PEWARNAAN BTA

A. TUJUAN
a. Tujuan Umum
1. Untuk mengetahui prosedur kerja dan sifat pewarnaan BTA
b. Tujuan Khusus
1. Dapat melakukan pewarnaan BTA (cat ZN) dengan baik
2. Dapat mengidentifikan bentuk, warna dan sifat BTA setelah dilakukan pengecatan

B. METODE
Direct preparat (preparat yang dibuat dan diamati secara langsung).

C. DASAR TEORI
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat
yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk
mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode
pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan.

Bakteri tahan asam merupakan bakteri yang kandungan lemaknya sangat tebal
sehingga tidak bisa diwarnai dengan reaksi pewarnaan biasa, tetapi harus dengan
pewarnaan tahan asam. Kelompok bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA) karena
dapat mempertahankan zat warna pertama sewaktu dicuci dengan larutan pemucat.
Golongan bakteri ini biasanya bersifat patogen pada manusia contohnya adalah
Mycobacterium tuberculosis. Bakteri Mycobacterium tuberculosis dapat diisolasi dari
sputum penderita TBC. Reaksi hasil pewarnaannya jika positif terdapat bakteri TBC
berwarna merah. Selain menyerang manusia juga menyerang hewan seperti marmut, dan
kera. Penularannya dapat melalui udara yang masuk ke saluran pernafasan (Pelczar dan
Chan, 1988).
 Bakteri tahan asam adalah jenis bakteri yang tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan anilin biasa kecuali dengan menggunakan fenol dan dengan pemanasan.
Bakteri ini memilki dinding sel berlilin karena mengandung sejumlah besar materi
lipoidal oleh karena itu bakteri ini hanya dapat diwarnai dengan pewarnaan BTA (Acid-
Fast Stain). Dinding sel hidrofobik dan impermeabel terhadap pewarnaan dan bahan
kimia lain pada cairan atau larutan encer. Ketika proses pewarnaan, bakteri tahan asam
ini melawan dekolorisasi dengan asam sehingga bakteri tersebut disebut bakteri tahan
asam (Ball, 1997).

Mycobacterium tuberculosis berbentuk batang langsing, lurus atau berbentuk

filamen. Bakteri ini bersifat aerobik, tidak membentuk spora, non motil, tahan asam, dan
merupakan bakteri gram positif. Namun, ketika Mycobacteria diberi warna oleh
pewarnaan gram, maka warna tersebut tidak dapat dihilangkan dengan asam. Oleh karena
itu, maka mycobacteria disebut sebagai Basil Tahan Asam atau BTA. Beberapa
mikroorganisme lain yang juga memiliki sifat tahan asam, yaitu spesies Nicardia,
Rhodococcus, Legionella micdadei, dan protozoa Isospora dan Cryptosporidium. Pada
dinding sel mycobacteria, lemak berhubungan dengan arabinogalaktan dan peptidoglikan
di bawahnya. Struktur ini menurunkan permeabilitas dinding sel, sehingga mengurangi
efektivitas dari antibiotik. Lipoarabinomannan adalah suatu molekul lain dalam dinding
sel mycobacteria, berperan dalam interaksi antara inang dan patogen, menjadikan M.
tuberculosis dapat bertahan hidup di dalam makrofaga. Mikobakteria dapat tumbuh lebih
cepat pada pH 6 dan 8 dengan pH optimum sekitar 6.5 - 6.8 untuk tipe pathogen. Sel
mikobakteria terdiri dari tiga lapisan penting yaitu lipid, protein, dan polisakarida
(Thomas, 1999).

