbedaan rokok kretek dan rokok American-
blended: rokok eksperimental dibangun yang memungkinkan mengevaluasi dampak tertentu
fitur desain produk khusus untuk rokok kretek, mis., Rokok campuran Indonesia tanpa
cengkeh (IND), tembakau Indonesia atau Amerika dicampur dengan cengkeh tambahan
(INDC, US-C), tembakau dan cengkeh campuran Indonesia setelah ekstraksi oleoresin -
'cengkeh yang dihabiskan' (IND-SC), dan tambahkan kembali ke IND-SC dari eugenol (IND-
SC-E) dan oleoresin (IND-SC-O), dan akhirnya rokok buatan Amerika peningkatan kadar
eugenol (0%, 2,5%, 5%, 10%).
(3) Bahan (Bagian 6 (Roemer et al., 2014a) dan Bagian 7 (Schramke et al., 2014)): menilai
pengaruh yang mungkin dari bahan tembakau yang digunakan dalam pembuatan rokok kretek
pada aktivitas biologis MS: Secara total, 350 bahan ditugaskan untuk tiga campuran bahan
(A, B, dan C). Setiap campuran diterapkan pada level target yang rendah dan tinggi untuk
diuji rokok diproduksi dengan campuran khas Indonesia tembakau dan cengkeh mewakili
rokok kretek yang dipasarkan memiliki bobot yang sama dengan rokok kontrol konstruksi
(cengkeh dan humektan) tetapi tanpa penambahan bahan. Seri tujuh publikasi ini telah diatur
sebagaimana diuraikan dalam Tabel 1.
1. Perkenalan
Publikasi ini adalah bagian dari seri yang merangkum in vitro dan penilaian toksikologi in vivo rokok
kretek. Merokok komposisi dan aktivitas biologis asap utama (MS) dari rokok kretek yang dipasarkan
dan eksperimental dievaluasi atas dasar perbandingan dalam analisis kimia asap, dan in vitro dan studi
toksisitas in vivo. Studi-studi dirancang untuk mencakup tiga topik utama: (1) karakterisasi kretek dan
perbandingan relatif terhadap rokok campuran Amerika, (2) dampak jenis campuran dan cengkeh, dan
(3) dampak bahan yang digunakan dalam rokok kretek. Informasi lebih lanjut tentang penilaian ini
dijelaskan dalam publikasi utama (Roemer et al., 2014c).
Sebagai bagian dari karakterisasi rokok kretek relatif terhadap Rokok campuran Amerika, dua merek
komersial Indonesia dan rata-rata seorang perwakilan rokok kretek eksperimental rokok kretek di
pasar Indonesia dievaluasi terhadap 2R4F referensi rokok buatan Amerika. Penilaian ini dilakukan
melalui karakterisasi kimiawi dari MS dan penentuan in vitro dari total partikulat MS (TPM)
mutagenisitas serta fase gas / uap (GVP) dan TPM sitotoksisitas.
1. Perkenalan
Publikasi ini adalah bagian dari seri yang merangkum in vitro dan penilaian toksikologi in vivo rokok
kretek. Komposisi asap dan aktivitas biologis asap utama (MS) dari rokok kretek yang dipasarkan dan
eksperimental dievaluasi pada dasar perbandingan dalam analisis kimia asap, dan in vitro dan studi
toksisitas in vivo. Studi-studi dirancang untuk mencakup tiga topik utama: (1) karakterisasi kretek dan
perbandingan relatif terhadap rokok campuran Amerika, (2) dampak jenis campuran dan cengkeh, dan
(3) dampak bahan yang digunakan dalam rokok kretek. Informasi lebih lanjut tentang penilaian ini
dijelaskan dalam publikasi utama (Roemer et al., 2014b).
Dalam Bagian 2 dari seri publikasi saat ini, keduanya merokokkomposisi dan aktivitas biologis MS
dari dua kretek yang dipasarkan rokok, termasuk Gudang Garam International Filter (selanjutnya)
disingkat Garam), dan referensi rokok kretek (Kretek-R) dievaluasi relatif terhadap referensi rokok
2R4F oleh asap analisis kimia dan studi toksisitas in vitro (Piadé et al., 2014). Pada bagian ini in vivo
menghasilkan dua inhalasi 90 hari yang independen studi, di mana rokok Garam dan Kretek-R
menjadi tolok ukur terhadap referensi rokok 2R4F, disajikan.

5. Metode
5.1. Umum
Bagian ini memberikan perincian teknis tentang metode yang digunakan. Itu set dasar penentuan
kimia dan uji biologis adalah sama untuk ketiga topik yang dicakup dalam seri publikasi ini (lihat
Bagian 4). Meskipun butuh sekitar 5 tahun untuk menyelesaikan keseluruhan program, rincian teknis
dari metode ini tetap virtual sama selama periode ini. Metodologi seperti yang dijelaskan di bawah ini
pada dasarnya sama dengan yang digunakan dalam pekerjaan penilaian produk lain dan telah
dipublikasikan secara luas (Carmines, 2002; Carmines et al., 2005; Lemus et al., 2007; Gaworski et
al., 2008, 2011; Moennikes et al., 2008; Patskan et al., 2008; Roemer et al., 2008, 2009; Zenzen et al.,
2012). Metode yang digunakan didasarkan pada pedoman pengujian internasional yang diterima
secara luas untuk makanan dan bahan kimia. Beberapa variasi metode kecil dalam proses studi
dianggap tidak relevan, tanpa berdampak pada hasil studi. Mereka tidak akan dilaporkan secara detail.
Mayoritas pekerjaan dilakukan di Philip Morris Research Laboratories di Cologne, Jerman, (kimia
asap dan toksisitas in vitro) dan, sebelum larangan eksperimen hewan terkait rokok, di Philip Morris
Research Laboratories di Leuven, Belgia (inhalasi toksisitas). Hanya dalam satu contoh (penilaian
eugenol murni di Rokok buatan Amerika), adalah pekerjaan yang dilakukan di IIT Lembaga
Penelitian (IITRI, Chicago, USA). Untuk alasan perbandingan, perbedaan dalam kekuatan respon dari
pengujian yang berbeda sistem di berbagai laboratorium dapat dihilangkan, jika pembaca merasa ini
perlu, dengan menormalkan data ke respon dalam referensi rokok 2R4F. Publikasi tunggal dalam seri
tidak akan mengulangi deskripsi metode yang dijelaskan dalam makalah ini, tetapi umumnya akan
merujuk pada publikasi ini.
