Kepada Yth :

Rencana Baca : Tugas Pendahuluan

Tempat/Waktu :

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATHOGRAPHY

(HPLC)

Anton Triyadi, Martina, Yuyun Widaningsih

Program Studi Ilmu Patologi Klinik FKUH–BLU RS dr.Wahidin Sudirohusodo Makassar

I. Latar Belakang
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk
bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel
diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan fasa diam
yang juga bisa berupa zat cair ataupun zat padat. Penemu Kromatografi adalah
Tswett pada tahun 1903, mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun
dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kalsium sulfat (CaSO4). lstilah
kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk menggambarkan daerah-daerah
berwarna yang bergerak kebawah kolom. D.T. Day juga menggunakan
kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah
yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses
kromatografi. 1
Kromatografi cair dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas
berdiameter besar pada dasarnya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis
lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Akhir tahun
1960 an semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi
cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Performa Tinggi
telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam instrumentasi
dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk
mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan
pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Saat ini dengan teknik yang sudah
matang dan dengan cepat High Performance Liquid Chromatography
1,2
mencapai suatu keadaan yang setara dengan kromatografi gas.

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 1

 II. Pengertian HPLC
High Performance Liquid Chromatography merupakan metode non
destruktif, dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif.
HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan lanjutan dari
kromatografi kolom. Prinsip kromatografi kolom adalah komponen akan
dipisahkan antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam akan
menahan komponen campuran sedangkan fasa gerak akan melarutkan zat
komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fasa diam akan
tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fasa gerak akan
bergerak lebih cepat.
Selain pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh
gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi
sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan
komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan
yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu
dalam suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan,
bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. 1,2,3

III. Jenis- Jenis HPLC1-7

HPLC dapat dibedakan jenisnya berdasarkan perbedaan fasa gerak dan
fasa diam yang digunakan. Perbedaan ini menyebabkan karakteristik sampel
yang dapat dianalisis serta preparasi yang diperlukan berbeda pula.

A. HPLC Fasa Normal (Normal Phase HPLC)

Pemisahan komponen sampel pada fasa normal dan fasa terbalik
dilakukan berdasarkan polaritas. Jenis HPLC ini fasa diamnya bersifat polar
dan fasa geraknya bersifat non polar. Komponen sampel yang bersifat lebih
polar akan berinteraksi lebih kuat dengan fasa diam (polar) sehingga
membutuhkan waktu lebih lama untuk melewati kolom dibandingkan dengan
komponen sampel yang bersifat kurang polar.

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 2

 Gambar 1. HPLC Fasa Normal:
Senyawa polar akan melewati kolom lebih lama dibandingkan
dengan senyawa non polar. (Sumber gambar: MrSimpleScience)

Fasa diam yang digunakan biasanya berisi silika murni atau gugus senyawa
organik seperti amino atau siano yang terikat pada basis silika. Sedangkan
fasa geraknya biasanya merupakan senyawa non polar seperti heksana atau
heptana yang sedikit dicampur dengan senyawa polar seperti metanol, etanol,
ataupun isopropanol.

Gambar2. Kolom fasa normal berisi silika.

(Sumber gambar: thermofisher.com)

B. HPLC Fasa Terbalik (Reverse Phase HPLC)

Sesuai namanya jenis HPLC ini merupakan kebalikan dari HPLC Fasa
Normal. Jenis HPLC ini fasa diam yang digunakan bersifat non-polar dan fasa
geraknya bersifat polar. Pemisahan terjadi karena komponen sampel yang
bersifat kurang polar akan melewati kolom lebih lama dibandingkan
komponen sampel yang bersifat lebih polar.

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 3

 Gambar 3. HPLC Fasa Terbalik:
Senyawa non polar akan melewati kolom lebih lama
dibandingkan dengan senyawa polar (Sumber gambar: MrSimpleScience)

Fasa diam yang digunakan pada fasa ini biasanya merupakan hidrokarbon alkil
non polar seperti rantai C-8 atau C-18 yang terikat pada basis silika. Kolom C18
atau Oktadesil Silika (ODS) merupakan jenis yang paling populer digunakan
dalam HPLC. Fasa gerak yang kerap digunakan pada fasa terbalik adalah
campuran air dengan pelarut polar lain seperti metanol, asetonitril, atau
tetrahidrofuran.

Gambar 4.. Kolom fasa terbalik berisi C18 yang terikat pada silika
(Sumber gambar: labsatu.com)

C. HPLC Eksklusi Ukuran (Size-exclusion HPLC)

Jenis HPLC ini, pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran
molekul masing-masing komponen sampel. Kolom yang digunakan
berisikan packing material yang memiliki ukuran pori yang sudah diatur.
Komponen sampel dengan ukuran molekul yang lebih kecil akan terserap
masuk ke dalam pori packing material sehingga membutuhkan waktu yang
Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 4
 lebih lama untuk melewati kolom dibanding dengan komponen dengan ukuran
molekul yang besar.