Mycobacterium tuberculosis termasuk gram positif, berbentuk batang panjang atau

pendek, tidak berspora, tidak berkapsul, pertumbuhan sangat lambat (2-8 minggu), suhu
optimal 37-380C yang merupakan suhu normal manusia. Pertumbuhannya membutuhkan
tambahan makanan seperti darah, egg yolk, serum, dan bahan kimia tertentu. Dalam
jaringan, basil tuberkel adalah bakteri batang lurus dengan ukuran sekitar 0,4 – 3 μm.
Pada media buatan, bentuk kokoid dan filamentous tampak bervariasi dari satu spesies ke
spesies lain. Segera setelah diwarnai dengan pencelupan dasar mereka tidak dapat
didekolorisasi oleh alkohol, tanpa memperhatikan pengobatan dengan iodine. Basil
tuberkel secara umum dapat diwarnai dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen. Media untuk
membiakan mikobakteria adalah media nonselektif dan media selektif. Media selektif
berisi antibiotik untuk mencegah pertumbuhan kontaminan bakteri dan fungi yang
berlebihan. Ada tiga formulasi umum yang dapat digunakan untuk kedua media
nonselektif dan selektif, yaitu media agar semisintetik (middlebrook 7H10 dan 7H11),
media telur inspisasi (Lowenstein-jensen), media kaldu (broth media) (Jawetz et
al., 2001).

Mikobakteria merupakan aerobik obligat yang memperoleh energi dari oksidasi

beberapa senyawa sederhana. Penambahan CO2 meningkatkan pertumbuhan. Tidak ada
aktivitas biokimia yang menandai. Dan kecepatan pertumbuhan lebih rendah dari pada
sebagian besar bakteri. Waktu untuk menggandakan basil tuberkel sekitar 18 jam, bentuk
saprofit cenderung tumbuh lebih cepat, poliferasi terjadi pada temperatur 22-23˚C, untuk
menghasilkan pigmen yang lebih banyak dan mengurangi bentuk ”cepat asam” daripada
bentuk patogenik. Mikobakteria cenderung lebih resisten terhadap agen kimia daripada
bakteri lain karena sifat hidrofobik permukaan sel dan pertumbuhannya. Basil tuberkel
reisten terhadap kekeringan dan bertahan hidup selama periode waktu yang lama dalam
sputum kering. Variasi dapat terjadi dalam koloni, pigmentasi, virulensi, temperatur
petumbuhan yang optimal dan beberapa tanda pertumbuhan atau seluler lainnya (Fardiaz,
1992).

Bakteri tahan asam dapat diamati dengan teknik pewarnaan Ziehl Neelson, Kinyoun
Gabber, dan Fluorochrom. Pengambilan sputum (sekret paru-paru atau ludah) untuk
analisis tuberculosis dapat dilakukan setiap saat dikenal ada 3 jenis sputum:

Sputum pagi : sputum yang dikeluarkan oleh penderita pada saat bangun pagi.

Spot sputum : sputum yang dikeluarkan pada saat itu.

Collection sputum: sputum yang keluar dan ditampung selama 24 jam

Sputum yang telah diperoleh dapat disimpan dalam lemari es selama satu minggu.

Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen, yaitu dengan menggunakan zat warna carbol

fuchsin 0,3 %, asam alkohol 3 %, dan methylen blue 0,3%. Pada pemberian warna
pertama, yaitu carbol fuchsin, BTA bersifat mempertahankannya. Carbol fuchsin
merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5 %. Larutan ini memberikan
warna merah pada sediaan dahak. Fenol digunakan sebagai pelarut untuk membantu
pemasukan zat warna ke dalam sel bakteri sewaktu proses pemanasan. Fungsi pemanasan
untuk melebarkan pori-pori lemak BTA sehingga carbol fuchsin dapat masuk sewaktu
BTA dicuci dengan larutan pemucat, yaitu asam alkohol, maka zat warna pertama tidak
mudah dilunturkan. Bakteri kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menutup pori-
pori dan menghentikan pemucatan. BTA akan terlihat berwarna merah, sedangkan bakteri
yang tidak tahan asam akan melarutkan carbol fuchsin dengan cepat sehingga sel bakteri
tidak berwarna. Setelah penambahan zat warna kedua yaitu methylen blue, bakteri tidak
tahan asam akan berwarna biru (Lay, 1994).

Menurut Entjang (2003), pada pewarnaan bakteri dengan metode Ziehl-Neelsen

dapat menggolongkan bakteri menjadi dua, yaitu :
1. Bakteri yang berwarna merah dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri
tahan asam (acid fast).
2. Bakteri yang berwarna biru dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen disebut bakteri tidak
tahan asam (non acid fast).
Metode Ziehl-Neelsen digunakan karena cukup sederhana dan mempunyai
sensitivitas serta spesifitas yang cukup tinggi. Spesifitas dan sensitivitas yang tinggi
sebenarnya dimiliki oleh metode fluorokrom. Bakteri yang terwarnai menunjukkan warna
yang kontras dengan lingkungannya dan tidak membutuhkan perbesaran sampai 1000x
sehingga bisa mempercepat waktu. Akan tetapi, alat yang digunakan tidak ada yaitu
mikroskop fluorescens (Kurniawati et al., 2005).