5.2. Rokok dan generasi MS
Rujukan rokok 2R4F diperoleh dari University of Kentucky, Pusat Penelitian dan Pengembangan
Tembakau Kentucky. Rokok campuran Amerika yang digunakan untuk menyelidiki pengaruh eugenol
diproduksi di Philip Morris USA, Richmond, USA, dan yang digunakan untuk menilai pengaruh
bahan di PT HM Sampoerna Tbk, Pandaan, Indonesia. Rokok kretek yang dipasarkan diperoleh dari
pasar Indonesia (Gudang Garam International Filter dan Sampoerna A Mild) atau diproduksi untuk
tujuan studi khusus oleh PT HM Sampoerna Tbk, Pandaan, Indonesia (Kretek-R, IND, IND-SC, IND-
SC- E, IND-SC-O, IND-C, dan US-C). Spesifikasi lebih lanjut diberikan dalam publikasi individu.
Rokok dikondisikan sesuai dengan standar ISO 3402 (ISO, 1999), yaitu, setidaknya 48 jam pada
kondisi target 22 ± 1 C dan kelembaban relatif 60 ± 1%. Rokok dibongkar dan ditempatkan ke dalam
wadah terbuka di ruang pendingin (sekitar 200 batang per kontainer). Dalam studi untuk menilai
pengaruh bahan tambahan, rokok dibongkar dan disimpan dalam wadah tertutup selama minimal 14
jam pada suhu 22 ± 1 C. MS dihasilkan di bawah mesin merokok ISO 3308.
kondisi (ISO, 1991a). Penyimpangan kecil diperlukan untuk alasan teknis. Rokok-rokok itu dihisap
dengan mesin rotary rotary Borgwaldt 20-port (RM20H, Hamburg, Jerman) untuk penentuan kimia
asap dan pengujian in vitro dan pada mesin rotary merokok 30-port dengan knalpot aliran samping
yang aktif (Philip Morris Research Laboratories (PMRL) , SM2000), dilengkapi dengan pompa jarum
suntik ganda yang dapat diprogram (Radtke et al., 2007) untuk studi in vivo. Singkatnya, volume
kepulan, durasi kepulan, dan frekuensi kepulan untuk kondisi merokok ISO adalah 35 ml, 2 detik, dan
1 / menit. Rokok dihisap sampai panjang pantat terakhir 35 mm.
Para penulis telah sengaja memilih rejimen merokok ISO. Mereka mengikuti kesimpulan Roemer dan
Carchman (2011), bahwa rejimen merokok yang lebih intensif, misalnya, yang disyaratkan oleh
Health Canada (1999), kurang efisien dalam mendeteksi perbedaan yang mungkin terjadi dalam hasil
racun ketika membandingkan berbagai jenis rokok. Lebih lanjut, karena rejimen merokok yang lebih
intens jelas melebih-lebihkan penyerapan asap oleh perokok manusia dengan hasil tar yang lebih
tinggi, misalnya, sekitar 10 mg tar ISO, tampaknya jelas bahwa untuk rokok kretek dengan hasil
hingga tar tar 50 mg penerapan rejimen merokok yang intens, yang mengarah ke perkiraan hasil tar
jauh lebih dari 100 mg, akan mengarah pada data yang tidak relevan dengan perokok manusia.
5.3. Kimia MS
Selain analit ISO (TPM, nikotin, CO, dan air), analit lebih lanjut dipilih berdasarkan dua dokumen
sumber: proposal yang secara khusus berfokus pada pengujian kimia asap dari Komisi Keamanan
Produk Konsumen AS (US-CPSC, 1993) dan sebuah monograf dari Badan Internasional untuk
Penelitian Kanker (IARC, 1985). Daftar ini telah digunakan dalam sejumlah penelitian yang menilai
desain dan aditif rokok yang berbeda (Roemer et al., 2004; Carmines et al., 2005; Gaworski et al.,
2008; Werley et al., 2008; Zenzen et al., 2012).
Analisis dalam asap (sekitar 50 dalam studi individu) dikuantifikasi sesuai dengan metodologi yang
ditetapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya (Roemer et al., 2004):
ters (perbedaan berat sebelum dan sesudah menjebak). TPM juga digunakan untuk analisis analit fase
partikel individu (lihat di bawah). Nikotin ditentukan oleh kromatografi gas (GC) dengan deteksi
ionisasi nyala atau detektor fosfor nitrogen (NPD) dari ekstrak 2-propanol dari filter TPM dengan
isoquinoline sebagai standar internal. Air ditentukan dari ekstrak 2-propanol yang sama secara
kolorimetri dengan titrasi Karl Fischer. CO ditentukan oleh fotometri inframerah non-dispersif
(kalibrasi dengan gas referensi bersertifikat). Hasil tar dihitung sebagai hasil TPM dikurangi hasil
nikotin dan air.
Aldehyde (formaldehyde, acetaldehyde, acrolein, crotonaldehyde, dan propionaldehyde),
terperangkap dan diderivatisasi dengan larutan 2,4-dinitrophenylhydrazine yang diasamkan dalam
asetonitril pada dua impeler yang terhubung secara seri, ditentukan oleh kromatografi cair kinerja
tinggi dengan deteksi ultraviolet. 1,3-Butadiena, isoprena, benzena, toluena, vinilklorida, akrilonitril,
dan stirena dalam fase gas / uap (TPM dihilangkan dengan filtrasi filter Cambridge) terjebak dalam
perangkap dingin (es kering / rendaman alkohol isopropil) yang mengandung metanol dan dianalisis
dengan GC digabungkan ke spektrometri massa (GC / MS) dalam mode pemantauan ion yang dipilih.
Senyawa target yang dideuterasi digunakan sebagai standar internal.