Gambar 5. HPLC Eksklusi Ukuran:

Molekul yang lebih kecil akan terperangkap masuk sehingga melewati kolom lebih lama
(Sumber gambar: gelifesciences)

Gambar 6. Kolom eksklusi ukuran dengan ukuran pori 300Å

(Sumber gambar: thermofisher.com)

D. HPLC Pertukaran Ion (Ion Exchange HPLC)

Jenis HPLC ini digunakan untuk sampel yang bersifat ionik atau dapat
diubah menjadi ionik. Fasa diamnya memiliki permukaan bermuatan ionik yang
berlawanan dengan sampel. Semakin kuat muatan komponen sampelnya, maka
komponen tersebut akan tertarik pada permukaan fasa diam sehingga akan
membutuhkan waktu yang lebih lama untuk melewatinya.

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 5

 Gambar 7. Kolom pertukaran ion dengan Polyethyleneimine sebagai fasa diam
(Sumber gambar: thermofisher.com)

IV. Prinsip Dasar HPLC

HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk mengukur sampel. Dalam
kromatografi, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut
terjadi saat sampel bergerak melewati fasa diam (dapat berupa zat padat atau
cair) karena terbawa oleh fasa gerak (dapat berupa zat cair atau gas).

Gambar 8. Prinsip Dasar Kromatografi

(Sumber gambar: labsatu.com)

Beragam komponen dalam sampel akan terpisah berdasarkan perbedaan

afinitasnya terhadap fasa diam. Komponen yang dapat berinteraksi secara kuat
dengan fasa diam akan bergerak lebih lambat sehingga dapat terpisah dari
komponen lain dengan interaksi yang lemah.2-7

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 6

V. Instrumen HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fasa
gerak (Reservoir) , pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi),
kolom, detektor, wadah penampung buangan fasa gerak, dan suatu komputer
atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi
cair dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

. Gambar 9. Diagram Skematik HPLC

(Sumber gambar: labsatu.com)

Diagram di atas menunjukkan komponen utama yang terdapat pada HPLC.

Larutan sampel diinjeksikan melalui injektor (3) dan terbawa oleh fasa gerak
(1) melewati fasa diam pada kolom (5), kemudian hasilnya dibaca oleh
detektor (6) dan ditampilkan pada pengolah data (7) sebagai kromatogram.

1. Fasa Gerak dan Reservoir Pelarut

Fasa gerak pada HPLC harus menggunakan pelarut dengan kemurnian
sangat tinggi. Idealnya, pelarut khusus yang memang sudah memenuhi
standard untuk HPLC dipergunakan untuk hasil yang lebih akurat.
Reservoir pelarut merupakan wadah penyimpanan fasa gerak, biasanya
berbentuk botol kaca dengan selang penghubung. 2-7

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 7

 Gambar 10. Kiri: Methanol khusus HPLC (Sumber gambar: labsatu.com)
Kanan: Reservoir yang terhubung ke pompa (Sumber gambar: lab-training.com)

2. Pompa
Seperti yang sudah disebutkan sebelumnya, pompa yang digunakan dalam
HPLC haruslah pompa bertekanan tinggi agar dapat mendorong fasa gerak
dalam Reservoir menuju kolom fasa diam dan melewati detektor. Tekanan
yang digunakan beragam tergantung dari dimensi kolom, ukuran partikel
fasa diam, serta laju alir dan komposisi dari fasa gerak yang akan
dipakai. 2-5

3. Injektor
Injektor merupakan tempat masuknya sampel ke dalam sistem HPLC.
Proses injeksi dapat dilakukan secara manual dengan syringe atau dengan
menggunakan sistem injeksi otomatis. Injektor pada HPLC harus dapat
menampung sampel cairan dalam kisaran volume 0.1-100 mL. 2-7

Gambar 11. Sistem injeksi otomatis

(Sumber gambar: Royal Society of Chemistry)

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 8

 4. Sampel
Sampel yang dapat dianalisis menggunakan HPLC harus bersifat bening
dan tidak ada endapan, untuk itu preparasi sampel diperlukan sebelum
dianalisis misalnya dengan melakukan filtrasi sampel. Preparasi lain dapat
pula dilakukan sesuai kebutuhan seperti mengatur konsentrasi sampel,
desalting, dan lain-lain. 2-7