Larutan kimia yang digunakan adalah alkohol asam 3% , carbol fuchsin 0,3%, serta
methylen blue 0,3% yang masing-masing mempunyai fungsi antara lain asam alkohol
digunakan sebagai peluntur, carbol fuchsin mempunyai fungsi membuka lapisan lilin
agar menjadi lunak sehingga cat dapat menembus masuk ke dalam sel bakteri M.
 tuberculosis. Methylen blue berfungsi sebagai cat lawan dan pada pemberian methylen
blue pada bakteri akan tetap berwarna merah dengan latar belakang biru atau hijau
(Jutono dkk., 1980).

Standar yang terdapat dalam IUATLD (International Union Against Tuberculosis

Lung Disease) seperti berikut :

- Negatif : Tidak dijumpai adanya BTA

- Positif : Ditemukan 1-9 BTA/100 LP
- Positif 1 : Ditemukan 10-99 BTA/100 LP
- Positif 2 : Ditemukan 1-10 BTA/1 LP
- Positif 3 : Ditemukan lebih dari 10 BTA/1 LP

D. ALAT DAN BAHAN

a. Alat
1. Lidi/ Ose
2. Api Spiritus
3. Object Glass
4. Mikroskop Binokuler
5. Rak Tabung
6. Label
b. Bahan
1. Sputum (sampel sputum Ayu Dian Puspita 1 dan 2)
2. Sampel BTA (1, 2 dan 3)
3. Oil Imersi
4. Lens Paper
5. Tissue
c. Reagensia / cat
1. Carbol Fuchsin 0,3%
2. Asam Alkohol 3%
3. Methylene Blue
4. Aquadest
E. CARA KERJA
a. Pembuatan Apusan
1. Digunakan semua APD dengan baik, benar dan lengkap.
2. Disiapkan semua alat-alat dan bahan-bahan yang akan digunakan.
3. Dipastikan semua alat dan bahan siap untuk digunakan.
4. Diambil lidi/ose lalu dipanaskan dengan api Bunsen.
5. Dibuka tutup wadah sampel yang berisi sampel sputum.
6. Dimasukkan lidi/ose secara perlahan.
7. Dibakar lidi/ose, kemudian diletakkan dirak ose.
8. Dikeringkan apusan pada object glass dengan api Bunsen atau difiksasi.
9. Dilakukan fiksasi dengan cara mengelilingi kaca preparat pada api Bunsen
sebanyak tiga kali.
b. Pewarnaan
1. diteteskan Zat ZN A (Carbol Fuchsin) pada kaca preparat kemudian dipanaskan
sampai menguap (jangan sampai mendiih), ditunggu 5 menit lalu dibilas dengan
aquadest.
2. Diteteskan ZN B (Asam Alkohol) pada kaca preparat, ditunggu hingga ½ menit
lalu dibilas dengan aquadest.
3. Diteteskan ZN C (Methylene Blue), ditunggu hingga 1 menit lalu dibilas dengan
aquadest.
4. Dikeringkan dengan kertas tissue.
c. Pembacaan Hasil Pengamatan
1. Preparat yang sudah jadi diamati dibawah mikroskop dengan setting pembesaran
objektif 10 kali untuk mencari lapang pandang, kemudian dilanjutkan dengan
perbesaran objektif 100 kali dengan penambahan oil imersi untuk memperjelas
objek yang diamati.
2. Diamati bentuk dan warna bakteri, bakteri tahan asam akan berwarna merah dan
bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru.
F. HASIL PENGAMATAN

G. PEMBAHASAN
Pembuatan dan pewarnaan Bakteri Tahan Asam (BTA)

Pada praktikum kali ini dilakukan pengecetan Bakteri Tahan Asam (BTA) yang
menggunakan tiga jenis cat Ziehl-Neelson (ZN) yaitu carbol fuchsin 0,3 %, asam alkohol
3 % dan methylene blue 3 %. Dalam pengecatan ini digunakan sample sputum.