Styrene dan acetamide dalam TPM diekstraksi dari filter Cambridge menggunakan aseton dan
dianalisis dengan GC / MS seperti yang dijelaskan untuk, misalnya, 1,3-butadiene. Analisis
akrilamida oleh GC / MS setelah ekstraksi dari filter Cambridge dan injeksi on-kolom telah dijelaskan
secara rinci (Diekmann et al., 2008). 2-Nitropropane diekstraksi dari MS yang terperangkap pada
kartrid silika dan dianalisis oleh GC dengan deteksi spektrometer massa triple quadrupole (GC / MS /
MS) dalam mode ionisasi kimia. Amina aromatik (o-toluidin, 2-naphthylamine, 4-aminobiphenyl, dan
o-anisidine) ditentukan dengan mengekstraksi TPM, dikumpulkan pada filter Cambridge, dengan
asam hidroklorat encer, diikuti oleh ekstraksi kembali dengan n-heksana setelah alkalinisasi,
derivatisasi dengan perfluoropropionic anhydride (PFPA), pembersihan dengan ekstraksi fase padat
(SFE), dan analisis oleh GC / MS / MS dengan spektrometer massa triple quadrupole dalam mode
reaksi berganda (MRM) melalui kehilangan hidrogen fluorida dari turunan PFPA mereka (Stabbert et
al. , 2003). Senyawa target yang dideuterasi digunakan sebagai standar internal. Nitrogen oksida
ditentukan oleh chemiluminescence setelah reduksi menjadi nitrogen oksida dan reaksi dengan ozon
(kalibrasi dengan gas referensi bersertifikat). Hidrogen sianida terperangkap dalam dua botol pencuci
dengan larutan natrium hidroksida dan dianalisis dengan headspace GC dengan deteksi peka nitrogen
setelah pengasaman sampel. Untuk evaluasi, metode standar eksternal digunakan. Volatile N-
nitrosamin (N-nitrosodiethylamine (NDEA), N-nitrosodimethylamine (NDMA), N-nitrosodi-n-
butylamine (NBUA), N-nitrosodi-n-propylamine (NPRA), N-nitrosomethylethylamine (NMEA), N-
nitrosopiperidine (NPI), dan N-nitrosopyrrolidine (NPY)), dikumpulkan pada filter Cambridge dan
dalam perangkap yang mengandung larutan buffer sitrat / fosfat. Larutan buffer dan ekstrak saringan
Cambridge digabungkan, diekstraksi dengan diklorometana, dimurnikan dalam natrium hidroksida,
dipekatkan, dibersihkan pada kolom alumina, dan dianalisis oleh GC dengan alat analisa energi termal
(TEA).
N-nitrosamin spesifik tembakau (TSNA: N0 -nitrosonornicotine) (NNN), dan 4- (N
nitrosomethylamino) -1- (3-pyridyl) -1-butanone (NNK)) dianalisis sesuai dengan metode yang
dipublikasikan (Wagner et al., 2005). TSNA diekstraksi dengan larutan amonium asetat dari TPM
yang terperangkap pada pad filter Cambridge, dan dianalisis dengan HPLC / MS / MS.
Fenol (fenol, katekol, dan hidrokuinon) diekstraksi dari filter Cambridge dengan triklorometana /
aseton (1: 1). Suatu alikuot ekstrak tersebut diderivatisasi dengan N, O bis (trimetilsilil)
trifluoroasetamid dan eter trimetilsilil fenol dianalisis dengan GC / MS. Senyawa target yang
dideuterasi digunakan sebagai standar internal. Eugenol diukur dalam menjalankan GC / MS terpisah
dengan kondisi kromatografi yang berbeda setelah penambahan carvacrol sebagai standar internal.
Hidrokarbon aromatik polisiklik (PAH) (benz [a] antrasena, benzo [a] pyrene, benzo [b] fluoranthene,
benzo [j] fluoranthene, benzo [k] fluoranthene, dibenz [a, h] antrasena, dibenzo [a, e] pyrene, dibenzo
[a, h] pyrene, dibenzo [a, i] pyrene, dibenzo [a, l] pyrene, indeno [1,2,3-cd] pyrene, dan 5
methylchrysene) diekstraksi dari TPM-filter dengan pentane / isooctane / undecane, dibersihkan oleh
SFE, dan ditentukan oleh GC / MS. Senyawa target yang dideuterasi digunakan sebagai standar
internal.
Arsenik, kadmium, kromium, nikel, dan timbal ditentukan dalam fase partikel yang terperangkap
dalam tabung gelas kuarsa menggunakan presipitasi elektrostatik. Kondensat dilarutkan dengan
campuran diklorometana / metanol, dan setelah penambahan asam nitrat, hidrogen peroksida, dan air,
sampel dikenai pencernaan gelombang mikro dan dianalisis dengan spektroskopi serapan atom.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Pilihan rokok campuran Amerika
Referensi rokok University of Kentucky 2R4F, yang banyak digunakan sebagai referensi dan monitor
rokok, dipilih dalam penelitian ini sebagai tolok ukur American-blended cigarett untuk perbandingan
rokok kretek. Desain dan komposisi campuran rokok referensi 2R4F dipilih untuk mewakili produk-
produk terpopuler yang dijual di pasar rokok AS (Chen dan Moldoveanu, 2003; Roemer et al.,
2012b). Pengisi rokok referensi 2R4F adalah campuran cerobong asap (32,5%), Burley (19,9%),
Oriental (11,1%), Maryland (1,2%) dan tembakau yang dibentuk kembali (27,1%), dengan
penambahan 5,3% gula terbalik dan 2,8% gliserin (Chen dan Moldoveanu, 2003; Roemer et al.,
2012b).
Versi yang berbeda dari seri rokok referensi R4F (1R4F, 2R4F dan 3R4F) diproduksi ketika
persediaan habis, tetapi perbedaan di antara versi-versi ini terbukti minimal (Counts et al., 2006;
Roemer et al., 2012b). Atas dasar analisis kimia dan uji mutagenisitas in vitro, dilaporkan pada tahun
2000 bahwa versi 1R4F adalah untuk segmen full tar rasa rendah dan 'rokok referensi yang dapat
diterima' untuk studi mutagenisitas komparatif dan studi kimia asap rokok yang tersedia di Pasar AS ''
(Chepiga et al., 2000). Elemen desain dasar tetap serupa selama beberapa tahun terakhir di antara
merek di pasar AS dan, rata-rata, hasil dari konstituen asap yang dipantau dari perwakilan merek AS
telah berubah sangat sedikit dari waktu ke waktu (Bodnar et al., 2012; Swauger et al. , 2002). Dengan
demikian dapat disimpulkan bahwa rokok referensi 2R4F tetap mewakili merek komersial AS dengan
pengiriman International Organization for Standardization (ISO) sekitar 10 mg tar per rokok (Counts
et al., 2006). Rujukan rokok 2R4F diperoleh dari University of Kentucky (Pusat Penelitian &
Pengembangan Tembakau Kentucky).