5. Kolom HPLC
Aktivitas utama dalam HPLC terjadi di dalam kolom sebagai fasa diam
terjadi pemisahan komponen sampel yang kemudian dapat dihitung waktu
retensi masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensi adalah
waktu yang dibutuhkan oleh senyawa komponen sampel untuk melewati
kolom menuju detektor. Waktu retensi dihitung dari saat sampel
diinjeksikan hingga puncak pembacaan maksimum pada detektor.
Senyawa yang berbeda akan memiliki waktu yang berbeda sehingga
masing-masing konsentrasinya dapat dihitung.
Kolom HPLC tersedia dalam panjang serta packing material yang
berbeda-beda tergantung dari jenis HPLC yang hendak
digunakan. Packing material merupakan material yang diisikan ke dalam
kolom sebagai fasa diam. Packing material yang sering digunakan
biasanya yang berbasis silika, baik silika yang tidak dimodifikasi maupun
yang telah termodifikasi seperti oktadesil silika (ODS) yang memiliki
lapisan C18. 2-7

6. Detektor
Detektor berfungsi untuk mendeteksi keberadaan komponen yang telah
melewati kolom dan memberikan sinyal elektronik pada pengolah data.
Terdapat beberapa jenis detektor HPLC tergantung dari karakteristik yang
hendak dibaca. Misalnya pada detektor jenis UV-vis, maka karakteristik
yang dibaca oleh detektor adalah absorbansinya. Detektor jenis lain yang
bisa digunakan adalah detektor indeks bias, fluoresensi, serta detektor
elektrokimia. 2-6

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 9

 7. Pengolah Data
Pengolah data menampilkan output visual hasil analisis yang terbaca oleh
detektor dalam bentuk kromatogram. Kromatogram menggambarkan
jumlah komponen pada sampel dilihat dari jumlah puncak (peak) yang
dihasilkan. Konsentrasi komponen yang hendak dianalisis dapat dihitung
dengan membandingkan luas area peak komponen dengan luas
area peak serta konsentrasi standar. 2-6

Gambar 12. Contoh kromatogram

(Sumber gambar: lab-training.com)

VI. Aplikasi HPLC

HPLC sering digunakan dalam industri farmasi atau laboratorium
farmasi sebagai metode analisis sampel dan HPLC juga memiliki kegunaan
dalam bidang lain seperti pada industri makanan dan minuman, analisis
lingkungan, forensik, serta pada tes klinis. Dalam bidang farmasi HPLC dapat
digunakan untuk menguji stabilitas obat, uji disolusi, serta quality control.
Sedangkan pada industri makanan dan minuman, HPLC dapat digunakan pada
beragam analisis seperti untuk analisis keberadaan senyawa polisiklik, analisis
kadar gula dan pengawet, atau pengukuran kualitas minuman ringan dan air.
Bidang lain, HPLC dapat pula digunakan untuk analisis antibiotik dalam
darah, analisis kokain pada urin, dan sebagainya.7

VII. Ringkasan
High Performance Liquid Chromatography merupakan metode yang
dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. HPLC
secara mendasar merupakan sebuah perkembangan lanjutan dari kromatografi

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 10

 kolom dan dapat dibedakan jenisnya berdasarkan perbedaan fasa gerak dan
fasa diam yang digunakan. HPLC menggunakan prinsip kromatografi untuk
mengukur sampel, analisis dilakukan dengan cara memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan struktur ataupun komposisinya. Pemisahan tersebut
terjadi saat sampel bergerak melewati fasa diam (dapat berupa zat padat atau
cair) karena terbawa oleh fasa gerak (dapat berupa zat cair atau gas).
High Performance Liquid Chromatography sering digunakan dalam
industri farmasi atau laboratorium farmasi, industri makanan dan minuman
dan bidang lainnya dapat pula digunakan untuk analisis antibiotik dalam darah
dan analisis kokain pada urin

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 11

 DAFTAR PUSTAKA

1. Settle, F (Editor), Handbook of Instrumental Techniques for Analytical

Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA, 1997
2. Meyer, F.R., Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4thEd.,
John Wiley & Sons, New York, 2004
3. Kealey, D and Haines, P.J., Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS
Scientific Publishers Limited, New York, 2002
4. Lindsay, S., High performance liquid chrotomagraphy.second edition, John
Wiley &Sons, Chischer, New York, Brisbane, Toronto, Singapore, 1992
5. HPLC: Isocratic or Gradient Elution and Assessment of Linearity In
Analytical Methods. Available from:
http://www.sciensage.info/journal/1339603411JASR_0803122.pdf. Accesed
on February 1, 2017
HPLC - Normal Phase vs Reverse Phase HPLC – Animated. Available from :
https://www.youtube.com/watch?v=MLoitPJQH3g. Accesed on February 10,
2017
Mengenal HPLC dan dan aplikasinya. Available from:
https://news.labsatu.com/jenis-jenis-HPLC-dan-aplikasinya-dalam-analisis.
Accesed on March 5, 2017

Tugas Pendahuluan | HPLC / April 2017 12