Sebelum dibuat apusan, objek glass difiksasi untuk menghilangkan lemak yang
menempel pada permukaanya dan untuk menghilangkan kontaminan lain yang ada pada
objek glass. Apusan yang dibuat tidak boleh terlalu tebal agar bakteri tidak bertumpuk-
tumpuk sehingga proses pengamatan bentuk sel bakteri menjadi lebih mudah, tetapi
apusan yang dibuat juga tidak boleh terlalu tipis.

Pewarnaan BTA ini dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ziehl Neelson yng
menggunakan 3 jenis warna sebagai berikut :

1. Pewarnaan dengan Carbol Fuchsin 3 %

Pewarnaan pertama ini, akan sulit menembus dinding dari Bakteri tahan asam,
sehingga dilakukan pemanasan untuk memuaikan dinding sel bakteri tersebut sehingga
warna carbol fuchsin ini mampu diserap oleh sel-sel bakteri. Namun perlu diperhatikan,
pemanasan dilalukan jangan sampai mendidih cukup samapai menguap agar sel-sel
bakteri tersebut tidak rusak.

2. Penambahan larutan asam alkohol 0,3 %

Penambahan alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan zat warna

(decolorization) pada sel bakteri (mikroorganisme). Saat sel-sel bakteri sudah mampu
menyerap warna carbol fuchsin maka dinding sel tersebut akan kembali tertutup dalam
pada suhu semula. Sehingga sebelum dilakukan penambahan asam alkohol ditunggu
samapai 5 menit. Saat penambahan asam alkohol ini, maka bakteri yang bukan BTA akan
dilunturkan kembali warna carbol fuchsin tersebut karena tidak mampu mengikat kuat
seperti halnya bakteri BTA.

3. Pemberian zat warna Methylene Blue

Terakhir dilakukan penambahan Methylene blue. Methylene Blue merupakan

pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan asam alkohol.

Zat warna methylene blue masuk ke dalam sel bakteri non BTA yang permeabilitas
dinding selnya membesar akibat lapisan lipid pada bakteri non BTA terekstraksi oleh
asam alkohol, sehingga menyebabkan sel bakteri non BTA tersebut menjadi berwarna
biru. Pada bakteri BTA dinding selnya sudah terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori
– pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga zat warna
methylene blue tidak dapat masuk sehingga sel bakteri BTA berwarna merah.

Waktu yang dipelukan untuk menunggu setiap warna juga berbeda. Hal ini dilakukan
untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat pembacaan preparat pada mikroskop.

1. Menunggu selama 5 menit setelah pewarnaan dengan warna carbol fuchsin dan
dilakukan pemanasan bertujuan agar cat ini dapat diserap dan melekat sempurna pada
dinding bakteri dan dinding selnya kembali seperti semula setelah dilakukan pemanasan.
2. Warna dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa.
3. Menunggu selama 1 menit setelah penambahan pewarna methylene
blue bertujuan agar cat ini dapat diserap sempurna pada dinding bakteri non BTA
sehingga ada perbedaan warna antara bakteri BTA dan Non BTA.

Setelah pewarnaan dan menunggu selama waktu diatas, dilakukan pembilasan dengan
aquadest yang bertujuan untuk membilas zat warna yang berlebih sebelum dilanjutkan
dengan pewarnaan berikutnya.

Hal yang perlu diperhatikan

Fase yang paling kritis adalah dekolorisasi yang mengakibatkan warna yang tidak
terikat oleh sel bakteri lepas dari sel, pemberian asam alkohol jangan sampai berlebih
karena akan menyebabkan overdekolorization sehingga sel BTA hampir sama dengan
Non BTA yang menyebabkan sulit membedakannya, tetapi jangan juga terlalu sedikit
dalam memberikan alkohol (underdecolorization) karena tidak akan melunturkan warna
secara sempurna sehingga sel Non BTA bisa saja berwrna ungu mendekati warna sel
BTA.