2.2. Pilihan rokok kretek
Rujukan rokok kretek dirancang dan diproduksi pada 2005 oleh PT Hanjaya Mandala Sampoerna
Tbk. untuk menjadi perwakilan dari rokok kretek paling populer yang dijual di pasar Indonesia,
mengikuti logika yang sama dengan yang mengarah pada pengembangan rokok 2R4F untuk
digunakan sebagai referensi dan perwakilan produk monitor dari rokok campuran Amerika dalam
studi banding . Ini disebut sebagai rokok referensi kretek (disingkat Kretek-R). Selain Kretek-R, dua
merek rokok kretek komersial dipilih dari portofolio Gudang Garam Tbk. dan Hanjaya Mandala
Sampoerna Tbk., dua produsen rokok kretek terbesar di Indonesia (Arnez, 2009), untuk mewakili
beragam desain yang berlaku di antara kretek buatan mesin rokok di pasar Indonesia.
Rokok Internasional Gudang Garam Filter (selanjutnya disebut Garam), merek terkemuka PT Gudang
Garam Tbk., Pada saat pengambilan sampel, adalah merek Indonesia terlaris. Garam adalah
perwakilan dari segmen tar tinggi rokok kretek buatan mesin; diameternya sedikit lebih besar dari
rokok campuran Amerika dan dilengkapi dengan filter pendek tanpa ventilasi. Rokok A Mild 16
(selanjutnya disebut Sampoerna) dipilih sebagai perwakilan dari segmen rokok tar kretek mesin yang
lebih rendah di pasar Indonesia. Rokok ini lebih panjang dan lebih ramping daripada rokok referensi
Amerika 2R4F dan kebanyakan merek rokok kretek komersial, dan dilengkapi dengan filter
berventilasi. Pada saat pengambilan sampel, rokok ini adalah merek terkemuka PT Hanjaya Mandala
Sampoerna Tbk.
2.3. metode analitis
Deskripsi terperinci mengenai analisis kimia, uji toksikologi, dan prosedur statistik dapat ditemukan
pada seri publikasi pertama ini (Roemer et al., 2014c). Secara singkat, asap dihasilkan dari semua
rokok uji sesuai dengan standar ISO 3308 dan 4387 (ISO-3308, 2000; ISO-4387-4, 2000). Rejimen
merokok ini dipilih, karena untuk rokok kretek dengan hasil hingga 50 mg ISO tar, penerapan rejimen
merokok yang lebih intens akan menyebabkan perkiraan hasil tar jauh lebih dari 100 mg per rokok.
Tampaknya agak tidak mungkin bahwa asupan sebenarnya dari seorang perokok mendekati nilai-nilai
tersebut.
Analisis kimia dilakukan pada fraksi TPM dan GVP. Metode yang digunakan untuk masing-masing
analit dirinci dalam publikasi utama (Roemer et al., 2014c). Uji Netral Serapan Merah (NRU)
digunakan untuk menilai sitotoksisitas TPM dan GVP, seperti yang dirinci sebelumnya (Bombick et
al., 1998; Roemer et al., 2002). Sebagai ukuran efek, kebalikan dari EC50 yang dihitung dilaporkan.
Untuk menilai mutagenisitas TPM, Salmonella Reverse Mutation Assay (Maron dan Ames, 1983)
dilakukan pada TPM dari setiap rokok menggunakan lima strain tester Salmonella typhimurium, baik
dengan dan tanpa sistem aktivasi metabolisme (S9).

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Umum
Rokok Garam dan Kretek-R dievaluasi terhadap referensi rokok Amerika 2R4F dalam dua studi
inhalasi 90 hari yang terpisah (Studi A dan B, masing-masing) dilakukan sesuai dengan Prinsip
Organisasi untuk Kerjasama Ekonomi dan Pembangunan (OECD) tentang Good Laboratory Practice
(GLP) (sebagaimana direvisi pada 1997) dan sesuai dengan pedoman OECD 413 (OECD, 1981).
Studi inhalasi dilakukan di fasilitas yang diakreditasi oleh AAALAC (Asosiasi Pengkajian dan
Akreditasi Laboratorium Perawatan Hewan) (AAALAC, 2006) di Leuven, Belgia (Laboratorium
Penelitian Philip Morris) di mana perawatan dan penggunaan tikus disesuaikan dengan Amerika.
Asosiasi untuk Kebijakan Ilmu Hewan Laboratorium tentang Perawatan yang Manusiawi dan
Penggunaan Hewan Laboratorium (www.aalas.org). Studi-studi tersebut disetujui oleh Komite
Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional setempat sesuai dengan undang-undang Belgia.
Deskripsi terperinci mengenai analisis kimia, uji toksikologi, dan prosedur statistik dapat ditemukan
pada seri publikasi pertama ini (Roemer et al., 2014b). Generasi asap, karakterisasi analitik dari
atmosfer uji, pemilihan dan perawatan hewan dan pemilihan parameter paparan dilakukan seperti
yang dirinci sebelumnya (Vanscheeuwijck et al., 2002). Mereka dapat diringkas sebagai berikut:
2.2. Rokok
Rokok yang diuji adalah rokok kretek komersial Indonesia, Gudang Garam International Filter
(disingkat Garam) dan rokok referensi kretek eksperimental (Kretek-R) yang dirancang untuk
mewakili rata-rata rokok kretek. Deskripsi terperinci tentang desain dan kinerja kedua rokok dapat
ditemukan di Bagian 2 dari seri publikasi ini (Piadé et al., 2014).
2.3. Generasi asap
Mesin rotary smoking, dioperasikan sesuai dengan International Organization for Standardization
(ISO) 3308 kondisi (ISO-3308, 2000) digunakan untuk terus menghasilkan MS mengikuti persyaratan
standar ISO 4387 (ISO-4387-4, 2000). Asap diencerkan di pintu keluar mesin dengan udara yang
disaring dan dikondisikan agar sesuai dengan konsentrasi target total partikulat (TPM) dan
dimasukkan ke ruang paparan.
2.4. Paparan
Kedua studi inhalasi dilakukan dengan menggunakan TPM konsentrasi target 100 lg / l (Rendah), 150
lg / l (Sedang) dan 200 lg / l (Tinggi) untuk kedua rokok kretek serta untuk rokok referensi 2R4F.
Tikus jantan Sprague-Dawley jantan dan betina yang kedinginan terpapar di hidung selama 6 jam
setiap hari, selama 90 hari berturut-turut. Kelompok kontrol hewan terpapar ke udara yang disaring
dan disamarkan (Sham). Penelitian dilakukan dengan 10 tikus per kelompok, per jenis kelamin dan
per titik waktu nekropsi. Suhu rata-rata atmosfer uji adalah 21,6 C dan kelembaban relatif 54%.
Periode inhalasi dimulai dengan periode adaptasi dosis (yaitu, 1 = 4, ½, dan 3 = 4 dari durasi paparan
harian akhir pada hari 1, 2, dan 3, masing-masing). Penilaian sementara dilakukan untuk semua titik
akhir setelah paparan selama 35 hari, dan hewan pasca inhalasi diizinkan pemulihan 42 hari sebelum
pengorbanan untuk menyelidiki reversibilitas, persistensi, dan keterlambatan timbulnya efek yang
berhubungan dengan asap. Untuk mengkarakterisasi atmosfir pengujian dan memeriksa
reproduksibilitas pembuatan dan pengenceran MS, konsentrasi TPM dan karbon monoksida (CO)
ditentukan setiap hari. Selain itu konsentrasi asetaldehida di udara, akrolein, formaldehid dan nikotin
ditentukan setiap minggu, dan distribusi ukuran partikel dinilai pada dua kesempatan yang berbeda.
2.5. Titik akhir
Kesehatan hewan secara umum dipantau oleh berat badan dan konsumsi makanan. Titik akhir yang
dianalisis mencakup semua parameter yang ditentukan dalam pedoman OECD 413 (OECD, 1981),
dan ditentukan pada korban sementara (setelah 35 hari) dan pada akhir periode inhalasi.
Berat ditentukan untuk organ utama. Respon inflamasi paru dinilai dengan kuantifikasi neutrofil,
limfosit, dan makrofag alveolar dalam cairan lavage broncho-alveolar (BALF) (Friedrichs et al.,
2006). Pemeriksaan histopatologis dilakukan dengan penilaian laring, bifurkasi trakea, dan paru-paru.

Ringkasan hasil
Dua merek rokok kretek komersial yang khas untuk pasar Indonesia dan satu rokok kretek mewakili
rata-rata rokok kretek yang dipasarkan (rokok referensi kretek - Kretek-R) dibandingkan satu sama
lain dan dengan rokok referensi standar Amerika 2R4F yang berkaitan dengan kimia kimia asap, pada
sitotoksisitas vitro (Uji NRU), dan mutagenisitas bakteri in vitro (Salmonella Reverse Mutation
Assay).
Meskipun desain yang sangat beragam dari dua rokok kretek terpilih dan rokok referensi kretek
menghasilkan TPM menghasilkan 16 hingga 46 mg / rokok, komposisi asap dan toksisitas in vitro
tidak menunjukkan perbedaan yang berbeda ketika data dinormalisasi untuk pengiriman TPM yang
sama. Ini mendukung penerapan kesimpulan yang ditarik dari hasil kami ke berbagai produk rokok
kretek.
Pada basis per TPM per mg, rokok kretek tampaknya mirip dengan rokok campuran Amerika dalam
kimia asap, meskipun hasil senyawa nitrogen jauh lebih rendah daripada yang diharapkan dari
penggantian hanya sepertiga dari pengisi tembakau dengan bahan cengkeh. . Hasil dari molekul
rendah E. Roemer et al. / Regulatori Toksikologi dan Farmakologi 70 (2014) Senyawa S2-S14 S9
yang dibentuk oleh pirolisis tembakau dan pengisi cengkeh, terutama hidrokarbon dan aldehida, juga
berkurang, tetapi fenol meningkat.
Pada basis TPM per mg, sitotoksisitas TPM rokok kretek in vitro mirip dengan rokok campuran
Amerika, namun sitotoksisitas GVP rokok kretek umumnya jauh lebih rendah (perbedaannya sekitar
50%). Mutagenisitas bakterial dari rokok kretek TPM umumnya sekitar 50% lebih rendah pada semua
galur penguji responsif.
Toksisitas kretek komersial Gudang Garam dan Kretek-R dinilai dibandingkan dengan rokok referensi
Amerika 2R4F dalam dua studi inhalasi independen 90 hari pada tikus jantan dan betina. Titik akhir
biologis yang dianalisis adalah yang tercantum dalam pedoman OECD 413 tetapi dengan penekanan
khusus pada histopatologi saluran pernapasan dan peradangan paru-paru yang diukur dengan jumlah
sel paru-paru gratis dan diferensiasi dalam BALF.
Dalam kedua studi, tikus (kelompok kretek dan American-blended 2R4F) menanggapi paparan asap
rokok dengan perubahan histologis iritasi pada saluran pernapasan yang biasa terlihat dalam studi
inhalasi asap rokok, yaitu, hiperplasia, metaplasia, dan atrofi tergantung pada jenisnya. dan lokasi
epitel. Sebagai respon inflamasi, jumlah neutrofil dan limfosit meningkat secara signifikan pada
BALF dibandingkan dengan tikus yang dipalsukan dengan rasa malu. Respons terhadap asap serupa
untuk kedua jenis rokok kretek, tetapi jelas lebih rendah dibandingkan dengan 2R4F.
Parameter pernapasan, karboksihemoglobin darah, dan ekskresi metabolit nikotin dalam urin
menunjukkan serapan MS yang sama di antara semua kelompok yang terpapar asap utama (American
blended and kreteks). Dengan demikian, efek anestesi eugenol di saluran pernapasan, menutupi iritasi
asap, dan menyebabkan peningkatan inhalasi, dapat dikesampingkan. Terlepas dari penyerapan asap
yang setara, dibandingkan dengan tikus yang terpapar 2R4F MS, respons pada kelompok rokok kretek
secara konsisten lebih rendah.
Secara keseluruhan, rokok kretek mencetak sekitar 20% lebih rendah pada titik akhir histopatologis
yang paling responsif (yang menunjukkan skor rata-rata 1,5 dan lebih tinggi pada kelompok yang
terpapar asap rokok). Patut dicatat, epitel penciuman di berbagai lokasi di hidung jauh lebih sedikit
terpengaruh pada kelompok rokok kretek. Sementara sebagian besar tikus dari kelompok 2R4F
umumnya menunjukkan perubahan seperti atrofi, metaplasia skuamosa atau hilangnya ikatan saraf,
hampir tidak ada tikus dari kelompok rokok kretek yang menunjukkan temuan tersebut. Respon yang
lebih rendah pada kelompok kretek paling menonjol pada jumlah sel inflamasi pada BALF; jumlah
neutrofil lebih dari 80% lebih rendah daripada kelompok 2R4F yang sebanding.