Kaca obyek harus selalu dicuci dengan aquades diantara penambahan pewarna untuk
menghilangkan kelebihan warna dan mempersiapkan pewarna berikutnya.

Faktor yang membedakan BTA dan Non BTA

Perbedaan mendasar antara bakteri BTA dan non BTA adalah pada komponen
dinding selnya. Dinding sel BTA mengandung lapisan lilin (lapisan lemak) yang sangat
banyak sehingga dalam proses penyrapan warna perlu dilakukan pemanasan untuk
memuaikan dinding sel tersebut sehingga pewarna dapat diserap. Namun dalam dinding
sel bakteri non BTA lapisan lemaknya tidak banyak sehingga untuk melakuka
penyerapan warna tidak perlu dilakukan pemanasan dan pelunturan warna pun sangat
mudah dilakukan saat penambahan asam alkohol.

Pengamatan preparat pewarnaan BTA

Berdasarkan hasil praktikum, diproleh hasil sebagai berikut

 Sampel Awetan I : positif I (1+), karena ditemukan 11 bakteri

dalam 51 lapang pandang
 Sampel Awetan II : positif I (1+), karena ditemukan 13 bakteri
dalam 50 lapang pandang
 Sampel Awetan III : positif I (1+), karena ditemukan 15 bakteri
dalam 52 lapang pandang
 Sampel Sputum Ayu Dian Puspita I : ditemukan 6 bakteri dalam 55 lapang
pandang.
 Sampel Sputum Ayu Dian Puspita II : ditemukan 4 bakteri dalam 60 lapang
pandang
H. KESIMPULAN
1. Pewarnaan BTA dilakukan dengan cara Ziehl-Neelsen yang menggunakan tiga jenis
zat pewarna, yaitu : ZN A (Carbol fuchsin), ZN B (Asam Alkohol) dan ZN C
(Methylene Blue)
2. Tujuan pewarnaan Carbol fuchsin untuk mewarnai sel bakteri. Asam Alkohol untuk
meluruhkan warna Carbol Fuchsin dan Methylene Blue untuk member warna
background.
3. Hasil praktikum menunjukkan semua sampel positif teridentifikasi mengandung
bakteri Mycobacterium tuberculosis dengan hasil :
- Sampel Awetan I (1+)
- Sampel Awetan II (1+)
- Sampel Awetan III (1+)
- Sampel sputum Ayu Dian Puspita I (ditemukan 6 bakteri dalam 55 lapang
pandang)
- Sampel sputum Ayu Dian Puspita II (ditemukan 4 bakteri dalam 60 lapang
pandang)
4. Bakteri yang teridentifikasi adalah Mycobacterium tuberculose (penyakit TB) dengan
bentuk basil berwarna merah. Sifat bakteri ini adalah tidak tahan panas, tetapi dapat
bertahan lama dalam udara bebas.
5. Dalam pewarnaan bahan asam bakteri yang tahan asam dan tidak tahan akan
berwarna merah dan bakteri yang tidak tahan asam akan berwarna biru.

DAFTAR PUSTAKA
Mastra, Nyoman, dkk. 2014. Bakteriologi. Denpasar : Politektnik Kesehatan Denpasar
Jurusan Analis Kesehatan.
Rinda. 2014. Bakteri 1. [Online] http://rindachie.weng.com/menu/labs/bakteri-5.html
(Diakses pada 24 April 2014 pukul 19.20)
Admin. 2014. Mycobacterium tuberculosis. [Online]
http://id.m.wikipedia.org/wiki/mycobacterium.tuberculosis (Diakses pada 24
April 2014.
Lay, B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PT. Raga Grafindo Persada.

Syahrurachman, dkk. 1994. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran Edisi Revisi. Jakarta: UI
Press.

Fitri Nurrahmi. 2012. Pewarnaan Ziehl Neelsen.

Online.http://mediblock.blogspot.com/2012/10/pratktikum-mikrobiologi-1-
pewarnaan.html. Tanggal diakses 20 April 2014

Hendro. 2012. Pewarnaan BTA ( Bakteri Tahan Asam).

Online.http://analisbantul.blogspot.com/2012/09/pewarnaan-bta-bakteri-tahan-
asam.html. Tanggal diakses 20 April 2014