Parameter pernapasan, karboksihemoglobin darah, dan ekskresi metabolit nikotin dalam urin
menunjukkan serapan MS yang sama di antara semua kelompok yang terpapar asap utama (American
blended and kreteks). Dengan demikian, efek anestesi eugenol di saluran pernapasan, menutupi iritasi
asap, dan menyebabkan peningkatan inhalasi, dapat dikesampingkan. Terlepas dari penyerapan asap
yang setara, dibandingkan dengan tikus yang terpapar 2R4F MS, respons pada kelompok rokok kretek
secara konsisten lebih rendah.
Secara keseluruhan, rokok kretek mencetak sekitar 20% lebih rendah pada titik akhir histopatologis
yang paling responsif (yang menunjukkan skor rata-rata 1,5 dan lebih tinggi pada kelompok yang
terpapar asap rokok). Patut dicatat, epitel penciuman di berbagai lokasi di hidung jauh lebih sedikit
terpengaruh pada kelompok rokok kretek. Sementara sebagian besar tikus dari kelompok 2R4F
umumnya menunjukkan perubahan seperti atrofi, metaplasia skuamosa atau hilangnya ikatan saraf,
hampir tidak ada tikus dari kelompok rokok kretek yang menunjukkan temuan tersebut. Respon yang
lebih rendah pada kelompok kretek paling menonjol pada jumlah sel inflamasi pada BALF; jumlah
neutrofil lebih dari 6,2. Mekanisme (Bagian 4 (Roemer et al., 2014b) dan Bagian 5 (Roemer et al.,
2014c))
Kimia asap, sitotoksisitas in vitro (Neutral Red Uptake Assay) dan mutagenisitas bakterial
(Salmonella Reverse Mutation Assay) MS dari American-blended rokok dengan atau tanpa
penambahan 2,5%, 5% atau 10% eugenol ke pengisi tembakau, dan dalam rokok campuran Indonesia
tanpa dan dengan penambahan cengkeh, cengkeh diekstraksi dengan etanol panas (cengkeh bekas,
SC), dan SC diisi ulang dengan eugenol atau minyak cengkeh (oleoresin) ditentukan. Selain itu,
aktivitas genotoksik dalam sel mamalia (Mouse Lymphoma Assay) diukur untuk eugenol sebagai zat
tunggal.
Penambahan eugenol pada tembakau mengurangi konsentrasi (per mg TPM) dari hampir semua
konstituen asap yang diukur dalam MS jika dibandingkan dengan rokok kontrol tanpa eugenol. Pada
tingkat penambahan tinggi 10%, pengurangan untuk sebagian besar unsur asap sekitar 35%.
Penambahan eugenol tidak memiliki efek yang berbeda pada sitotoksisitas TPM in vitro sedangkan
sitotoksisitas (per mg TPM) dari GVP menurun hingga 40% dalam cara yang tergantung pada dosis.
Mutagenisitas TPM dalam galur bakteri yang paling responsif (TA98, TA100, TA1537; semuanya
dengan aktivasi metabolisme) sekitar 50% lebih rendah pada tingkat penambahan eugenol yang
tinggi. Pengurangan ini juga tergantung pada dosis. Eugenol diuji sebagai zat tunggal yang ditemukan
aktif (peningkatan frekuensi mutan oleh faktor 2 kontrol di atas) dalam Mouse Lymphoma Assay
dengan aktivasi metabolik pada konsentrasi 20 lg / ml. Namun, konsentrasi ini terbukti sangat
sitotoksik (pertumbuhan total relatif 20% dari kontrol). Data mutagenisitas pada tingkat sitotoksisitas
ini umumnya dianggap tidak relevan untuk penilaian toksikologis suatu zat (OECD, 1997b).
Penambahan SC ke rokok campuran Indonesia menyebabkan peningkatan, misalnya, dalam 1,3-
butadiene, benzene, catechol, pyrene, dan PAH ketika dinyatakan berdasarkan TPM per mg.
Penurunan terlihat misalnya, nikotin, air, formaldehida, asetamida, akrilamida, dan TSNA. Ketika SC
diisi kembali dengan eugenol atau oleoresin, atau ketika cengkeh yang tidak diolah ditambahkan ke
tembakau, hasil dari hampir semua konstituen asap yang diukur menurun secara substansial di bawah
tingkat yang ditemukan untuk rokok yang hanya tembakau, misalnya, berkurang hingga sekitar 40%
untuk karbonil, 2-nitropropana, dan TSNA. Penambahan SC dengan dan tanpa eugenol atau oleoresin
pada tembakau tidak memiliki efek yang berbeda pada sitotoksisitas TPM secara in vitro.
Sitotoksisitas GVP sedikit menurun dengan penambahan SC dan sampai 40% jika SC diisi ulang
dengan oleoresin atau cengkeh penuh ditambahkan. Demikian juga, mutagenisitas bakteri TPM
menurun. Pada TA98 tester yang paling sensitif dengan aktivasi metabolik, pengurangannya masing-
masing sebesar 30% dan 40% untuk SC dengan oleoresin atau cengkeh penuh.
Rokok yang sama dengan eugenol dan cengkeh serta komponennya yang dinilai untuk komposisi asap
dan toksisitas in vitro juga dievaluasi untuk toksisitas inhalasi. Rokok dengan dan tanpa penambahan
eugenol dievaluasi dalam 35 hari dan rokok kretek dalam studi inhalasi tikus 90 hari, 80% lebih
rendah dibandingkan kelompok 2R4F yang sebanding.
Penambahan berbagai jumlah eugenol ke dalam pengisi tembakau
menghasilkan pengurangan yang berbeda dan tergantung konsentrasi dari perubahan iritasi pada
saluran pernapasan. Sebagian besar pengurangan hingga 80% hingga 90% dibandingkan dengan
kontrol. Pada tingkat penambahan eugenol yang tinggi, beberapa efek yang diinduksi asap, misalnya,
metaplasia skuamosa epitel pernapasan dan ulserasi epitel olfaktorius pada hidung level 2 tidak ada.
Penurunan jumlah sel BALF yang jelas, yang mengindikasikan respons peradangan paru, juga tidak
ada. Paling jelas adalah pengurangan neutrofil hingga 70%.
Penambahan SC ke tembakau menyebabkan peningkatan iritasi
perubahan pada saluran pernapasan bagian atas pada tingkat hidung 2-4 yang diberi skor sekitar 30%
lebih tinggi daripada untuk rokok tanpa penambahan cengkeh. Ini berbeda dengan laring dan paru-
paru di mana efek rokok dengan cengkeh sekitar 30% lebih rendah. Pengisian SC dengan eugenol
atau oleoresin meniadakan perubahan pada saluran pernapasan bagian atas yang kembali ke tingkat
yang ditemukan untuk rokok campuran Indonesia tanpa penambahan komponen cengkeh.
Penambahan cengkeh penuh pada tembakau cenderung menghasilkan perubahan iritasi sekitar 30%
lebih rendah dibandingkan dengan rokok bebas cengkeh.
Hasil untuk laring dan paru-paru tidak konsisten; tetapi penambahan cengkeh penuh untuk tembakau,
rata-rata, menghasilkan respons yang lebih rendah daripada rokok cengkeh sama sekali. Angka
neutrofil di BALF adalah yang terendah di
tikus yang terpapar MS dari rokok dengan SC dan penambahan oleoresin, mis., pengurangan lebih
tinggi dari? 95%, dibandingkan dengan rokok bebas kretek. Namun, rokok dengan penambahan
cengkeh penuh juga menunjukkan penurunan jumlah neutrofil sekitar 60%.
Singkatnya, data ini menunjukkan bahwa pengiriman eugenol di MS dapat mencapai sekitar 50% dari
pelemahan yang diamati di S10 E. Roemer et al. / Regulatori Toksikologi dan Farmakologi 70 (2014)
S2-S14 peradangan paru, sedangkan rokok kretek 'lengkap' menambah 50%, mungkin karena
spektrum yang berbeda dari produk pembakaran untuk cengkeh (dibandingkan dengan tembakau) dan
mungkin karena perubahan pembakaran proses, bila dibandingkan dengan rokok campuran Amerika.
Dapat berspekulasi, bahwa oleoresin dalam cengkeh mendukung pembakaran yang lebih lengkap,
yang mengarah pada pengiriman zat sitotoksik / iritasi yang lebih rendah.
6.3. Bahan (Bagian 6 (Roemer et al., 2014a) dan Bagian 7 (Schramke
et al., 2014))
Kimia asap, sitotoksisitas in vitro (Neutral Red Uptake Assay) dan mutagenisitas / genotoksisitas sel
mamalia (Salmonella Reverse Mutation Assay, Mouse Lymphoma Assay) MS dari rokok kretek
eksperimental dengan dan tanpa tiga campuran bahan pada tingkat rendah (tingkat penggunaan) dan
tingkat aplikasi yang tinggi (2,5 atau 3 kali tingkat penggunaan) diselidiki. Yang dinilai adalah total
350 bahan yang biasa digunakan dalam kombinasi berbeda dalam pembuatan rokok kretek.
Hanya ada beberapa perbedaan yang signifikan secara statistik dalam komposisi asap antara rokok
kontrol (tanpa ditambahkan
bahan-bahan) dan uji rokok (dengan bahan-bahan), tetapi hampir semua perbedaannya kurang dari ±
20% dan umumnya tidak ada bukti hubungan dosis-respons terhadap tingkat bahan. Toksisitas in
vitro, seperti yang dinilai dalam tiga tes, hampir sama untuk rokok kretek eksperimental dengan dan
tanpa campuran bahan tambahan dan masing-masing perbandingan tidak menunjukkan perbedaan
yang signifikan secara statistik.
Toksisitas MS dari rokok yang sama diuji dalam studi inhalasi 90 hari dengan periode pasca-inhalasi
(pemulihan) dan uji micronucleus 4 hari pada tikus. Parameter pernapasan, karboksihemoglobin
darah, dan ekskresi metabolit nikotin dalam urin menunjukkan serapan MS yang sama dari kontrol
dan uji rokok. Tidak ada perbedaan yang luar biasa dalam pengamatan klinis, konsumsi makanan,
berat badan, investigasi oftalmologis, kimia klinis, hematologi, bobot organ atau patologi kotor. Tidak
ada indikasi perubahan histopatologis terkait bahan dalam saluran pernapasan, meskipun kadang-
kadang ada perbedaan yang signifikan secara statistik antara kontrol dan kelompok uji rokok pada
akhir periode inhalasi 90 hari dan titik waktu pasca-inhalasi tanpa konsistensi. (tidak adanya
perbedaan yang sama di lokasi morfologi yang berdekatan atau pada jenis kelamin lainnya; tidak
adanya hubungan dosis / respons bahan). Dalam uji 4 hari mikronukleus campuran bahan tidak
meningkatkan proporsi sel berenergi mikro dalam sumsum tulang dan darah tepi relatif terhadap yang
diamati pada kelompok kontrol tanpa campuran bahan. Lebih lanjut, tidak ada perbedaan statistik
yang terlihat ketika sel-sel sumsum tulang dikelompokkan berdasarkan eritrosit polikromatik dan
retikulosit mikronukleasi

3. Hasil
3.1. Analisis tembakau
Menurut pembuatnya, desain rokok Kretek-R didasarkan pada bahan pengisi yang terbuat dari
campuran 55% Krosok dan 45% tembakau Rajagan, dengan penambahan cengkeh kering untuk
mencapai level 31% dalam campuran akhir. Humektan ditambahkan sebagai alat bantu pengolahan
tembakau dan memotong campuran cengkeh pada tingkat 4,5%. Sampel pengisi tembakau dari rokok
kretek komersial dikenai penyaringan optis dari komponen campuran untuk menilai desain campuran
mereka. Tembakau yang digunakan dalam pengisi kedua rokok kretek ini juga kemungkinan
merupakan campuran tembakau Indonesia yang disembuhkan dengan jenis tembakau yang lebih
banyak digunakan seperti cerobong asap dan Oriental. Kedua merek tersebut tampaknya mengandung
tembakau yang dilarutkan. Seperti yang diharapkan untuk produk pengiriman yang lebih rendah,
rokok Sampoerna mengandung sekitar 7% dari tembakau yang diperluas1 tetapi rokok Garam tidak.
Tingkat penggabungan cengkeh dalam pengisi rokok Sampoerna adalah 31% .2 Ringkasan komparatif
dari parameter desain utama dari empat rokok yang diuji diberikan pada Tabel 1.
Kedua rokok kretek selanjutnya dikarakterisasi dengan mengukur kadar eugenol pengisi. Dari tingkat
eugenol yang diukur, proporsi cengkeh potong dalam rokok Garam diperkirakan agak lebih tinggi
daripada di Sampoerna, dalam kisaran 31-35%. Hasil analisis kolorimetri mengenai kadar amonia-
nitrogen, gula pereduksi, dan total alkaloid dalam pengisi tembakau tercantum dalam Tabel 2,
dinyatakan sebagai persen dari berat kering pengisi. Juga ditunjukkan pada Tabel 2 adalah komponen
pengisi tingkat omajor terukur dari minyak esensial cengkeh, yaitu, eugenol, eugenol asetat dan b-
caryophyllene untuk setiap rokok kretek yang diuji dalam penelitian ini.
3.2. Kimia asap
3.2.1. Parameter ISO dan eugenol
Rata-rata hasil ISO carbon monoxide (CO), nikotin dan tar dari rokok yang diuji ditunjukkan pada
Tabel 3. Rokok referensi 2R4F dihisap bersamaan dengan setiap kretek dianalisis. Secara
keseluruhan, hasil rata-rata 9,9 mg / rokok tar dan 12,7 mg / rokok CO berdasarkan hitungan kepulan
9,5 diamati, yang sesuai dengan data yang dipublikasikan (Davies dan Vaught, 2003).
Ketika melaporkan rasio masing-masing pengiriman rokok kretek ke pengiriman rokok campuran
Amerika, perhitungan dilakukan dengan menggunakan data referensi rokok 2R4F yang dihasilkan
bersamaan dengan analisis rokok kretek. Mencerminkan efek encer dari cengkeh potong dalam
pengisi rokok yang berkontribusi pada TPM tetapi tidak menghasilkan nikotin, pengiriman nikotin
dari rokok kretek masing-masing 39%, 29% dan 46% lebih rendah daripada yang diharapkan jika
mereka memiliki rasio tar / nikotin yang sama dengan rokok referensi 2R4F. Tingkat transfer eugenol
di Sampoerna, Garam dan rokok Kretek-R ditentukan, bersama dengan nikotin dan tar, dalam
kegiatan merokok khusus tambahan. Tingkat transfer untuk eugenol di Sampoerna, Garam dan rokok
Kretek-R ditentukan masing-masing 15,7%, 17,8% dan 14,3% dari total pengiriman TPM (Tabel 4).
3.2.2. Penilaian berdasarkan kelas senyawa
Untuk semua konstituen MS yang diukur, pengiriman asap dari setiap rokok kretek dan rokok
referensi 2R4F yang dinyatakan pada basis per rokok diberikan pada Tabel A pada Lampiran. Dalam
semua kasus, perbedaan antara rokok kretek dan pengiriman referensi rokok 2R4F secara statistik
signifikan. Seperti yang dibahas dalam publikasi utama, hasil harus dinormalisasi untuk penilaian
komparatif bermakna dari komposisi asap dan toksisitas in vitro yang akan dilakukan ketika
membandingkan rokok dengan desain dan kisaran pengiriman yang sangat berbeda. Dalam situasi saat
ini normalisasi oleh TPM dianggap paling tepat (Roemer et al., 2014c). Perbedaan relatif dari hasil
konstituen dibandingkan dengan pengiriman rokok referensi 2R4F ketika dihisap dalam batch analitis
yang sama, dan dinormalisasi oleh hasil TPM, disajikan pada Tabel 5. Pentingnya persen yang
diamati berubah relatif terhadap pengiriman referensi rokok 2R4F, ketika diukur bersamaan dengan
penentuan rokok kretek dan dinormalisasi dengan hasil TPM, dinilai dengan analisis varians
(ANOVA) diikuti oleh tes Dunnett seperti yang dirinci dalam publikasi utama (Roemer et al., 2014c).
Hasil semua uji statistik pada perbedaan juga dilaporkan dalam Tabel 5. Untuk visualisasi perubahan
berdasarkan kelas senyawa, the
Data yang dinormalisasi TPM pada Tabel 5 ditampilkan dalam bentuk grafik radar (Gbr. 1A).
Timbangan pada bagan adalah logaritmik sehingga rentang nilai yang besar (hampir 2 urutan
besarnya) dapat diwakili sambil memastikan bahwa titik data ditempatkan secara proporsional dengan
rasio mereka (misalnya, 200% dan 50% sama-sama berjarak dari 100%) . Sebagai perbandingan, hasil
yang diperoleh ketika normalisasi dilakukan untuk hasil nikotin bukan TPM ditunjukkan pada
Gambar. 1B.
3.2.3. Evolusi produk dari waktu ke waktu
Studi yang dijelaskan dalam publikasi ini dilakukan pada tahun 2003 pada rokok komersial yang
diperoleh pada saat ini (set 1), meskipun studi yang dijelaskan dalam publikasi lain tentang toksisitas
rokok kretek, dapat ditemukan dalam suplemen yang sama dari jurnal ini, lebih baru. Untuk
memastikan bahwa produk komersial yang dicirikan dalam publikasi ini masih sebanding dengan
yang saat ini dipasarkan, kami membandingkan data emisi asap kami dengan salah satu merek yang
diteliti (Sampoerna) dengan yang diperoleh pada tahun 2013 oleh Hanjaya Mandala Sampoerna Tbk.
laboratorium (set 2) dari rokok saat ini dengan nama merek yang sama. Sembilan belas analit asap
yang disajikan dalam publikasi ini telah dikuantifikasi, dan untuk ini datanya dibandingkan dengan
plot x / y.
3.3. Toksisitas in vitro
3.3.1. Sitotoksisitas
Data sitotoksisitas untuk fraksi GVP dan TPM, dinyatakan sebagai 1 / EC50 berdasarkan TPM per
mg, diberikan pada Tabel 6 untuk ketiga rokok kretek serta rokok referensi 2R4F. Sitotoksisitas TPM
berdasarkan TPM per mg adalah serupa di semua rokok, dan tidak ada perbedaan yang diamati secara
statistik signifikan. Perbedaan yang lebih besar ditemukan di antara sampel yang diperoleh dari GVP.
Sebagai penilaian kualitas, pengambilan sampel batch GVP dinilai dengan pengukuran TPM yang
terperangkap dan konsentrasi akrolein yang terperangkap dalam larutan buffer sampel. Pengambilan
sampel ditemukan dapat direproduksi (SD di bawah 5% dari rata-rata).
Yang lebih relevan untuk didiskusikan adalah data yang dinyatakan sebagai persentase dari data
sitotoksisitas rokok 2R4F referensi. Dalam hal ini, rasio dihitung menggunakan penentuan 2R4F yang
diperoleh dalam kelompok analitis yang sama dengan rokok kretek yang diteliti. Sitotoksisitas fraksi
GVP dan TPM dari MS dari ketiga rokok kretek ditunjukkan pada Gambar. 3, dinyatakan sebagai
persentase dari sitotoksisitas 2R4F.